基于改良科赫法則探討炎性腸病微生態(tài)失調(diào)及微生物治療策略

趙翰錚，游柳平，楊柳，于佳永，黃躍南

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，哈爾濱 150001)

炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，其發(fā)病率在西方國家較高，在發(fā)展中國家也呈上升趨勢[1]。IBD病因復(fù)雜，環(huán)境因素、基因易感性及腸道微生態(tài)失調(diào)等均參與其中[2-3]。腸道微生物的組成發(fā)生改變、菌群多樣性減少可導(dǎo)致共生微生物與潛在致病微生物之間的平衡被打破，即微生態(tài)失調(diào)，而腸道微生態(tài)失調(diào)可引發(fā)腸上皮細(xì)胞功能受損、致病菌識(shí)別功能缺陷和異常免疫反應(yīng)等均是IBD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-6]。在單一病原體致病的范疇，科赫法則為證明有機(jī)體在疾病中的作用提出了標(biāo)準(zhǔn)。將人腸道的微生態(tài)失調(diào)看作IBD的致病病原體，若其滿足科赫法則的條件則表明其與IBD發(fā)病之間的潛在因果關(guān)系。而微生態(tài)失調(diào)包括多種微生物及其復(fù)雜的相互作用，因此，當(dāng)面對(duì)復(fù)雜的以群落為單位的病原體時(shí)，傳統(tǒng)科赫法則(一種病原體對(duì)應(yīng)一種疾病)就顯得不夠全面?，F(xiàn)就基于改良科赫法則探討IBD 微生態(tài)失調(diào)及微生物治療策略的研究進(jìn)展予以綜述。

1 IBD與腸道微生態(tài)失調(diào)

人體胃腸道中約有100萬億個(gè)微生物，其中超過99%為細(xì)菌；成年人腸道中的細(xì)菌大部分屬于擬桿菌屬、副擬桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬[7-8]。腸道微生物除了參與宿主營養(yǎng)代謝，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)和天然抗感染能力影響宿主健康[9-10]；同時(shí)，腸道微生物還與宿主晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)換、生理和疾病的易感性日波動(dòng)有關(guān)[11]；此外，腸道微生物區(qū)系還可通過與潛在病原菌競爭營養(yǎng)位點(diǎn)、產(chǎn)生抗菌因子以及施加定植抗性防止?jié)撛诓≡纳L，從而維持宿主生理活動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡[12]。宿主腸道內(nèi)共生微生物區(qū)系的比例降低或多樣性減少均會(huì)導(dǎo)致腸道的微生態(tài)失調(diào)，進(jìn)而破壞宿主生理活動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡，引發(fā)一系列致病反應(yīng)。

健康個(gè)體的腸道微生物具有高度個(gè)性化，但這種變化始終保持在健康平面，而IBD患者的微生物群波動(dòng)則明顯偏離健康平面，處于失調(diào)狀態(tài)，表現(xiàn)為菌群組成改變、多樣性減少且穩(wěn)定性降低[13-14]。腸道正常菌屬及其代謝產(chǎn)物在防御病原體定植與感染方面均具有重要作用，IBD患者腸道的正常菌屬嚴(yán)重減少，同時(shí)伴隨潛在致病種群增加，兩者比例失調(diào)對(duì)疾病的發(fā)展起關(guān)鍵作用[15-17]。研究表明，IBD患者腸道內(nèi)的雙歧桿菌和乳酸桿菌大量減少，而這兩種細(xì)菌具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過短鏈脂肪酸抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)的進(jìn)展、增強(qiáng)宿主腸道的防御功能，且雙歧桿菌還可通過對(duì)乳酸的發(fā)酵降低腸道的pH值，從而防止致病性大腸埃希菌定植[18-20]。

腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致腸黏膜屏障功能減弱及促炎癥狀態(tài)[21]。在健康個(gè)體中，腸道屏障由一層完整的上皮細(xì)胞組成，其黏膜屏障可將微生物區(qū)系與宿主免疫細(xì)胞隔離，降低腸道通透性，而活動(dòng)期克羅恩病患者上皮細(xì)胞之間的緊密連接則出現(xiàn)不連續(xù)狀態(tài)[22]，由于存在微生態(tài)失調(diào)，個(gè)體機(jī)會(huì)性感染的可能性顯著增加，導(dǎo)致黏膜低度炎癥，進(jìn)而使腸道通透性增加，屏障功能受損[23]。而腸道屏障受損又會(huì)進(jìn)一步加重腸道炎癥及微生物組成的改變，如此往復(fù)，最終導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生[24]。

腸道菌群失調(diào)還可影響腸道免疫功能。短鏈脂肪酸是腸腔中最豐富的微生物代謝物，被認(rèn)為是腸道微生物區(qū)系影響腸道免疫功能的潛在介質(zhì)，可通過激活巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)促炎因子的表達(dá)，從而引起免疫系統(tǒng)的抗炎作用[25]。在腸道穩(wěn)態(tài)條件下，過氧化物酶體增殖物激活受體γ可通過促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞線粒體中短鏈脂肪酸的β氧化和氧化磷酸化，維持局部缺氧微環(huán)境，而專性厭氧短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌在這樣的環(huán)境中生長旺盛，兼性厭氧腸道病原菌的定植與生長則受到抑制，當(dāng)腸道微生態(tài)失調(diào)時(shí)，兼性厭氧腸桿菌顯著增加[26]，導(dǎo)致宿主腸道免疫系統(tǒng)抗炎作用受損，使腸道處于炎癥易感狀態(tài)?？傊殡S菌群失調(diào)的腸上皮功能受損和異常免疫反應(yīng)可顯著降低腸道對(duì)病原微生物定植的抵抗能力，而IBD患者腸道富含的致病菌群也會(huì)加劇腸道的病理反應(yīng)，各種因素交互作用，導(dǎo)致IBD的發(fā)生。

2 基于“生態(tài)”科赫法則探討微生態(tài)失調(diào)與IBD發(fā)病

生態(tài)學(xué)科赫法則由Vonaesch等[27]提出，即一種腸道生態(tài)系統(tǒng)狀態(tài)對(duì)應(yīng)一種疾病，主要內(nèi)容包括：①在所有受影響的個(gè)體中均發(fā)現(xiàn)了組成相似/特征相似的失衡的微生物區(qū)系；②失衡的微生物區(qū)系可從患病宿主中獲得；③將獲得的失衡菌群放入無菌宿主體內(nèi)，并使宿主處于相似環(huán)境中，宿主可產(chǎn)生類似的癥狀；④在新侵入的寄主中，失調(diào)的微生物區(qū)系組成保持相對(duì)穩(wěn)定。與單一致病原引起相應(yīng)疾病相比，生態(tài)學(xué)科赫法則強(qiáng)調(diào)了微生物區(qū)系的整體作用。利用生態(tài)學(xué)科赫法則，以失調(diào)的腸道微生物區(qū)系作為致病原研究其在IBD發(fā)病中的作用，通過將7種IBD相關(guān)腸道細(xì)菌進(jìn)行組合，可得到一種簡化人類細(xì)菌聯(lián)合體(simplified human microbiota consortium，SIHUMI)。Eun等[28]成功將SIHUMI定植于實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIHUMI可以抗原特異性的方式誘發(fā)小鼠結(jié)腸炎。與單一病原體實(shí)驗(yàn)相比，該實(shí)驗(yàn)已取得進(jìn)步，但與IBD微生物區(qū)系相比，相關(guān)細(xì)菌聯(lián)合體并未體現(xiàn)出共生微生物區(qū)系與致病微生物區(qū)系之間的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，因此仍需進(jìn)行失調(diào)菌群的整體實(shí)驗(yàn)。另據(jù)報(bào)道，人類肥胖相關(guān)的代謝表型可通過微生物區(qū)系移植傳遞給受體小鼠[29]，為IBD相關(guān)微生物區(qū)系移植實(shí)驗(yàn)提供了新思路。Schaubeck等[30]發(fā)現(xiàn)，無菌狀態(tài)下的小鼠不會(huì)發(fā)生克羅恩病樣回腸炎，研究者將克羅恩病回腸炎小鼠的盲腸進(jìn)行疾病相關(guān)失調(diào)菌群分離，并移植至無菌環(huán)境基因易感性小鼠，結(jié)果導(dǎo)致無菌環(huán)境基因易感性小鼠發(fā)生克羅恩病樣回腸炎，表明克羅恩病樣回腸炎可通過失調(diào)的微生物群進(jìn)行傳遞，即微生態(tài)失調(diào)作為致病因素，符合生態(tài)學(xué)科赫法則第2條和第3 條；進(jìn)一步通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，受者小鼠的盲腸菌群組成與供體菌群組成一致，且在新致病小鼠體內(nèi)再次分離出了失調(diào)菌群，符合生態(tài)學(xué)科赫法則第 4 條。該研究結(jié)果首次證明實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下疾病相關(guān)菌群失調(diào)與克羅恩病樣回腸炎的發(fā)生具有因果關(guān)系，為微生態(tài)失調(diào)作為IBD發(fā)病的中心因素提供了有力依據(jù)。以上關(guān)于生態(tài)科赫法則的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，微生態(tài)失調(diào)可導(dǎo)致IBD發(fā)生，而重新恢復(fù)微生物區(qū)系的平衡可誘導(dǎo)疾病的緩解。

3 微生物制劑在IBD治療中的應(yīng)用

調(diào)節(jié)腸道微生物菌群以恢復(fù)宿主與腸道微生物之間的平衡已成為治療IBD的一個(gè)新方向。微生物制劑可以調(diào)節(jié)腸道微生物的組成及代謝活性，同時(shí)還可改善其與黏膜系統(tǒng)之間的關(guān)系。常用的微生物制劑主要包括益生元和益生菌，糞便微生物移植(fecal microbial transplantation，F(xiàn)MT)是近年研發(fā)的新興治療方案。

益生元是一種不可消化的碳水化合物，可選擇性刺激共生微生物的生長并增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，因此在IBD治療中具有重要地位。Rufino等[31]的研究強(qiáng)調(diào)了益生元對(duì)結(jié)腸炎大鼠模型的治療作用，包括促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長、短鏈脂肪酸產(chǎn)生增加、結(jié)腸肉眼病變減少以及炎癥標(biāo)志物的消退等。益生菌則被定義為活的微生物，當(dāng)攝入量足夠時(shí)，對(duì)宿主的健康有益。常見的益生菌包括乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬和布拉酵母屬。在IBD治療中，益生菌的有益作用主要包括抑制病原菌的入侵、改善上皮屏障功能以及免疫調(diào)節(jié)等[32]?；旌鲜褂萌樗峋蚔SL#3(益生菌組合)對(duì)兒童IBD患者具有顯著療效，且VSL#3還可有效誘導(dǎo)活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎緩解[33]。但目前對(duì)IBD中微生物群的了解及監(jiān)測能力均有限，且益生菌相關(guān)臨床試驗(yàn)并未針對(duì)可能導(dǎo)致IBD的微生物失調(diào)進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。因此，根據(jù)IBD的現(xiàn)代微生物發(fā)病機(jī)制模式，應(yīng)用宏觀基因組測序技術(shù)篩選在IBD中具有生物學(xué)可信療效的特定菌株，研究具有針對(duì)性的、特異的益生菌非常必要。

FMT是一種將健康供者的糞便微生物區(qū)系注入受者腸道的治療方法。最初，F(xiàn)MT用于艱難梭菌反復(fù)感染患者的治療并取得顯著療效[34]。FMT旨在恢復(fù)患者腸道微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)平衡，因此有望成為IBD的一種有前景的治療方法。一項(xiàng)雙盲、隨機(jī)、對(duì)照研究顯示，與接受安慰劑(等滲生理鹽水)的潰瘍性結(jié)腸炎患者相比，大劑量、多供體 FMT的應(yīng)用可增加患者腸道微生物多樣性，并可有效地誘導(dǎo)活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎的臨床緩解[35]。另有研究顯示，接受FMT的患者糞便微生物多樣性顯著高于接受等滲生理鹽水的患者，且兩者不良反應(yīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；研究還顯示，在6例捐獻(xiàn)者中，有1例捐獻(xiàn)者的糞便誘導(dǎo)了39%接受FMT的患者潰瘍性結(jié)腸炎緩解[36]。表明FMT治療在IBD患者中可能存在供者-受者相容性效應(yīng)。Fang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，使用新鮮或冷凍供體糞便、給藥途徑以及是否有抗生素使用史等因素對(duì)IBD患者的療效均無影響。表明FMT是一種治療IBD急性發(fā)作的潛在搶救療法，甚至可作為初步的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。但從理論上講，F(xiàn)MT療法可引發(fā)細(xì)菌相關(guān)性疾病，因此其主要局限在于長期療效和安全性問題。FMT最常見的不良反應(yīng)為腹痛，也可出現(xiàn)IBD復(fù)發(fā)、嚴(yán)重感染或死亡等嚴(yán)重不良反應(yīng)。目前IBD相關(guān) FMT治療仍處于初級(jí)階段，將捐獻(xiàn)者與受者的微生物分析相結(jié)合，有助于建立患者的分類標(biāo)準(zhǔn)以及制訂個(gè)性化的微生物治療方案。未來仍需更多研究(包括給藥途徑、供體特性、治療頻率和持續(xù)時(shí)間)以確定IBD的最佳治療方案，從而提高FMT治療IBD的有效性和安全性[38-39]。

4 基于“共生”微生物科赫法則探討IBD的微生物治療策略

共生微生物科赫法則由Neville等[40]提出，即一種有益微生物可改善一種疾病狀態(tài)，主要內(nèi)容包括：①共生菌株與宿主健康有關(guān)，在健康宿主中定期出現(xiàn)，但在患病宿主中較少出現(xiàn)；②該共生菌可以作為培養(yǎng)物分離出來，并在實(shí)驗(yàn)室中生長；③當(dāng)共生菌株被引入新的宿主時(shí)，可以改善或減輕疾?。虎軐⒐采暌牖謴?fù)健康的宿主，可檢測到該共生菌株。利用共生微生物法則，通過補(bǔ)充IBD患者腸道共生微生物，可重新恢復(fù)腸道微生物區(qū)系的平衡，達(dá)到改善疾病狀態(tài)或緩解臨床癥狀的目的。乳酸桿菌和雙歧桿菌菌屬在健康個(gè)體中均具有重要的生理功能，但在IBD患者體內(nèi)其數(shù)量則顯著減少。研究者從健康小鼠糞便中分離出乳酸桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，并利用格拉姆(氏)法進(jìn)行鑒定，同時(shí)將兩類菌屬組合形成個(gè)性化益生菌組合；通過研究葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型發(fā)現(xiàn)，口服個(gè)性化益生菌組合可顯著緩解小鼠的患病體征，個(gè)性化益生菌組合通過有效調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答抑制促炎因子的表達(dá)、促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)[41]。健康個(gè)體腸道微生物區(qū)系中的擬桿菌屬具有重要的生理學(xué)功能，而IBD患者腸道中該菌屬數(shù)量減少。Delday等[42]利用葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)及白細(xì)胞介素-10基因敲除兩種IBD大鼠模型評(píng)估擬桿菌屬中的重要組分多形擬桿菌對(duì)結(jié)腸炎的影響，結(jié)果顯示，在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠模型中，與應(yīng)用多形擬桿菌培養(yǎng)基灌胃的大鼠相比，應(yīng)用多形擬桿菌灌胃的大鼠體重降低顯著改善、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低、炎癥相關(guān)因子的表達(dá)顯著下調(diào)；在白細(xì)胞介素-10基因敲除IBD大鼠模型中，與應(yīng)用多形擬桿菌培養(yǎng)基灌胃大鼠相比，應(yīng)用多形擬桿菌灌胃大鼠體重顯著增加、組織病理學(xué)評(píng)分降低、結(jié)腸的炎癥表現(xiàn)顯著改善，且致炎因子的表達(dá)顯著下調(diào)。以上研究表明，健康個(gè)體的微生物群移植可以通過補(bǔ)充共生菌群恢復(fù)腸道微生物平衡狀態(tài)，減少腸道的炎癥反應(yīng)，這符合共生微生物科赫法則的1～3條。通過共生科赫法則既可逆向突顯腸道微生態(tài)群落在IBD中的致病原作用，也可為IBD患者的微生物治療提供新思路，因此未來通過進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)滿足改良科赫法則非常必要。

5 小 結(jié)

宿主-腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定對(duì)于人體健康至關(guān)重要，而IBD患者腸道呈微生態(tài)失調(diào)狀態(tài)，究竟是微生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致IBD發(fā)病還是IBD發(fā)病引發(fā)微生態(tài)失調(diào)目前尚不清楚。微生物制劑是一種有前景的IBD治療方法，相關(guān)臨床試驗(yàn)也取得了一定進(jìn)展，但選擇適宜菌株、減少不良反應(yīng)、建立個(gè)體化治療策略等方面仍面臨重大挑戰(zhàn)。利用改良科赫法則可以從正向(微生態(tài)失調(diào)可以傳遞疾病)和逆向(重建微生態(tài)平衡可以緩解疾病)兩個(gè)方向突出微生態(tài)失調(diào)在 IBD發(fā)病中的重要地位。因此，未來進(jìn)一步深入研究改良科赫法則與微生物群的關(guān)系，不僅有望揭示微生態(tài)失調(diào)與IBD之間潛在的因果關(guān)系，還可為IBD患者提供更加有效的治療方案。