細(xì)胞脹亡的研究進(jìn)展

李祥孟，曾繁浩，倪茂，唐振華，顏汝平

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000)

1 細(xì)胞脹亡的來源和形態(tài)學(xué)特征

“脹 亡”(oncosis) 來 源 于 希 臘 文“ onkos”, 其表示的意思為腫脹(swelling)。在1910 年，vonReckling-hausen 首次描述在缺血死亡之前的骨細(xì)胞出現(xiàn)水分增多而腫脹的現(xiàn)象，后Majno G等[1]將這種細(xì)胞死亡稱之為細(xì)胞脹亡，并認(rèn)為細(xì)胞脹亡不同于細(xì)胞凋亡，凋亡和脹亡僅是細(xì)胞死亡的兩種方式。光鏡下可見脹亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)主要為細(xì)胞體積逐漸增大、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核出現(xiàn)腫脹，核膜、核仁周圍出現(xiàn)染色質(zhì)分離凝集現(xiàn)象，最后常表現(xiàn)為核溶解現(xiàn)象；胞膜逐漸起泡，而液體是膜泡中的主要成分，隨著細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞膜出現(xiàn)崩解，隨即胞內(nèi)容物出現(xiàn)外溢，細(xì)胞呈現(xiàn)自溶樣的改變，同時(shí)周圍常伴有明顯的炎癥反應(yīng)，這個(gè)過程類似于細(xì)胞水樣變性、氣球樣變等一系列形態(tài)學(xué)的改變[2]。

2 細(xì)胞脹亡的分子機(jī)制

細(xì)胞脹亡的分子機(jī)制在龔小紅[2]有關(guān)細(xì)胞脹亡的文章中提到的有“與細(xì)胞膜損傷有關(guān)的分子機(jī)制、與caspase 有關(guān)的分子機(jī)制、與死亡受體有關(guān)的分子機(jī)制、與線粒體有關(guān)的分子機(jī)制、與Bcl-2 家族有關(guān)的機(jī)制”等五個(gè)機(jī)制，其中與線粒體相關(guān)的機(jī)制可進(jìn)一步細(xì)分為線粒體功能失調(diào)導(dǎo)致的ATP含量降低和ATP 耗竭相關(guān)機(jī)制[3]。此以外，水通道蛋白相關(guān)分子機(jī)子也可誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡，在Tsai[4]的實(shí)驗(yàn)中，通過水通道蛋白激動(dòng)劑促使大量的水進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，使癌細(xì)胞發(fā)生不可逆性的腫脹，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生脹亡。

3 細(xì)胞脹亡的檢測方法

為了更好的研究細(xì)胞脹亡在腫瘤治療中的作用機(jī)制，科學(xué)有效的檢測是相關(guān)研究的基礎(chǔ)。經(jīng)過近些年的快速發(fā)展，相關(guān)的檢測方法也越來越全面且精確。(1)用光鏡、時(shí)差顯微鏡觀察檢測，還可以用電鏡[5]、采用細(xì)胞核染料染色的熒光顯微鏡[6]以及與其相結(jié)合的多通道全息顯微鏡觀察法來觀察細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化來檢測。光鏡觀察顧名思義就是利用光學(xué)顯微鏡觀察脹亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，若發(fā)生細(xì)胞脹亡則出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、細(xì)胞質(zhì)空泡化改變等現(xiàn)象；時(shí)差顯微鏡相對(duì)于光鏡的優(yōu)點(diǎn)在于不需要移動(dòng)細(xì)胞，顯微鏡觀察與細(xì)胞培養(yǎng)都在同一個(gè)視野內(nèi)，可以對(duì)所有細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)上的變化進(jìn)行觀察，這樣就更加容易對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究；電鏡可觀察到光鏡、時(shí)差顯微鏡觀察不到的超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)，比如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器以及各個(gè)細(xì)胞器在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)上的變化情況，它是判定細(xì)胞脹亡非常重要的一種手段。由于自身觀察的局限性，電鏡還需在觀察的同時(shí)聯(lián)合其他的檢測手段進(jìn)行相互檢測；熒光顯微鏡觀察是將細(xì)胞核進(jìn)行染料標(biāo)記，從觀察細(xì)胞核形態(tài)，而多通道全息顯微鏡觀察則是在熒光的基礎(chǔ)上同全息顯微鏡相結(jié)合，以便更容易的轉(zhuǎn)換進(jìn)行成像。(2)細(xì)胞發(fā)生凋亡的后期細(xì)胞膜的完整性則被破壞，而細(xì)胞脹亡啟動(dòng)了細(xì)胞脹亡的開關(guān)[7]致細(xì)胞膜通透性增加的同時(shí)細(xì)胞膜完整性則就已被破壞，細(xì)胞膜的損傷可能來自于膜表面Na+-K+泵以及Ca2+泵功能的障礙和膜受體的改變。其機(jī)制主要是缺血性的損害可導(dǎo)致細(xì)胞 Na+-K+-ATP 酶活性降低,Na+經(jīng)過氧化應(yīng)激激活非選擇性陰離子通道從而進(jìn)入細(xì)胞引起細(xì)胞脹亡[8]，通過獲得細(xì)胞懸液之后, 觀察細(xì)胞膜的通透性是否缺陷可判斷細(xì)胞是否脹亡。因此碘化丙啶作細(xì)胞核染料染色的碘化丙啶吸收試驗(yàn)法、細(xì)胞內(nèi)容物泄漏試驗(yàn)[9]、7-ADD 染色法[10]等。這些染料通過不完整的細(xì)胞膜,與胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合, 細(xì)胞膜的完整性可通過熒光強(qiáng)度檢測即可得出；乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)[11]則是細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶通過有功能不足的細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，釋放量一般同細(xì)胞膜受損程度相關(guān)，所以可以通過檢測乳酸脫氫酶釋放量來反映細(xì)胞膜受損程度，從而有助于對(duì)細(xì)胞脹亡的判定[11]。(3)線粒體膜電位檢測[9]，由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子或其他離子分布不均而導(dǎo)致膜電位的形成，有研究報(bào)道細(xì)胞脹亡與細(xì)胞線粒體膜電位的下降有關(guān)[12]；但是細(xì)胞線粒體膜電位下降的現(xiàn)象也存在于其他細(xì)胞死亡方式之中，故對(duì)于細(xì)胞脹亡而言，通過檢測細(xì)胞線粒體膜電位來判斷細(xì)胞脹亡不具有特異性，還需其他有效地方法進(jìn)行輔助檢測。(4)細(xì)胞三磷酸腺苷水平檢測[13]，細(xì)胞脹亡不需要三磷酸腺苷的介導(dǎo)，而細(xì)胞凋亡則是需要消耗三磷酸腺苷，因此細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷含量的檢測對(duì)于鑒別細(xì)胞脹亡或者細(xì)胞凋亡具有非常重要的作用。但是針對(duì)特異性來說，細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷含量的檢測對(duì)于細(xì)胞脹亡而言也無特別強(qiáng)的特異性，還需要其他的方法進(jìn)行輔助檢測。(5)細(xì)胞ROS 水平檢測[14]，有文獻(xiàn)報(bào)道ROS 的過量生成與細(xì)胞發(fā)生脹亡有關(guān)，其原理是由ROS 介導(dǎo)的細(xì)胞脹亡[14]；但其特異性不高，同樣需要結(jié)合其他輔助檢查。(6)實(shí)時(shí)流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)力學(xué)分析法[15]就是用用染料分別標(biāo)記檢測細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞膜電位，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。這種檢測可將凋亡細(xì)胞與脹亡細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。(7)通過Western blot 實(shí)驗(yàn)來檢測porimin 和calpain 蛋白的表達(dá)情況的相關(guān)檢測方法[16]，porimin 也被稱為促脹亡受體。通過對(duì)能表達(dá)porimin 蛋白的進(jìn)行檢測這一方法，從而判定細(xì)胞脹亡具有重要的作用，同時(shí)calpain 在細(xì)胞脹亡方面起著非常重要的作用，所以一般檢測porimin時(shí)也同時(shí)檢測calpain 蛋白。以上方法有的是比較成熟準(zhǔn)確的檢測方法，而有的方法其特異性則較低，如7-ADD 染色法、光鏡觀察法、線粒體膜電位檢測等?？偠灾?，細(xì)胞脹亡的檢測是以細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢查為基礎(chǔ)進(jìn)行的過程，其他檢測方法都基于形態(tài)學(xué)上展開，作為輔助檢查手段。

4 腫瘤性疾病是威脅人類長壽的主要障礙之一

4.1 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人口老齡化越發(fā)嚴(yán)重和人口的迅速增長，伴隨而來的是全世界的腫瘤發(fā)病率和腫瘤死亡率也迅速增長。據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，非傳染性疾病(NCD)現(xiàn)在是造成全球大多數(shù)死亡的原因，而腫瘤也將成為21世紀(jì)世界各國人民是否長壽的主要原因和面對(duì)的挑戰(zhàn)性問題。依據(jù)世界衛(wèi)生組織2015 年的預(yù)估，在172 個(gè)國家中腫瘤將是其中91 個(gè)國家70 歲以前死亡的第一或第二大原因，而在其他22 個(gè)國家中因腫瘤死亡的原因排名第三或者第四[17]。對(duì)此，積極探索癌癥的治療方法將有助于提高人類的生活質(zhì)量以及為人類的長壽再助力助跑。

4.2 以細(xì)胞脹亡的方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡

在腫瘤的治療中也有許多通過使腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞脹亡的死亡方式來達(dá)到腫瘤的治療作用[4]。也EnAd(Enadenotucirev) 是從一個(gè)腺病毒血清型庫中通過生物選擇分離出的一種嵌合體B 組腺病毒，被證明能夠誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞等癌細(xì)胞通過以細(xì)胞脹亡的方式裂解死亡，起到癌治療的作用效果[18]。除此以外，細(xì)胞脹亡也參與了諸如肺、腎、肝[19]等癌細(xì)胞以及多種耐藥癌細(xì)胞[20]、乳腺癌[21,22]、胃癌[23]、腦膠質(zhì)瘤[24]、選擇性殺傷胚胎干細(xì)胞預(yù)防畸胎瘤的發(fā)生[6]等癌細(xì)胞的死亡，進(jìn)而達(dá)到殺傷癌細(xì)胞，為癌癥的治療尤其是耐藥癌的治療提供了一種有效的治療方法。其作用機(jī)制主要為線粒體功能失調(diào)導(dǎo)致的ATP 含量降低和ATP 耗竭以及在水通道蛋白激動(dòng)劑作用下促使大量的水進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，使癌細(xì)胞發(fā)生不可逆性的腫脹，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生脹亡。

5 總結(jié)與展望

隨著對(duì)細(xì)胞脹亡的不斷深入研究，越來越多的研究表明，對(duì)目前可用的治療方法有抵抗力的癌細(xì)胞，誘導(dǎo)其以脹亡的方式死亡是一種有效的治療方法。在眾多研究中，“病毒療法”誘導(dǎo)癌細(xì)胞以脹亡的方式死亡就是一種非常具有潛力和優(yōu)勢的方法。利用腺病毒(如EnAd 腺病毒)誘導(dǎo)細(xì)胞以腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞脹亡的方式死亡達(dá)到治療腫瘤的效果不僅為腫瘤的治療提供了一個(gè)非傳統(tǒng)的治療方法，而且還為“溶瘤疫苗”概念及研究奠定了機(jī)制基礎(chǔ)。但目前該方法還僅停留在臨床前研究階段，臨床相關(guān)性尚未得到驗(yàn)證，有諸多因素限制其在臨床試驗(yàn)的應(yīng)用。如：(1)病毒細(xì)胞毒性的確切機(jī)制可能因細(xì)胞類型而異，導(dǎo)致其產(chǎn)生的治療效果也有可能因細(xì)胞類型而產(chǎn)生差異;(2)EnAd 對(duì)人細(xì)胞的特異性嚴(yán)重限制了用于免疫原性臨床前檢測的動(dòng)物模型。建立動(dòng)物模型的昂貴花銷;(3)細(xì)胞生命周期短的腺病毒如何在人體產(chǎn)生抗病毒抗體之前將腫瘤細(xì)胞徹底殺死等。另外一個(gè)即水通道白激動(dòng)劑的應(yīng)用，目前也存在一定的問題需要解決，如AqF026 激動(dòng)劑可能會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞遷移，惡化轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，需要確定合適的體外劑量或體內(nèi)濃度；除此以外，AqF026 對(duì)癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞的特異性的選擇，這表明存在劑量或濃度的上限，從而不影響正常細(xì)胞的水通道蛋白等問題需要解決。盡管存在以上問題，但仍不可否認(rèn)，細(xì)胞脹亡參與腫瘤細(xì)胞的死亡從而達(dá)到治療的效果將是一個(gè)非常有價(jià)值和前景的研究。關(guān)于脹亡與腫瘤兩者關(guān)系的研究才開始, 相信隨著人類不斷深入的研究, 對(duì)二者認(rèn)識(shí)也將會(huì)更加明白, 相信更多的發(fā)現(xiàn)將有助于對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療。針對(duì)組織發(fā)育和機(jī)體穩(wěn)態(tài)來說，細(xì)胞死亡顯得十分重要。目前已知焦亡、脹亡、旁凋亡、自噬、凋亡等都屬于細(xì)胞死亡的方式。其中，細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種正常代謝性活動(dòng)，它是由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)性死亡的過程，細(xì)胞主要以萎縮和核碎裂為主要表現(xiàn)形式。臨床上有通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式來發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物，但是腫瘤細(xì)胞耐藥的出現(xiàn)導(dǎo)致未能達(dá)到理想的效果，治療效果未達(dá)到醫(yī)患的期望。對(duì)于細(xì)胞死亡方式的研究已經(jīng)較為成熟、深入和透徹，同時(shí)檢測方法也比較全面。細(xì)胞脹亡不是一種主動(dòng)性的細(xì)胞死亡方式，它是由生物不相容的物理?xiàng)l件或化學(xué)條件非特異性毒性引起的死亡。一系列的前期發(fā)展研究表面，細(xì)胞脹亡在細(xì)胞死亡方式中占有重要的地位，青蒿酯、黃連素、茄邊堿等化合物可誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡的發(fā)生。細(xì)胞脹亡和細(xì)胞凋亡是兩個(gè)不同的概念，因此對(duì)于存在凋亡通路缺陷或者凋亡耐藥的腫瘤來說，誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡是克服腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥的有效方法，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用，除此以外，細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡方式也有助于解決凋亡耐藥的問題、有利于抗腫瘤新靶點(diǎn)的探索以及抗腫瘤新方法的制定。另外，細(xì)胞脹亡同樣存在于心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病等的發(fā)生發(fā)展過程，對(duì)以上系統(tǒng)等的預(yù)防以及治療具有潛在的重大意義，對(duì)此也猜測，細(xì)胞凋亡也可能參與泌尿生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展、對(duì)細(xì)胞凋亡的深入研究，將有助于提高各系統(tǒng)腫瘤疾病的治療效果，改善患者的生活質(zhì)量。