馬梨形蟲病及其診斷方法

劉文光

（內(nèi)蒙古鄂爾多斯市伊金霍洛旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017200）

馬梨形蟲病又稱血孢子蟲病或焦蟲病，是通過(guò)媒介蜱傳播而引發(fā)的一種馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲病。該病的主要癥狀為急性溶血性貧血、呼吸受阻、高熱以及黃疸等，若發(fā)生急性感染，馬匹極容易死亡。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提升，已逐步建立一套較為完善的馬梨形蟲病診斷技術(shù)，為馬梨形蟲病的防治奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 馬梨形蟲病概述

1.1 病原特點(diǎn)

馬梨形蟲病是由硬蜱傳播巴貝斯科和泰勒科原蟲引起的血液原蟲病，病原屬頂復(fù)器門梨形蟲綱梨形蟲目巴貝斯科和泰勒科。不同種蟲的形態(tài)特征存在差異。常見的形態(tài)有圓形、梨形、桿形、阿米巴形。它們常寄生于哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)。泰勒蟲還寄生于白細(xì)胞或組織細(xì)胞內(nèi)。石榴體為多核蟲體，是在組織細(xì)胞或白細(xì)胞內(nèi)裂殖生殖形成的裂殖體。常見的病原體包括雙芽巴貝斯蟲和泰勒蟲。

1.1.1 基體形態(tài)

（1）雙芽巴貝斯蟲大型梨形蟲，長(zhǎng)度大于紅細(xì)胞半徑；形態(tài)多樣，包括圓形、梨籽形、球形等；典型蟲體為兩個(gè)梨籽形蟲體，以尖端相對(duì)形成銳角；寄生于紅細(xì)胞中央，染色質(zhì)位于蟲體邊緣；每個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)寄生數(shù)量為1～3個(gè)，特殊情況為6～7個(gè)。

（2）泰勒蟲病 小型梨形蟲，大小為1.5～2.1μm×0.7μm，小于紅細(xì)胞半徑；形態(tài)多樣，包括圓形、梨籽形、球形等。

1.1.2 生活史 梨形蟲以蜱蟲作為傳播媒介，其生活史相對(duì)復(fù)雜。蟲體多選擇在紅細(xì)胞內(nèi)以成對(duì)出芽的形式繁殖。寄生有梨形蟲的紅細(xì)胞被蜱蟲吸血食入后在蜱蟲腸內(nèi)僅在1h內(nèi)就可以完成配子生殖，形成合子。96h內(nèi)蟲體隨血淋巴進(jìn)入蜱蟲的卵內(nèi)，孵化出幼蜱。幼蜱發(fā)育為若蜱，在唾液腺內(nèi)發(fā)育成子孢子。子孢子吸食健康牛馬等哺乳動(dòng)物的血液，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物造成梨形蟲感染。

1.2 流行特點(diǎn)梨形蟲的生活史決定了其通過(guò)終末宿主硬蜱傳播。一種是利用蜱卵傳播，即通過(guò)蜱蟲吸食馬屬動(dòng)物血液而使梨形蟲進(jìn)入蜱蟲體內(nèi)并在其中生長(zhǎng)以及繁殖，待繁殖后期利用蜱卵而傳播給蜱蟲后代，后代在吸血過(guò)程中通過(guò)分泌唾液而將梨形蟲傳遞至馬屬動(dòng)物體內(nèi)。另一種為期間傳播，即幼蜱或者若蜱在吸食感染馬屬動(dòng)物血液后，可迅速成長(zhǎng)為若蜱或成蜱，接著通過(guò)吸食馬屬動(dòng)物血液而傳播。在我國(guó)，每年的3、4月，馬梨形蟲病例逐漸增多，待5月份后其流行逐漸停止。目前，國(guó)內(nèi)已查明的梨形蟲的主要傳播媒介為微小牛蜱，它是馬、牛等動(dòng)物梨形蟲并感染的主要宿主蜱。通過(guò)梨形蟲的生活史可以分析出梨形蟲并主要通過(guò)宿主蜱下一代傳播本病。因此，馬梨形蟲病的發(fā)生與流行頻率與微小牛蜱每年的繁殖代數(shù)保持一致。馬梨形蟲病多見于2歲以內(nèi)的成年馬，死亡率地域成年牛。馬梨形蟲病存在帶蟲免疫的現(xiàn)象，但帶蟲免疫效果表現(xiàn)出不穩(wěn)定、易復(fù)發(fā)的特征。

2 臨床癥狀

馬梨形蟲病的潛伏期為14～20d，初期有稽留熱癥狀。體溫可升至30～41.8℃。主要癥狀為高熱、黃疸、貧血以及心肺機(jī)能障礙。根據(jù)其臨床癥狀的不同可以將其劃分為心肺型以及胃腸型兩種。在發(fā)病初期，兩種類型病例均表現(xiàn)為體溫升高、精神萎靡、食欲不佳、結(jié)膜潮紅、腹痛難耐、顫抖不止。（1）心肺型病例還會(huì)表現(xiàn)為呼吸以及心跳頻率加快，而胃腸型還需表現(xiàn)為咽喉腫痛。發(fā)病中期，病畜體溫超過(guò)40℃，出現(xiàn)稽留熱現(xiàn)象。心肺型病例心率增快并表現(xiàn)為心律不齊，心跳加快、精神不振、食欲減少，可視粘膜黃染，眼瞼部有出血斑點(diǎn)，唇部及舌面存在出血點(diǎn)，尿液顏色為黃棕色，部分公畜陰囊明顯腫大。（2）胃腸型病畜在發(fā)病中期的主要癥狀為流涕及流涎，還表現(xiàn)出先便秘后腹瀉的癥狀，其糞便內(nèi)夾雜有黏液或血液。中期行動(dòng)上出現(xiàn)搖擺不穩(wěn)的癥狀。待發(fā)病后期食欲廢絕、反應(yīng)遲鈍、臥地不起，病例體溫降低，血液日漸稀薄，及時(shí)蚊蟲叮咬亦出血不住，最終因衰竭而死亡。

3 診斷方法

通過(guò)流行特點(diǎn)以及臨床癥狀可進(jìn)行初診，利用實(shí)驗(yàn)室診斷方法可以確診。

3.1 病原組織學(xué)檢測(cè)

3.1.1 血液涂片鏡檢 在馬梨形蟲病急性感染期，血液涂片鏡檢是最為可靠的一種確診方法。此方便操作簡(jiǎn)便，僅需在被檢測(cè)動(dòng)物耳尖部位采集少量血液，待染色后觀察其紅細(xì)胞，即可明確其是否感染有梨形蟲。血液涂片鏡檢方法應(yīng)用較為廣泛。

3.1.2 淋巴結(jié)穿刺檢查法 馬梨形蟲病臨床有淋巴腫大的表現(xiàn)。淋巴結(jié)穿刺檢查法主要用于判斷涂片內(nèi)是否存在裂殖體。其具體操作過(guò)程如下：（1）選擇淋巴腫大部位的皮膚做剪毛、消毒處理；（2）準(zhǔn)備10mL注射器及較粗的針頭；（3）在被檢測(cè)動(dòng)物體表下腫大淋巴結(jié)部位穿刺，抽取淋巴組織；（4）拔出針頭，將內(nèi)容物擠出到載玻片上，（5）用內(nèi)容物制作組織涂片后固定，待染色后放置在顯微鏡下觀察，尋找樣本中是否存在柯赫氏藍(lán)體病原體。若涂片內(nèi)存在裂殖體即可確診。淋巴結(jié)穿刺檢查法對(duì)檢查時(shí)機(jī)要求較為嚴(yán)格，因此通常用于輔助性檢測(cè)。該方法多應(yīng)用于早期馬梨形蟲病的診斷。

3.2 血清學(xué)檢測(cè)

3.2.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 該試驗(yàn)是一種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法，其敏感性強(qiáng)、特異性高、判斷結(jié)果明確，應(yīng)用極為廣泛，適用于疫病中后期的檢測(cè)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)不僅可用于檢測(cè)已感染動(dòng)物，同時(shí)對(duì)健康帶蟲動(dòng)物敏感性亦較高。

3.2.2 免疫熒光抗體檢測(cè) 免疫熒光抗體檢測(cè)方法主要用于診斷外表健康、無(wú)明顯臨床癥狀的帶蟲宿主，其敏感性以及特異性較強(qiáng)，檢測(cè)準(zhǔn)確率較高，缺點(diǎn)為操作復(fù)雜，熒光抗體所需要的成本較高。

3.3 核酸檢測(cè)

3.3.1 PCR檢測(cè)法PCR檢測(cè)法是采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)的方法。PCR通過(guò)一對(duì)特異性引物對(duì)特異性靶基因進(jìn)行體外DNA擴(kuò)增的技術(shù)。Figueroa于1922年建立了檢測(cè)雙芽巴貝斯蟲感染的PCR方法。方式的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了10pg蟲體基因組的量。Aktas等于2005年通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)野外具尾扇頭蜱感染羊泰勒蟲的情況，發(fā)現(xiàn)在192個(gè)受檢蜱中感染羊泰勒蟲的陽(yáng)性率為19.27%。Willams和Welsh對(duì)PCR技術(shù)通過(guò)建立DNA隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。他設(shè)計(jì)2對(duì)引物對(duì)目的片段進(jìn)行兩次擴(kuò)增。這次改進(jìn)提升了PCR技術(shù)測(cè)定雙芽巴貝斯蟲的靈敏性。Liu等于2006年建立巢氏PCR技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)湖北境內(nèi)水牛巴貝斯蟲的流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，確定水牛的巴貝斯蟲染蟲率為10-8時(shí)可檢測(cè)到基因組DNA。Andy Alhassan等于2005年采用18SrRNA建立可同時(shí)檢測(cè)多種梨形蟲的PCR方法。該方法也是依據(jù)擴(kuò)增目的條帶大小的不同來(lái)鑒別梨形蟲的感染情況。這種檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單快速，測(cè)試結(jié)果與其他方法相同。Chul K等用Realtime PCR方法對(duì)來(lái)自加納和巴西兩個(gè)地區(qū)的馬匹進(jìn)行血液原蟲的檢測(cè)，檢出馬泰勒蟲陽(yáng)性檢出率為100%。劉啟生建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，用快速定性檢測(cè)巴貝斯蟲（Babe-sia bovise、Babesia bigemina）。這兩種方法的檢測(cè)靈敏性更，目前以廣泛應(yīng)用于蜱蟲傳播的梨形蟲病的初期診斷，成為馬梨形蟲病臨床快速檢測(cè)的重要手段。與傳統(tǒng)的血液涂片鏡檢方法相比，PCR檢測(cè)法具備更高的敏感性，同時(shí)其操作簡(jiǎn)便快速，應(yīng)用較為普遍。雖然PCR法可快速鑒定目標(biāo)病原體，但是這種方法依賴于檢測(cè)某一部分序列，未足夠精準(zhǔn)量化整個(gè)靶序列，在其具體應(yīng)用過(guò)程中，PCR技術(shù)無(wú)法很好的量化感染程度。

3.3.2 環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新興快速擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)敏感性較強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便并且快速，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于疫病檢測(cè)以及食品安全檢測(cè)當(dāng)中，這一檢測(cè)方法非常適宜開展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以對(duì)PCR技術(shù)存在的部分缺點(diǎn)有效克服，自建立以來(lái)即開始在各種核酸DNA檢測(cè)中得到應(yīng)用，其在馬梨形蟲病的檢測(cè)當(dāng)中亦發(fā)揮了積極的作用。

3.3.3 反向線性印跡技術(shù)（RLB）反向線性印跡技術(shù)也叫斑點(diǎn)印跡法或點(diǎn)印跡法。它是一種以PCR和針探雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)。采用反向線性印跡技術(shù)檢測(cè)馬梨形蟲病的原理與PCR類型，也是根據(jù)設(shè)計(jì)不同特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與針探雜交來(lái)檢定梨形蟲病病原體。謝俊仁建立的反向線性印跡技術(shù)檢測(cè)馬梨形蟲病的方法，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。樣品最多可達(dá)45個(gè)。同時(shí)檢測(cè)樣本的方法提高了馬梨形蟲病的檢出效率，為馬梨形蟲病的鑒別和快速確診奠定了基礎(chǔ)。在調(diào)查馬梨形蟲的流行病學(xué)并對(duì)其進(jìn)行臨床試驗(yàn)診斷時(shí)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)部分動(dòng)物同時(shí)感染有多種血液原蟲病原，此時(shí)即可應(yīng)用反向線性印跡技術(shù)。這一技術(shù)主要是在印跡膜上固定特異性探針，采用放射物質(zhì)標(biāo)記PCR引物，接著擴(kuò)靶DNA，待膜上探針與擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交后，可通過(guò)生物素顯影或者放射顯影的方式以確定PCR產(chǎn)物內(nèi)核酸序列差異。反向線性印跡技術(shù)的在馬梨形蟲病檢測(cè)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)是結(jié)果準(zhǔn)確、檢出快速，局限在于操作技術(shù)難度高、過(guò)程復(fù)雜，對(duì)專業(yè)技術(shù)人員要求極高，不便于基層推廣。

4 綜合診斷

4.1 臨床診斷根據(jù)臨床癥狀結(jié)合病死馬尸體剖檢進(jìn)行確診。病死馬尸體器官組織體有明顯的實(shí)質(zhì)性病變?；祭嫘蜗x病的病死馬匹有全身明顯的實(shí)質(zhì)性器官腫大、出血癥狀。最為典型的癥狀是胃黏膜腫脹，出現(xiàn)血斑，有高粱至蠶豆大面積的潰瘍發(fā)生。病變部位邊緣隆起，呈現(xiàn)紅色。中間凹，呈灰色。感染嚴(yán)重的馬匹病灶潰瘍面積超過(guò)胃部的50%。其中以泰勒蟲病潰瘍面積≥50%的癥狀極為典型。

4.2 特征性診斷根據(jù)臨床癥狀結(jié)合病死馬實(shí)體器官組織抹片檢查找到石榴體確診。

4.3 病原學(xué)診斷根據(jù)臨床癥狀結(jié)合血液病原檢查蟲體的結(jié)果確診。發(fā)病后1～2d高熱期時(shí)可采血進(jìn)行血液病原學(xué)檢查。馬梨形蟲病在臨床上沒(méi)有血紅蛋白尿的特征，黏膜黃疸癥狀也相對(duì)不明顯。

4.4 限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)也是一種建立在PCR基礎(chǔ)上的病原學(xué)檢測(cè)基礎(chǔ)。該技術(shù)也需要通過(guò)設(shè)計(jì)合適的擴(kuò)增引物，通過(guò)擴(kuò)增片段的限制性內(nèi)切酶識(shí)別。它是目前馬梨形蟲病臨床檢測(cè)診斷中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)是敏感性好，可檢測(cè)多種媒介內(nèi)的梨形蟲病原體感染情況。該方法的實(shí)施是在PCR的基礎(chǔ)上，對(duì)不同的屬和種以不同的酶內(nèi)切后電泳條帶的不同加以分別。Gebels等于2000年用該技術(shù)對(duì)牛巴貝斯蟲、牛泰勒蟲進(jìn)行檢測(cè)。Jefferies等于2007年用該技術(shù)來(lái)對(duì)狗梨形蟲進(jìn)行鑒定。徐宗可用PCR-RFLP技術(shù)改進(jìn)后對(duì)羊梨形蟲進(jìn)行鑒定。PCR-RFLP技術(shù)的發(fā)展為梨形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查、致病機(jī)理研究及診斷奠定了基礎(chǔ)。

PCR-RFLP技術(shù)在多類型梨形蟲混合感染的鑒定與診斷方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)較為突出。其局限性在于鑒定操作工作量大。相對(duì)于傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)，PCR-RFLP技術(shù)在梨形蟲臨床診斷方面的技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。PCR-RFLP技術(shù)最為重要的價(jià)值在于發(fā)現(xiàn)了梨形蟲病的新蟲種與新基因型。在這方面的研究，可通過(guò)與DNA檢測(cè)技術(shù)的綜合性研究來(lái)實(shí)現(xiàn)。