中醫(yī)藥調(diào)控肺癌失巢凋亡研究進展

何燦封，吳健彬，楊紅星，林麗珠

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率均位居首位的腫瘤。雖然手術(shù)、化療、放療、靶向治療及近年來興起的免疫治療是目前肺癌綜合治療的主要手段，但大部分患者確診時已屬中晚期，失去手術(shù)機會或存在術(shù)后高復(fù)發(fā)風(fēng)險，多數(shù)患者存在無法耐受多程化療所帶來的毒性與產(chǎn)生耐藥性等問題，另外僅有少數(shù)患者可從昂貴的靶向治療和免疫治療中真正獲益。相較之下，中醫(yī)藥在臨床上廣泛用于晚期肺癌治療，其多靶點、多途徑的作用特點以及適用人群廣、安全性高和經(jīng)濟成本低等特點越來越受到關(guān)注[1]。目前中醫(yī)藥在肺癌帶瘤生存和防治復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢日益凸顯[2]。

轉(zhuǎn)移是肺癌乃至大多數(shù)腫瘤疾病的最終致死原因，研究發(fā)現(xiàn)失巢凋亡在肺癌轉(zhuǎn)移中扮演了重要角色[3]。失巢凋亡是指由于機體正常細胞與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM）或其他細胞失去接觸而誘導(dǎo)的一種特殊的程序化細胞死亡形式，腫瘤細胞一旦對失巢凋亡產(chǎn)生抵抗性，則極易離開原位通過血液或淋巴液等途徑進行遠處轉(zhuǎn)移[4]。因此深入研究肺癌的失巢凋亡機制對防治肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有重要意義。

中醫(yī)藥作為祖國醫(yī)學(xué)的重要組成部分，中醫(yī)藥干預(yù)肺癌的相關(guān)調(diào)控機制仍有待闡明。結(jié)合目前發(fā)現(xiàn)多種中藥復(fù)方和單體能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的失巢凋亡[5]，本文將就其相關(guān)機制的研究進展進行綜述。

1 失巢凋亡與中醫(yī)的關(guān)系

《素問·生氣通天論篇》云：“生之本，本于陰陽”。人體是一個有機的整體，人體內(nèi)部充滿著陰陽對立統(tǒng)一的關(guān)系?！端貑枴り庩栯x合篇》云：“陰陽者數(shù)之可十，推之可百，數(shù)之可千，推之可萬，萬之大不可勝數(shù)，然其要一也?！彪S著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，陰陽屬性被發(fā)現(xiàn)在機體組織、細胞或分子層面上具有普遍性[6]。陰陽是宇宙中相互關(guān)聯(lián)的事物或現(xiàn)象對立雙方屬性的概括。中醫(yī)典籍中雖無“凋亡”或“失巢凋亡”一說，但從本質(zhì)上看，凋亡作為一種生理性程序性死亡，貫穿于細胞生長、分化直至死亡的整個生命活動過程，細胞凋亡與細胞增殖同是維持生物體內(nèi)細胞動態(tài)平衡的基本行為，二者對立相關(guān)的屬性可從陰陽理論的角度進行認識[7]。陰陽學(xué)說認為外向的、興奮的、上升的屬于陽；內(nèi)守的、抑制的、下降的屬于陰。陰陽彼此之間存在對立制約、互根互用、消長、轉(zhuǎn)化、自和與平衡等關(guān)系，據(jù)此類推，細胞增殖歸屬于陽，而失巢凋亡屬于細胞凋亡的一種類型，歸屬于陰[8]?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論篇》：“陰勝則陽病，陽勝則陰病”。一旦機體生理性凋亡出現(xiàn)異常，增殖與凋亡的動態(tài)平衡被打破，陰陽失衡，并超過機體的調(diào)節(jié)能力，將導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。因此有學(xué)者[7，9]認為腫瘤的重要病理學(xué)基礎(chǔ)是細胞的過度增殖而凋亡減退，即細胞水平上的陽盛陰衰。

2 失巢凋亡機制

失巢凋亡是正常細胞(如上皮細胞和內(nèi)皮細胞）從ECM脫離后引起的程序性死亡，該凋亡過程的執(zhí)行主要通過外源性途徑和內(nèi)源性途徑等[10]。

外源性途徑由腫瘤壞死因子α(TNF-α）、凋亡信號配體(FasL）和TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）激活相應(yīng)的受體蛋白，進一步通過TNF受體相關(guān)死亡域(TNF receptor-associated death domain，TRADD）和Fas相關(guān)死亡域(Fas-aasociated death domain，F(xiàn)ADD），募集caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death inducing signaling complex，DISC），caspase-8酶自我剪切激活自身蛋白酶活性，可激活下游效應(yīng)分子caspase-3，引起caspase級聯(lián)反應(yīng)[11]，剪切胞漿和核底物，如ADP多聚核糖核苷酸、核纖層蛋白(lamins）、Caspase激活的脫氧核糖核酸酶(Caspase-activated deoxyribonuclease，CAD）等，降解染色質(zhì)和DNA，從而引發(fā)細胞凋亡[12]。此外，活化的Caspase-8能夠切割Bcl-2家族促凋亡蛋白Bid，截短的Bid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，與線粒體膜結(jié)合促進線粒體膜破壞并釋放細胞色素C，細胞色素C與caspase-9酶原、凋亡蛋白酶激活因子(Apoptosis protease activating factor，Apaf-1）形成細胞色素C-Apaf-1-caspase-9“凋亡體”，凋亡體可激活caspase-9，進一步可激活下游凋亡“執(zhí)行者caspase-3、caspase-7，從而引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡[13]。

Bcl-2蛋白家族參與了內(nèi)源性途徑，該家族蛋白依據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可分為：①抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL；②含BH1、BH2、BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，包括Bax、Bak等；③BH3-only蛋白，包括Bad、Bid、Bim等，其中Bid、Bim屬于凋亡直接激活蛋白，可直接結(jié)合并促使Bax/Bak寡聚化[14]。正常情況下，抑凋亡蛋白通過結(jié)合并抑制促凋亡蛋白來保持線粒體外膜的完整性，促進細胞存活正常細胞中Bim與動力蛋白復(fù)合體結(jié)合，當(dāng)細胞失去ECM接觸時，Bim會被釋放，并移動到線粒體，與Bcl-2/Bcl-xL結(jié)合并抑制其抗凋亡功能，并促使線粒體外膜上Bax和Bak寡聚化，寡聚化的Bax/Bak在線粒體外膜形成孔狀結(jié)構(gòu)，線粒體膜間隙的細胞色素C可通過線粒體外膜滲透作用從這些通道擴散釋放，并形成細胞色素C-Apaf-1-caspase-9“凋亡體”激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，促使細胞凋亡[15]。

3 失巢凋亡的相關(guān)通路

3.1 PI3K-Akt通路

PI3K-Akt信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細胞代謝、增殖、分化、存活、生長等細胞生物學(xué)過程。PI3K是一類脂質(zhì)激酶，通過磷酸化PI的肌醇環(huán)磷酸化位點生成3，4二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3，4-biphosphate，PI-3，4P2）及 3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PI-3，4，5P3），后者可作為第二信使與Akt結(jié)合，促進Akt的Ser473和Thr308位點磷酸化激活。激活后的Akt可促進抗凋亡蛋白Bcl-2的解離、抑制caspase-9活性、下調(diào)抑癌基因p53表達、激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB并促使其移位至細胞核、抑制Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子活性等[16]多種途徑發(fā)揮抑制凋亡的作用。細胞在黏附ECM時可觸發(fā)PI3K/Akt通路，激活的PI3K/Akt上調(diào)抗凋亡蛋白(如：Bcl-2、Bcl-XL、NF-κB等）表達和下調(diào)促凋亡蛋白(如：Bad、Bim等）表達，進而抑制失巢凋亡的發(fā)生[17]。研究表明，黏著斑激酶FAK通過激活PI3K-AKT途徑在肺癌細胞發(fā)揮抗失巢凋亡作用[18]。塞來昔布在人肺癌A549細胞系在體內(nèi)外實驗中可促進失巢凋亡，降低肺癌轉(zhuǎn)移，其機制主要與抑制PI3K/Akt等途徑促進Bim的表達，并抑制Mcl-1的表達有關(guān)[19]。

3.2 整合素通路

整聯(lián)蛋白(integrin）又稱整合素，存在于細胞表面，是調(diào)節(jié)細胞間和細胞-細胞外基質(zhì)粘附的跨膜受體蛋白，介導(dǎo)著細胞與ECM的附著以及從ECM到細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細胞遷移、粘附、增殖、凋亡等。一方面，整合素通過形成黏著復(fù)合物能特異性識別ECM中的不同配體(如纖連蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白等）精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列，將細胞骨架與之耦合。另一方面，整聯(lián)蛋白被ECM的配體激活后構(gòu)型發(fā)生改變，活化下游激酶，如粘附斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK），整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK），Src，PI3K，ERK等，其中FAK是整合素信號途徑中的關(guān)鍵激酶，F(xiàn)AK激活后可通過Src激酶激活下游PI3K-AKT、RAS-MAPK等通路維持細胞生存[20-21]。研究表明[22-23]，整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的FAK激活是抑制失巢凋亡的關(guān)鍵。當(dāng)正常細胞(如上皮細胞和內(nèi)皮細胞）與ECM脫離接觸后，整聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平下降，F(xiàn)AK依賴的PI3K存活通路磷酸化水平下降，使關(guān)鍵的下游生存效應(yīng)因子(PI3K、Akt、ERK）失活，并激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)失巢凋亡。

3.3 MAPK通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK）途徑的級聯(lián)激活是細胞內(nèi)信號傳遞網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵途徑之一。經(jīng)典的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以三級激酶級聯(lián)激活方式(MAPKKK→MAPKK→MAPK）將細胞外信號刺激(如氧化應(yīng)激、紫外線照射和生長因子等）傳遞到細胞核。MAPK信號通路主要包括ERK1/2、p38 MAPK、JNK/SAPK和BMK1/ERK5等4個MAPK亞族蛋白及其所屬通路[24]，其中p38 MAPK和JNK/SAPK通路除了影響細胞增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)，同時還參與調(diào)控細胞凋亡。細胞脫離ECM后，F(xiàn)AK到MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到抑制，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)生失巢凋亡[25]。目前發(fā)現(xiàn)p38 MAPK通過磷酸化p53、上調(diào)Fas/Fas L途徑、激活c-Fos/c-Jun、促進Bax易位、激活caspase等多種途徑調(diào)控細胞凋亡[26]。JNK促凋亡機制主要為JNK既可通過激活c-Jun/AP-1依賴性途徑，上調(diào)p53、FasL以及Bcl-2家族的促凋亡蛋白，還能促進細胞色素C釋放進入胞漿，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)而觸發(fā)失巢凋亡[27]。研究表明[28]，MAPK通路上調(diào)與失巢凋亡抵抗有關(guān)，并與PI3K-Akt途徑有串?dāng)_和相互補償作用。

3.4 經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路

Wnt屬于分泌型糖蛋白，在細胞受到外界信號刺激后分泌到細胞外，與細胞膜上的Wnt受體結(jié)合引起Wnt通路激活，其中β-catenin是Wnt信號通路的核心蛋白，胞漿中的β-catenin主要與細胞表面的E-cadherin形成復(fù)合體，以維持胞間連接和粘附，阻礙細胞侵襲及轉(zhuǎn)移。無Wnt信號時，細胞支架蛋白Axin結(jié)合糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）、 腺 瘤 性 息 肉 病(adenomatous polyposis coli，APC）蛋白以及酪蛋白激酶1(CK1）組成的APC復(fù)合體，調(diào)控了β-catenin的降解，具體為Axin結(jié)合了β-catenin后，CK1和GSK3β可磷酸化β-catenin，使其通過泛素-蛋白酶體途徑降解。而當(dāng)Wnt信號分泌后，可與細胞膜上的跨膜受體卷曲蛋白frizzled受體以及協(xié)同受體脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6）結(jié)合形成復(fù)合物，募集胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(Dishevelled，Dvl），促進CK1和GSK3β介導(dǎo)的LRP5/6磷酸化，磷酸化的LRP5/6募集Axin至細胞膜上，導(dǎo)致APC復(fù)合物失去Axin蛋白的支架作用而發(fā)生解體，從而抑制了CK1和GSK3β磷酸化β-catenin，β-catenin不降解而積累后可從胞漿易位到細胞核，取代轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子T細胞因子(T cell factor，TCF）/淋巴增強因子(Lymphoid Enhance Factor，LEF）上結(jié)合的共阻遏物Groucho，并結(jié)合CBP/p300、BCL9和Pygo等輔轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而啟動下游的靶基因轉(zhuǎn)錄表達[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號和TGF-β以協(xié)同方式參與誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，驅(qū)動失巢凋亡抗性[31]。此外，Wnt/β-catenin不僅抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF）/c-Myc介導(dǎo)的細胞凋亡，而且抑制依賴于死亡受體信號通路的失巢凋亡[32]。

3.5 TGF-β/Smad通路

TGF-β/Smad通路在細胞和組織的生長、分化、凋亡、免疫反應(yīng)以及ECM的合成等具有關(guān)鍵作用。TGF-β信號在與細胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，即Ⅱ型受體(R Ⅱ）和Ⅰ型受體(R Ⅰ）形成受體復(fù)合物后，首先磷酸化激活R Ⅱ，繼而由R Ⅱ磷酸化激活RI，激活的RⅠ招募并磷酸化下游的調(diào)節(jié)型Smad(R-Smad，即Smad2/3），磷酸化RSmad與通用型Smad(Co-Smad，即Smad4）形成Smad2/3/4異源寡聚體并轉(zhuǎn)運入細胞核。Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物與目的基因啟動子區(qū)的Smad反應(yīng)元件結(jié)合，并同轉(zhuǎn)錄因子FAST1、輔轉(zhuǎn)錄因子CBP/p300等協(xié)同作用，對靶基因的表達進行正向或負向調(diào)控[33]。另一方面，抑制型Smad(I-Smad，Smad6/7）可通過抑制R-Smad與R Ⅰ的相互作用，阻礙R-Smad/Co-Smad復(fù)合物形成、抑制轉(zhuǎn)錄等對TGF-β/Smad信號通路進行負反饋調(diào)節(jié)[34]。研究表明，TGF-β/Smad4信號通路的激活在恢復(fù)失巢凋亡敏感性有重要作用[35]。整合素通路上調(diào)后，可增加FAK2蛋白表達水平，通過失活NF-κB以及激活caspases級聯(lián)反應(yīng)提高細胞對失巢凋亡的敏感性[36]。

3.6 NF-κB信號通路

NF-κB是一種以二聚體的形式存在的細胞核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB信號通路參與免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡等多種生物進程。靜止?fàn)顟B(tài)時，NF-κB與抑制因子IκB結(jié)合組成無活性的三聚體。在經(jīng)典 NF-κB 信號通路中，IκB 激酶(IκB kinase，IKK）在細胞接受對應(yīng)信號刺激后被激活，進而磷酸化IκB蛋白，并促使其泛素化和溶酶體降解，NF-κB得以釋放，并在經(jīng)過磷酸化激活后轉(zhuǎn)位到核內(nèi)啟動相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄和表達[37]，其靶基因包括了c-FLIP、bcl-xl等抑制失巢凋亡蛋白[38]。研究表明[39]，DBC1通過激活NF-κB促進失巢凋亡抗性。miR-200c靶向NF-κB上調(diào)的TrkB/NTF3自分泌信號環(huán)增強失巢凋亡的敏感性[40]。

4 中醫(yī)藥調(diào)控肺癌失巢凋亡的相關(guān)研究

近年來研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥復(fù)方或單體可能通過影響肺癌細胞失巢凋亡途徑而發(fā)揮療效，其機制包括了上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9凋亡蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白抗凋亡蛋白表達，抑制低ERK和Akt等存活信號蛋白表達以及干預(yù)TGF-β/Smad通路、整合素通路等方面?，F(xiàn)將其介紹如下：

4.1 中藥復(fù)方

復(fù)方中藥金復(fù)康[41]可以預(yù)防肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs）可能是其干預(yù)肺癌轉(zhuǎn)移的重要靶點。研究發(fā)現(xiàn)金復(fù)康能抑制肺癌CTC-TJH-01細胞系和肺癌H1975細胞系的增殖、遷移和侵襲，還能誘導(dǎo)CTC-TJH-01和H1975細胞失巢凋亡。mRNA表達譜分析顯示，金復(fù)康對ECM-受體相互作用和焦點黏附均有調(diào)節(jié)作用；對整合素/Src通路具有明顯的抑制作用，提示金復(fù)康抑制CTCs的遷移和侵襲機制可能與抑制整合素/Src軸誘導(dǎo)失巢凋亡有關(guān)，從而發(fā)揮抗肺癌轉(zhuǎn)移作用。

益氣除痰方[42]具有肺癌細胞增殖，誘導(dǎo)其失巢凋亡的作用，并且具有劑量依賴性，同時發(fā)現(xiàn)了該方可降低P-akt蛋白表達，但對P-p38蛋白(MAPK通路蛋白）的表達無顯著影響，由此推測其誘導(dǎo)失巢凋亡作用或與PI3K/akt信號通路相關(guān)。

清金得生片[43]有誘導(dǎo)肺癌細胞失巢調(diào)亡的作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，進一步還發(fā)現(xiàn)了p-Akt表達與凋亡率、含藥血清呈負相關(guān)，結(jié)合文獻及既往研究推測清金得生片發(fā)揮失巢凋亡作用或與抑制P-akt的活化，降低下游端粒酶活性，下調(diào)bcl-2基因的表達有關(guān)。

4.2 中藥單體

一項研究[44]發(fā)現(xiàn)，白芷根活性成分歐前胡素可增強H23以及H292、A549等人肺癌細胞對失巢凋亡的敏感性，進一步研究表明了歐前胡素提高了p53蛋白水平，下調(diào)了Mcl-1蛋白并上調(diào)Bax，但對Bcl-2的表達影響很小。姜黃素[45]被發(fā)現(xiàn)在失巢凋亡期間下調(diào)Bcl-2蛋白，并使肺癌細胞對脫離誘導(dǎo)的細胞凋亡敏感，同時該過程可被超氧陰離子清除劑Mn(Ⅲ）tetrakis(4-benzoic acid）porphyrin(Mn(Ⅲ）TBAP）所抑制，并推測姜黃素通過泛素-蛋白體降解降低Bcl-2水平，使肺癌細胞對失巢凋亡細胞凋亡敏感。老鸛草素[46]可通過抑制TGF-β1介導(dǎo)的EMT以及肺癌A549細胞遷移、侵襲和失巢凋亡抗性等。千層紙素[47]可通過阻斷c-Src/AKT/HK II通路介導(dǎo)的葡萄糖剝奪樣機制使A549肺癌細胞對失巢凋亡敏感。

多種石斛提取物如石斛酚[48]、構(gòu)唇石斛素[49]以及 Ephemeranthol A[50]和 dendrofalconerol A[51]等被 發(fā)現(xiàn)可抑制H460人肺癌細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并使其對失巢凋亡敏感，相關(guān)機制涉及了降低ERK和Akt等存活信號蛋白的活化，下調(diào)Cav-1蛋白表達并引起Mcl-1抗凋亡蛋白減少，以及減少抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達，激活caspase-3和caspase-9凋亡蛋白表達等。

人參皂苷 Rk1、Rg5[52]或 20(R）-Rg3[53]等可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT以及肺癌A549細胞遷移、侵襲和失巢凋亡抵抗的抗性，其機制或與抑制TGF-β1下游的Smad和NF-κB/ERK信號通路有關(guān)。

5 結(jié)語

中醫(yī)藥目前廣泛用于肺癌的臨床治療，并在帶瘤生存、防治復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等方面日益凸顯優(yōu)勢?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方或單體可通過多靶點、多通路誘導(dǎo)肺癌細胞恢復(fù)失巢凋亡敏感性。因此，采用中醫(yī)藥干預(yù)促進肺癌細胞失巢凋亡來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移將是一種新的研究思路。然而，目前有關(guān)肺癌失巢凋亡中醫(yī)藥也面臨著一些等問題，諸如未有效結(jié)合動物模型進行體內(nèi)驗證，未結(jié)合功能回復(fù)或分子互作等手段進一步驗證相關(guān)結(jié)論等，因此未來研究應(yīng)著重采用更為深入細致的方法來研究相關(guān)干預(yù)機制，同時探索和挖掘更多相關(guān)潛在的靶點和信號通路，以進一步豐富和拓展中醫(yī)藥干預(yù)肺癌細胞失巢凋亡的內(nèi)涵。