外周血游離核酸對(duì)消化道腫瘤診斷的應(yīng)用進(jìn)展

郭君燕 綜述，戴一揚(yáng) 審校

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院，浙江 義烏 322000)

消化道腫瘤是臨床常見的一大類腫瘤，在全球發(fā)病率前十位的腫瘤中占50%，且死亡人數(shù)均較高[1]，因此，早期診斷消化道腫瘤對(duì)于改善預(yù)后、減輕社會(huì)壓力和疾病負(fù)擔(dān)具有重要意義。外周血游離核酸(ccfNAs)是指存在于人體血液循環(huán)中的游離于細(xì)胞外的微量?jī)?nèi)源性或外源性核酸片段，包括循環(huán)游離DNA和循環(huán)游離RNA等，本文將從上述2個(gè)方面入手，對(duì)ccfNAs在消化道腫瘤診斷方面的應(yīng)用做一綜述。

1 循環(huán)游離DNA

1.1概述 1948年，MANDELD等[2]首次發(fā)現(xiàn)，在血漿和血清中存在著游離DNA(cfDNA)。cfDNA是一種胞外DNA，主要來(lái)自于細(xì)胞的壞死和凋亡，在外周血中的水平隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，且當(dāng)機(jī)體處于某些疾病或特殊狀態(tài)如創(chuàng)傷、膿毒癥、無(wú)菌性炎癥、氧化應(yīng)激、運(yùn)動(dòng)、腫瘤等情況時(shí)也可升高[3]。在cfDNA中存在著一類位于血液循環(huán)中的來(lái)自腫瘤基因組的DNA片段，稱為循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。ctDNA僅占cfDNA的一小部分(有時(shí)小于0.01%)，半衰期通常小于2 h，主要來(lái)源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞釋放DNA入血及循環(huán)腫瘤細(xì)胞裂解等途徑，可攜帶有突變、插入、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等基因變異特征[4]。

1.2分離與檢測(cè) cfDNA在血清中的含量遠(yuǎn)高于血漿，但由于易受到基因組DNA(gDNA)的污染，現(xiàn)有的證據(jù)更推薦將血漿作為分離檢測(cè)的最佳標(biāo)本[5]，其分離方法有相分離法、基于硅膜的離心柱法和基于磁珠的分級(jí)篩選法。

目前,已有研究表明，在消化道腫瘤患者的外周血中可以檢測(cè)到cfDNA且與健康人群相比存在著DNA片段的差異[6]。其檢測(cè)方法通常包含兩大類：一類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的數(shù)字PCR(dPCR)、微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、乳液微滴數(shù)字分析技術(shù)(BEAMing)等，另一類是以二代基因測(cè)序(NGS)為基礎(chǔ)的標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序(TAm-Seq)、癌癥個(gè)體化深度測(cè)序(CAPP-Seq)、全基因組測(cè)序(WGS)、全外顯子測(cè)序(WES)等技術(shù)。

1.3cfDNA在消化道腫瘤診斷中的應(yīng)用

1.3.1cfDNA濃度 邱蘊(yùn)文等[7]發(fā)現(xiàn)食管癌(EC)患者cfDNA濃度及完整性均高于食管良性病變及健康對(duì)照組，聯(lián)合CEA和SCC后靈敏度可提高至95.6%和94.1%，表明cfDNA濃度可作為食管癌診斷的潛在生物標(biāo)記。QIAN等[8]的研究指出Ⅰ期胃癌(GC)患者的cfDNA水平是健康人群的6倍且診斷效率顯著高于腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA19-9、CA72-4和CA50。此外，YAN等[9]發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)患者的cfDNA水平高于肝硬化患者，且血漿cfDNA與年齡、甲胎蛋白(AFP)聯(lián)合檢測(cè)HCC的診斷效能高于單用cfDNA或AFP。上述多項(xiàng)研究結(jié)果表明，cfDNA濃度在消化道腫瘤患者中顯著升高，單一cfDNA或聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物可作為消化道腫瘤診斷的檢測(cè)指標(biāo)。鄭照正等[10]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌(CRC)患者的cfDNA濃度顯著高于健康對(duì)照組，進(jìn)一步將Ⅰ期、Ⅰ+Ⅱ期、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期以及Ⅰ-Ⅳ期CRC患者分別作為疾病組繪制ROC曲線，其AUC分別為0.667、0.636、0.685及0.753，提示盡管cfDNA濃度具有一定的輔助診斷價(jià)值，但作為早期診斷指標(biāo)的準(zhǔn)確性仍較低，或?qū)?dǎo)致部分患者漏診。

1.3.2基因突變 HU等[11]利用血漿cfDNA檢測(cè)腫瘤突變負(fù)荷(TMB)，發(fā)現(xiàn)右側(cè)結(jié)腸癌較左側(cè)更高，聯(lián)合cfDNA濃度及CEA對(duì)CRC早期檢測(cè)的AUC高于單用CEA，表明cfDNA對(duì)疾病的定位也有一定幫助。QU等[12]開發(fā)了一種名為HCC篩檢的技術(shù)，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)cfDNA突變和血清生物標(biāo)志物，旨在從無(wú)癥狀的HBsAg陽(yáng)性個(gè)體中篩查出HCC患者，該項(xiàng)目在合并肝結(jié)節(jié)和(或)AFP水平升高的患者中檢測(cè)靈敏度為85%，特異度為93%，進(jìn)一步將此方法應(yīng)用于隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)在HBsAg陽(yáng)性且肝臟超聲和血清甲胎蛋白水平正常的個(gè)體中的檢測(cè)敏感度為100%，特異度94%。WANG等[13]發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用KRAS基因突變對(duì)Ⅰ～Ⅳ期胰腺癌患者診斷的敏感性依次為30%、46%、40%及83%，而聯(lián)合CA19-9后其敏感性可提高至82%、82%、83%和89%，表明外周血游離核酸基因突變檢測(cè)聯(lián)合血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)消化道腫瘤的早期診斷也具有一定的潛在價(jià)值。

1.3.3cfDNA甲基化 DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學(xué)改變，通常是指通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用介導(dǎo)CpG二核苷酸胞嘧啶5′碳位甲基化形成5-甲基胞嘧啶的過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中器重要作用。

LI等[14]發(fā)現(xiàn)，CDH1、DAPK、RASSF1A、RAR-β、p16基因甲基化在食管鱗癌(ESCC)患者中的檢測(cè)水平較對(duì)照組高，其中前三者對(duì)ESCC診斷的靈敏度為62.2%～84.4%，特異度為80.0%～93.3%，若聯(lián)合檢測(cè)上述2種或2種以上基因甲基化，在將特異度提高至100%的同時(shí)仍可維持較高的靈敏度。另一項(xiàng)研究表明，CDKN2A、CDH1、DAPK1基因甲基化單獨(dú)診斷GC的靈敏度為28.13%～40.62%，特異度為61.23%～70.21%，三者聯(lián)合后靈敏度和特異性均較高，可作為GC診斷的分子標(biāo)志物[15]。SALIMINEJAD等[16]發(fā)現(xiàn)，P16、RASSF1A、RPRM、RUNX3基因甲基化在GC患者中的表達(dá)水平有所升高，單獨(dú)檢測(cè)RPRM基因和RUNX3基因甲基化對(duì)早期胃癌的診斷有一定幫助，同時(shí)聯(lián)合二者將進(jìn)一步提高診斷水平。

甲基化SEPT9基因(mSEPT9)可參與細(xì)胞的凋亡、增殖等多項(xiàng)過(guò)程，是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，現(xiàn)已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于結(jié)腸癌的早期篩查，但現(xiàn)有的研究也不局限于結(jié)腸癌。SONG等[17]將mSEPT9檢測(cè)運(yùn)用于EC、GC、CRC及HCC患者后發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)敏感性分別為42.6%、47.7%、76.6%及77.7%，提示mSEPT9對(duì)CRC及HCC的檢測(cè)效力相當(dāng)，而在GC和EC中的檢測(cè)效力較弱。而在早期胃癌(EGC)患者中，曹長(zhǎng)琦等[18]發(fā)現(xiàn)，mSEPT9甲基化的陽(yáng)性率為28.4%，與RNF180聯(lián)合后可提高檢測(cè)靈敏度至40.5%。沈志明等[19]發(fā)現(xiàn)，HCC患者的SEPT9甲基化陽(yáng)性率高于膽管細(xì)胞癌和健康對(duì)照組，聯(lián)合GGT對(duì)HCC診斷的靈敏度為88.6%，特異度為68.3%，表明該基因在提高HCC診斷水平的同時(shí)也有助于與膽管細(xì)胞癌的鑒別診斷。OUSSALAH等[20]將mSETP9應(yīng)用于肝硬化患者HCC檢測(cè)的AUC為0.940，其中對(duì)于巴塞羅那分期為A期的患者，AUC為0.863。此外，對(duì)于HCV相關(guān)肝硬化患者而言，mSETP9對(duì)HCC檢測(cè)的準(zhǔn)確性高于AFP，提示在cfDNA甲基化檢測(cè)一定程度上能更靈敏的反應(yīng)腫瘤的信息。

2 循環(huán)游離RNA

2.1概述 CfRNA是指存在于血液、尿液、肺泡灌洗液、胸腹水等體液中的胞外RNA(exRNA)，主要包括信使RNA(mRNA)、小RNA(miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(IncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)等，其中存在于血液中的游離RNA即為循環(huán)游離RNA。cfRNA的來(lái)源目前仍尚未明確，ZHOU等[21]開展的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，exRNA濃度可在缺氧及細(xì)胞代謝速率增加時(shí)升高，這或許可以解釋cfRNA在腫瘤患者中升高的現(xiàn)象，但該發(fā)現(xiàn)還未在在體試驗(yàn)中得到證實(shí)。

2.2分離與檢測(cè) 由于血漿中存在大量的核糖核酸酶，cfRNA通常與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或膜泡結(jié)合以復(fù)合物的形式存在以避免被降解，高純度的RNA分離與檢測(cè)現(xiàn)今仍是一大難題[22]。常用的分離方法主要包括異硫氰酸胍-酚提取法、胍鹽-β巰基乙醇提取法、硅膠膜離心吸附柱法、Trizol法等，檢測(cè)方法與cfDNA相類似，主要為各類PCR及二代測(cè)序(NGS)技術(shù)，其中qRT-PCR是RNA定量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[23]。

2.3CfRNA在消化道腫瘤診斷中的應(yīng)用

2.3.1循環(huán)mRNA 循環(huán)mRNA水平在消化道腫瘤患者與健康人群中的表達(dá)也存在差異。麗敏等[24]發(fā)現(xiàn)，人端粒反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA對(duì)GC診斷具有較高的靈敏度(84.8%)和特異度(82.7%)，與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合后還可以有效降低胃癌漏診率。ABDEL GHAFAR等[25]的研究表明，血清中Metadherin mRNA診斷CRC的敏感性和特異性均高于糞便潛血檢測(cè)及CA199、CEA等腫瘤標(biāo)志物，表明循環(huán)mRNA檢測(cè)在某種程度上優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物。

此外，HAN等[26]發(fā)現(xiàn)，血清RIPK3 mRNA可輔助AFP提高早期肝癌的診斷效率，但目前仍缺乏進(jìn)一步的前瞻性多中心臨床試驗(yàn)。DENG等[27]發(fā)現(xiàn)，MCM2和NUSAP1 mRNA在胰腺癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)水平均較健康人群升高，但仍缺乏血清學(xué)研究證據(jù)，表明循環(huán)mRNA也可作為消化道腫瘤診斷的標(biāo)志物，但仍需要更多的臨床研究結(jié)果證實(shí)。

2.3.2循環(huán)miRNA miRNA作為短單鏈RNA序列，可與靶基因的3′-UTR進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)介導(dǎo)調(diào)控原癌基因、抑癌基因等下游靶基因的表達(dá)，由于與下游靶基因聯(lián)系密切，可將miRNA失調(diào)作為診斷工具早期識(shí)別腫瘤的發(fā)生。ZHANG等[28]的研究顯示，miR-21、miR-223、miR-375可作為食管癌尤其是0～Ⅰ期和Tis～T1期ESCC診斷的生物標(biāo)志物，其AUC分別為0.80、0.73、0.69。2010年TSUJIURA等[29]的研究證實(shí)miR-106b在GC患者中表達(dá)升高，而let-7a則表達(dá)下降，利用miR-106b/let-7a比值對(duì)GC患者診斷的AUC為0.879。有研究提出可通過(guò)聯(lián)合miR-23a-3p、miR-27a-3p、miR-142-5p和miR-376c-3p，這4種miRNA對(duì)CRC進(jìn)行檢測(cè)，在Ⅰ期或Ⅱ期CRC患者中也顯示出較高的診斷性能[30]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，外周血游離核酸檢測(cè)在消化道腫瘤的早期診斷方面具有深遠(yuǎn)而廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但現(xiàn)有研究仍存在一定的局限性。一方面，ccfNAs的檢測(cè)技術(shù)缺乏相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不同的研究在樣本采集、保存、運(yùn)輸及操作方面均有所區(qū)別，使得研究結(jié)果之間存在較大差異；另一方面，多數(shù)研究納入的樣本量過(guò)小，缺乏多中心、大規(guī)模的前瞻性臨床研究，使得研究結(jié)果的臨床應(yīng)用及推廣受到一定限制。目前,ccfNAs的研究正處于高速發(fā)展之中，相信隨著現(xiàn)有技術(shù)及研究的不斷深入，在不久的將來(lái)ccfNAs可廣泛應(yīng)用于臨床，在消化的腫瘤的早期診斷及精準(zhǔn)治療方面發(fā)揮巨大的作用。