非洲豬瘟的診斷與安全防控管理

劉中杰

(四川省岳池縣九龍畜牧獸醫(yī)站，四川 岳池 638300)

0 引言

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染引發(fā)的高度接觸性傳染病，該病毒的環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，除病豬作為傳染源外，軟蜱也可作為傳播媒介擴(kuò)大病毒流行范圍，加大非洲豬瘟防治管理難度。病豬感染強(qiáng)毒株后以最急性、急性病例為主，出現(xiàn)典型的發(fā)熱、虛弱、嘔吐、咳嗽、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟出血等癥狀，妊娠母豬會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)，急性病例發(fā)病率和死亡率為100%，亞急性、慢性病例發(fā)病率分別為55%、30%[1]。由于非洲豬瘟目前仍無(wú)特效藥且危害性大，一旦出現(xiàn)感染，必須及時(shí)進(jìn)行撲殺和無(wú)害化處理，避免給養(yǎng)豬戶和區(qū)域生豬產(chǎn)能造成嚴(yán)重影響。因此，各大養(yǎng)殖戶和企業(yè)要重視非洲豬瘟的防控，掌握基本的診斷方法，若有相似癥狀需要及時(shí)上報(bào)、隔離，切斷非洲豬瘟病毒的傳播途徑，將損害降低到最小。

1 病原學(xué)概述

非洲豬瘟的臨床表現(xiàn)多樣，具有不易辨識(shí)、病程短、致死率高等特點(diǎn)。非洲豬瘟病毒不僅是一種線性雙鏈DNA，同時(shí)還是唯一一個(gè)蟲媒DNA病毒，即可通過(guò)軟蜱進(jìn)行病原體傳播，目前只感染家豬和野豬，人類或其他動(dòng)物接觸病毒后無(wú)典型感染癥狀，但可作為非洲豬瘟病毒的傳播媒介感染健康豬群。非洲豬瘟病毒血清型多樣，且存在較強(qiáng)的變異能力，因此無(wú)特效藥和疫苗。國(guó)際上根據(jù)其p72基因末端的核酸片段(大小為478個(gè)堿基)將其分為24個(gè)基因型，我國(guó)感染的非洲豬瘟病例中以基因Ⅱ?yàn)橹?。該病毒的環(huán)境適應(yīng)較強(qiáng)，可在糞便中存活2周左右，在病豬尸體及周邊環(huán)境中存活數(shù)個(gè)月，在生肉、未完全熟制的豬肉制品(如熏肉、腌肉)和食品剩余物內(nèi)可存活幾個(gè)月。雖然目前無(wú)人類感染病例報(bào)道，但是該病毒可污染飼養(yǎng)員衣物或鞋底，豬若接觸污染物后可感染病毒[2]。非洲豬瘟病毒不耐高溫，56℃ 70 min或60℃ 20 min可殺滅病原體，但非洲豬瘟病毒耐低溫，4℃條件下可存活1年，在無(wú)血清pH 4.0～11.0條件下毒力較為穩(wěn)定，若有血清存在，其穩(wěn)定的pH范圍可擴(kuò)大到4.0～13.4。非洲豬瘟病毒對(duì)乙醚、氯仿化學(xué)試劑敏感度高，將病毒污染物分別置于0.3%福爾馬林、1%氫氧化鈉、3%鄰苯基苯酚試劑中30 min，均可有效滅活病原體。

2 流行病學(xué)

2.1 傳染源

感染非洲豬瘟病毒的病豬或帶毒的家豬、野豬、軟蜱及病毒污染物為主要的傳染源。

2.2 傳播途徑

一是直接接觸感染，病豬感染后，非洲豬瘟病毒可在其糞便、尿液、唾液、眼淚、鼻腔分泌物、陰道分泌物中存在，這些病毒具有較高的毒性，與健康豬接觸后可感染非洲豬瘟病毒。此外，帶毒針頭也可擴(kuò)散該病毒[3]。二是間接接觸感染，非洲豬瘟病毒污染人員、車輛或用具，當(dāng)豬群與非洲豬瘟病毒污染物接觸后可感染。同時(shí)，養(yǎng)殖人員攜帶非洲豬瘟病毒污染的豬肉制品也可將病原體帶入豬場(chǎng)，泔水喂豬也會(huì)增加非洲豬瘟病毒感染概率。三是軟蜱叮咬感染，感染非洲豬瘟病毒的軟蜱在叮咬生豬時(shí)可直接傳播病毒。

2.3 易感動(dòng)物

家豬、野豬均是非洲豬瘟病毒的易感動(dòng)物。目前無(wú)牛、羊、犬、貓等感染的病例報(bào)道。

2.4 流行季節(jié)

非洲豬瘟全年均可發(fā)病。

3 初步診斷

3.1 發(fā)病癥狀

病毒的潛伏期短，自然感染潛伏期一般為1周，臨床試驗(yàn)感染為3 d左右，病程可持續(xù)4～19 d，發(fā)病癥狀和病程與病毒毒力有關(guān)，目前主要分為3種類型毒株:強(qiáng)、中等、低毒力毒株。

3.1.1 最急性和急性型

引發(fā)最急性和急性癥狀的非洲豬瘟病毒為強(qiáng)毒力毒株，最急性病例由于病程短、病情急，主要以突然死亡為主。急性病例可持續(xù)2～4 d，病豬發(fā)病后出現(xiàn)高熱，體溫溫度可升至42℃，病豬食欲廢絕，精神萎靡，往往縮在豬舍一角，耳尖皮膚發(fā)紺，有明顯的虛弱、無(wú)力癥狀，呼吸困難，有咳嗽癥狀，鼻腔內(nèi)有漿性黏液流出，病豬伴有嘔吐，腹瀉，隨著病情發(fā)展，病豬糞便中有血液。這兩種類型癥狀的死亡率達(dá)100%[4]。

3.1.2 亞急性型

引發(fā)亞急性癥狀的非洲豬瘟病毒為中等毒力毒株，病豬感染非洲豬瘟病毒后出現(xiàn)發(fā)熱、食欲下降、低頭消沉，病豬呼吸不暢、咳嗽、打噴嚏、喜臥，驅(qū)趕行走時(shí)伴有疼痛感。隨著病情發(fā)展，病豬的關(guān)節(jié)處有腫脹，耳尖、前后肢皮膚顏色呈紫紅色。若發(fā)現(xiàn)不及時(shí)，可在感染后1～3周出現(xiàn)死亡，病死率55%±15%。

3.1.3 慢性型

引發(fā)慢性癥狀的非洲豬瘟病毒為低毒力毒株，慢性型非洲豬瘟的病程相對(duì)緩慢，非洲豬瘟病毒可潛伏2～3周后才出現(xiàn)輕度發(fā)熱，病豬有呼吸急促、關(guān)節(jié)腫脹癥狀，耳部、腹部和大腿內(nèi)側(cè)的皮膚出現(xiàn)局部紅斑，妊娠母豬會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀。慢性型非洲豬瘟和豬瘟、豬丹毒、豬肺疫、豬副傷寒具有一定的相似性，慢性型非洲豬瘟死亡率約為30%。

3.2 病理變化

3.2.1 最急性和急性型

最急性型非洲豬瘟的病豬全身器官有明顯的出血癥狀，尤其是全身淋巴組織會(huì)出現(xiàn)炎癥的出血。急性型非洲豬瘟的病豬主要病變器官為淋巴結(jié)、血管，病豬皮下出血，皮膚多處有深紅色的疹塊。脾臟腫大至正常脾臟體積的4.5±1.5倍，脾臟呈黑紫色，嚴(yán)重充血，質(zhì)地變脆。病豬淋巴結(jié)腫大、出血，花紋如大理石狀，腎臟、肝臟質(zhì)地變脆，有出血、充血癥，腎臟和膀胱表面還有許多淤血點(diǎn)。病豬的肺部出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫，病豬心內(nèi)、外膜有出血點(diǎn)。

3.2.2 亞急性型

亞急性型非洲豬瘟的病豬剖開腹腔后可發(fā)現(xiàn)大量積液，病豬的脾臟腫大、出血，病豬的頜下腺、咽喉、腸系膜等淋巴結(jié)水腫、出血，腎臟出血嚴(yán)重，其出血癥狀要比急性型非洲豬瘟出血面積大且嚴(yán)重。病豬心包積液，肝臟和膽囊也有水腫癥。

3.2.3 慢性型

慢性型非洲豬瘟的病豬淋巴結(jié)腫脹，有局部出血癥，脾臟顏色正常，但體積變大。病豬肺部炎癥突出，有干酪樣壞死，病豬心臟無(wú)出血，但呈纖維性心包炎。慢性型病豬的扁桃體會(huì)有壞死灶，而急性、亞急性則無(wú)該特征。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

檢測(cè)原理為PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)(非洲豬瘟檢測(cè)的熒光基團(tuán)為5-羧基熒光素)，利用熒光信號(hào)積累對(duì)整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值進(jìn)行定量分析。

4.1.1 樣品前期處理

該方法適用于病死豬的淋巴結(jié)、脾臟或病豬血液的檢測(cè)，待檢樣品應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，0.15 g組織可用PBS(0.1 M，pH=7.2)勻漿處理，經(jīng)10 000 g離心3 min后吸取上清，1 mL全血樣本直接置于離心管內(nèi)，將這些不同的病料置于60℃恒溫水浴鍋滅活30 min，滅活后樣本可置于4℃貯藏，時(shí)長(zhǎng)小于24 h，若長(zhǎng)時(shí)間保持應(yīng)置于-70℃的溫度條件下。

4.1.2 病毒DNA提取

向3個(gè)離心管內(nèi)加入200 μL DNA提取液1(PEG8000粉末207.4 g、氯化鈉175.3 g，用DEPC水定容至1 L)，分別加入處理好的樣本、陰性、陽(yáng)性對(duì)照，混勻后在4℃下10 000 g離心15 min后吸取上清到新的離心管內(nèi)，分別加入10 μL DNA提取液2(氯化鉀129.1g、乙二胺四乙酸146.1g、Tirs堿121.1g、氫氧化鈉6g、濃鹽酸1.21 mL，用DEPC水定容至1 L)，混勻后在4℃下2 000 g離心10 s，沸水浴10 min，加入90 μL DEPC水，10 000 g離心15 min后吸取上清到新的離心管內(nèi)，即為DNA。

4.1.3 熒光定量PCR檢測(cè)

將配置好的熒光定量PCR反應(yīng)液(總體積為20 μL)內(nèi)加入5 μL DNA溶液，混勻，瞬時(shí)離心后置于熒光定量PCR儀器內(nèi)，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)過(guò)程收集CT值，結(jié)合PCR的熒光曲線讀取結(jié)果。

4.1.4 結(jié)果判定

試驗(yàn)成立的前提:陽(yáng)性對(duì)照的CT值不大于28，且擴(kuò)增曲線呈S型，陰性對(duì)照無(wú)CT值且擴(kuò)增曲線成直線。

樣本結(jié)果讀取:若CT值不大于38，且擴(kuò)增曲線呈S型則為陽(yáng)性樣本；若CT值大于38且擴(kuò)增曲線呈S型則需要進(jìn)行重檢；若無(wú)CT值且擴(kuò)增曲線成直線則為陰性樣本。

4.2 ELISA檢測(cè)

檢測(cè)原理為抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)加熱與酶反應(yīng)的底物后進(jìn)行顯色，根據(jù)顏色進(jìn)行定性(有無(wú)顏色變化)或定量(顏色深淺)分析。

4.2.1 樣品前期處理

該方法適用于病死豬的淋巴結(jié)、脾臟或病豬血液(置于抗凝管內(nèi))的檢測(cè)，組織樣本通過(guò)PBS(0.1 M，pH=7.2)勻漿處理后，經(jīng)3 000 g離心20 min后吸取上清，血液樣本經(jīng)3 000 g離心20 min后吸取上清。

4.2.2 試劑準(zhǔn)備

試驗(yàn)前30 min將試劑、樣本置于25℃室溫條件下自然平衡。根據(jù)非洲豬瘟抗體(非洲豬瘟)Elisa試劑盒說(shuō)明書準(zhǔn)備不同稀釋比例的標(biāo)準(zhǔn)品，然后將檢測(cè)溶液A、B分別離心、稀釋，對(duì)洗滌液進(jìn)行稀釋，分裝底物溶液。

4.2.3 ELISA檢測(cè)

試驗(yàn)在96孔板內(nèi)進(jìn)行，分別添加標(biāo)準(zhǔn)品、待檢樣品、空白對(duì)照，7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)分別加入不同稀釋比例的標(biāo)準(zhǔn)品，待檢樣品孔內(nèi)加入100 μL處理好的樣本，空白孔加入100 μL DEPC水。覆蓋膜置于37℃恒溫箱孵育120 min。倒掉孔內(nèi)液體，甩干。每孔分別加入100 μL的檢測(cè)溶液A，覆蓋膜置于37℃恒溫箱孵育60 min。倒掉孔內(nèi)液體，每孔分別加入300 μL稀釋好的洗滌液，室溫靜置90 s，翻轉(zhuǎn)96孔板置于吸水紙上層，拍打?qū)⒁后w流入吸水紙內(nèi)，反復(fù)洗滌3次。每孔分別加入100 μL的檢測(cè)溶液B，覆蓋膜置于37℃恒溫箱孵育60 min。倒掉孔內(nèi)液體，每孔分別加入300 μL稀釋好的洗滌液，室溫靜置90 s，翻轉(zhuǎn)96孔板置于吸水紙上層，拍打?qū)⒁后w流入到吸水紙內(nèi)，反復(fù)洗滌5次。每孔分別加入90 μL底物溶液，覆蓋膜后包上一層錫箔紙置于37℃恒溫箱孵育20 min，若標(biāo)準(zhǔn)品孔呈梯度藍(lán)色，可以在每孔內(nèi)加入50 μL終止反應(yīng)液，藍(lán)色孔會(huì)立即變?yōu)辄S色，輕輕晃動(dòng)使溶液混勻。

4.2.4 結(jié)果判定

切開覆膜，置于酶標(biāo)儀下進(jìn)行光密度值讀取，波長(zhǎng)檢測(cè)值為450 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式來(lái)確定定量結(jié)果。

5 非洲豬瘟的安全防控管理

5.1 豬群和豬舍管理

5.1.1 引種規(guī)范

由于非洲豬瘟在我國(guó)已有流行，豬場(chǎng)最好秉持“自繁自養(yǎng)”原則，減少引種，這樣可以杜絕因引種帶來(lái)的外部非洲豬瘟病毒發(fā)生[5]。如需要引種，首先要確定引種地區(qū)為非洲豬瘟非疫區(qū)，其次要規(guī)范引種操作步驟。引種豬只入場(chǎng)前先置于隔離區(qū)進(jìn)行30 d的專人飼養(yǎng)，并定期對(duì)其進(jìn)行健康檢查，30 d隔離期結(jié)束后采集血液樣本，進(jìn)行非洲豬瘟病毒和其他疫病的血清學(xué)檢測(cè)，若均為陰性則合群飼養(yǎng)。

5.1.2 豬舍消毒

非洲豬瘟病毒雖然環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)，但對(duì)苯酚、碘伏等消毒劑仍較為敏感，因此在非洲豬瘟流行期間可以選擇非洲豬瘟病毒敏感的化學(xué)試劑進(jìn)行消毒[6]。豬場(chǎng)內(nèi)每周消毒一次，選用碘化物試劑噴灑消毒，冬季可選用干粉消毒，減少體表液體蒸發(fā)以避免出現(xiàn)感冒。豬舍過(guò)道用10%石灰水噴灑消毒。

5.1.3 防蜱滅鼠

從非洲豬瘟傳染源來(lái)看，豬場(chǎng)還要做好防蜱滅鼠工作[7]。豬舍地面、墻壁的裂縫、孔隙都需要用水泥添堵，豬舍外的雜草要及時(shí)拔除，軟蜱流行季節(jié)要在豬舍四周噴灑敵百蟲試劑來(lái)滅蜱。老鼠可用粘鼠板或滅鼠器來(lái)捕抓，鳥類可設(shè)置防鳥網(wǎng)。

5.2 人員管理

5.2.1 樹立安全防控意識(shí)

養(yǎng)殖戶要加強(qiáng)非洲豬瘟的安全防控意識(shí)，豬場(chǎng)要定期對(duì)人員進(jìn)行非洲豬瘟傳染病的防控培訓(xùn)，從理論層面了解非洲豬瘟的危害、傳播途徑和發(fā)病癥狀，一旦出現(xiàn)類似感染病例及時(shí)上報(bào)和隔離，減少因人員疏忽造成的病原體擴(kuò)散。

5.2.2 制定人員管理制度

①豬場(chǎng)要規(guī)范人員進(jìn)出管理，養(yǎng)殖人員在工作期間減少出場(chǎng)次數(shù)，進(jìn)出場(chǎng)區(qū)都要按規(guī)定進(jìn)行沐浴、衣物更換和紫外消毒，并在生活區(qū)至少隔離48 h后才能進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)，且進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)前仍按規(guī)定進(jìn)出消毒。同時(shí)，養(yǎng)殖人員不能隨意串舍，外來(lái)人員不能隨意進(jìn)入到生產(chǎn)區(qū)內(nèi)。②豬場(chǎng)要對(duì)人員進(jìn)出場(chǎng)攜帶物進(jìn)行檢查，嚴(yán)禁工作人員攜帶生豬肉、豬肉制品入場(chǎng)，若有攜帶需要在場(chǎng)外進(jìn)行完全蒸熟處理，場(chǎng)區(qū)工作衣物、生豬制品也不能帶出場(chǎng)外[8]。同時(shí)，進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)、豬舍內(nèi)的養(yǎng)殖人員要佩戴橡膠手套，穿戴專門的衣物、鞋子，這些用品每天都要經(jīng)過(guò)紫外消毒和定期的化學(xué)試劑浸泡消毒，以防因人員衣物攜帶非洲豬瘟病毒而感染健康生豬。

5.3 車輛管理

5.3.1 嚴(yán)格管控外來(lái)車輛

①外來(lái)車輛尤其是非本場(chǎng)運(yùn)載生豬車輛要遠(yuǎn)離豬場(chǎng)，需要豬場(chǎng)在距離場(chǎng)外500 m處設(shè)立提示牌。②規(guī)?；i場(chǎng)要在距離場(chǎng)外1 km處設(shè)立中轉(zhuǎn)站，若出現(xiàn)豬傳染性疾病，飼料、物資等通過(guò)該中轉(zhuǎn)站進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，降低車輛攜帶病原體出場(chǎng)的風(fēng)險(xiǎn)。③豬場(chǎng)進(jìn)入、外出車輛為單向通道，凡入場(chǎng)后必須按照規(guī)定的路線行駛，不能隨意下車、胡亂穿行。

5.3.2 進(jìn)出場(chǎng)車輛嚴(yán)格消毒

①做好登記管理，進(jìn)出場(chǎng)車輛要對(duì)司機(jī)姓名、單位、運(yùn)輸物品等進(jìn)行登記。②場(chǎng)內(nèi)工作人員穿好隔離服后對(duì)入場(chǎng)車輛進(jìn)行表面、內(nèi)部消毒，車表面包括車身、底盤、車輪等進(jìn)行污泥清除，車內(nèi)部包括車廂內(nèi)地面、內(nèi)壁、方向盤等進(jìn)行擦拭清潔?；厩鍜吆篑?cè)肴肟谔幍南境貎?nèi)，駕駛員佩戴一次性鞋套進(jìn)入人員消毒室進(jìn)行紫外線、噴霧消毒(可選用0.1%新潔爾滅)，車輪則停在消毒池，消毒液可選用2%～5%燒堿，消毒池內(nèi)的液體每周至少更換2次，且液面高度要高于車輛的輪轂，消毒池的長(zhǎng)度應(yīng)是車輛周長(zhǎng)的2～4倍，消毒池停留20 min后再進(jìn)行清水沖洗，清潔消毒后的車輛可以進(jìn)入豬場(chǎng)。

5.3.3 專車專用

豬場(chǎng)應(yīng)根據(jù)養(yǎng)殖規(guī)模配置足夠數(shù)量的車，運(yùn)輸生豬、飼料、廢棄物、病死豬等車輛不能混用，并定期進(jìn)行消毒處理。

6 結(jié)語(yǔ)

為科學(xué)防控非洲豬瘟，養(yǎng)殖戶首先要對(duì)非洲豬瘟的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行初步了解，并明確病原體特征和流行病學(xué)，這樣才能選擇合適的消毒試劑和病毒處置方法。在認(rèn)清非洲豬瘟發(fā)病癥狀后，若出現(xiàn)相似病例可以及時(shí)進(jìn)行隔離和消毒，并根據(jù)上級(jí)部門緊急處置方案進(jìn)行相關(guān)操作。由于非洲豬瘟的傳染性和危害性較大，豬場(chǎng)要制定科學(xué)的生物安全防治管理制度，做好豬、人、車管理，避免因管理疏忽和疫病認(rèn)知不清而導(dǎo)致非洲豬瘟流行。