奶牛隱性乳房炎診斷方法研究進展

苗永山，金振華，王 歡

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

乳房炎是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失最為嚴(yán)重的疾病之一。奶牛發(fā)生乳房炎后不僅其產(chǎn)奶量、乳汁品質(zhì)均有不同程度的下降，治療費用增加，而且炎性乳汁還危害著公共衛(wèi)生和消費者的健康，重癥乳房炎患牛因產(chǎn)乳量的明顯減少甚至失去泌乳能力而被淘汰，因此，做好奶牛奶牛乳房炎精確診斷與早期預(yù)警對乳房炎防控具有重要意義。長期以來，一些學(xué)者一直致力于奶牛乳房炎的診斷研究，一些新的診斷方法不斷涌現(xiàn)。本文介紹了近年來有關(guān)奶牛乳房炎診斷的研究成果，旨在為奶牛乳房炎診斷提供技術(shù)參考。

1 乳汁體細胞診斷

乳腺內(nèi)體細胞為免疫細胞及其它細胞的統(tǒng)稱。健康奶牛乳汁中的體細胞數(shù)較少，主要由巨噬細胞、淋巴細胞、嗜中性白細胞和乳腺上皮細胞等組成。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺感染時，炎癥因素能夠?qū)е氯橹械捏w細胞數(shù)急劇增多，而且乳汁內(nèi)的體細胞種類及其數(shù)量發(fā)生很大的變化，其中中性粒細胞占絕大多數(shù)，占95%～99%。由于乳腺炎病原、病癥，以及感染階段的不同，乳汁中體細胞種類與數(shù)量也存在著明顯的差異，其中，尤為嗜中性白細胞、淋巴細胞和巨噬細胞的變化明顯。一般情況下，乳汁中巨噬細胞的增多預(yù)示乳房發(fā)生慢性炎癥、非化膿性炎癥；淋巴細胞的增多預(yù)示為慢性炎癥或發(fā)生病毒性感染；嗜中性白細胞增多則預(yù)示為急性炎癥及炎癥早期。

奶牛乳汁體細胞數(shù)能相對準(zhǔn)確地反映乳腺炎癥的嚴(yán)重程度，并被廣泛作為奶牛乳腺炎的診斷指標(biāo)。IDF推薦使用體細胞檢測和細菌學(xué)檢測作為判定奶牛乳房炎的方法。隨著DHI技術(shù)在國內(nèi)牧場的逐漸普及，體細胞數(shù)的快速檢測在奶牛乳房炎診斷，特別是隱性乳房炎診斷中發(fā)揮了重要作用。在十二烷基磺酸鈉等陰離子表面活性劑和堿性物質(zhì)的作用下，脂類物質(zhì)乳化，乳中體細胞細胞膜被破壞，并釋放出細胞DNA，DNA與其作用使乳汁產(chǎn)生沉淀或形成凝膠狀。根據(jù)沉淀或凝膠的多少，能夠間接判定體細胞數(shù)的數(shù)量，從而診斷乳房的感染嚴(yán)重程度。根據(jù)此原理相繼建立了顯微鏡直接計數(shù)法、體細胞儀計數(shù)法、熒光電子細胞計數(shù)法、粒子計數(shù)法、白細胞分類計數(shù)法等直接計數(shù)檢驗法，以及加利福尼亞乳房炎試驗、苛性鈉凝乳試驗法、過氧化物酶試驗等體細胞間接檢驗法，并用于隱性乳房炎的診斷。

隨著研究深，一些新的診斷方法相繼出現(xiàn)。體細胞分型指數(shù)是指淋巴細胞與嗜中性粒細胞總數(shù)占體細胞數(shù)的比例，安朋朋等研究了DSCC的變化規(guī)律，以及乳房炎致病菌對DSCC的影響，結(jié)果表明：體細胞評分與DSCC存在極顯著相關(guān)性，且隨著體細胞評分值的升高，DSCC波動范圍逐漸減小；頭胎牛、4胎以上奶牛的DSCC值顯著高于2～3胎牛；細菌感染陽性樣品DSCC（77.21%）極顯著高于陰性樣品（69.33%），但傳染性致病菌感染與環(huán)境性致病菌感染的樣品間DSCC無顯著差異，由此表明，DSCC對診斷乳房炎具有一定價值。

2 酶學(xué)診斷

在奶牛乳腺發(fā)生病原性感染后，致病病原會引起乳腺組織發(fā)生一系列的炎性變化，并動員大量免疫細胞至乳腺組織內(nèi)，其中90%為嗜中性多形核白細胞，大量嗜中性多形核白細胞進入炎性乳腺，并吞噬入侵的病原，致使體細胞數(shù)持續(xù)升高。奶牛發(fā)生乳房炎時，乳腺內(nèi)的炎性細胞釋放的炎性成分將造成乳腺微血管的通透性增加，破壞血乳屏障，血液中的體細胞、溶酶體酶和急性期蛋白等成分滲入至牛乳中，并導(dǎo)致N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等一些酶的生物活性升高。NAG存在于乳腺組織和白細胞中，當(dāng)乳腺細胞受到損傷或白細胞數(shù)升高時，NAG活性會顯著升高，因此，NAG活性與奶牛隱性乳房炎發(fā)生密切相關(guān)，其活性能夠反應(yīng)乳腺是否存在感染的風(fēng)險。NAG能夠預(yù)示分泌型細胞的狀態(tài)及乳腺炎發(fā)病程度，目前，已有商業(yè)化的NAG測定試劑盒，并用于隱性乳房炎的診斷中。

髓過氧化物酶是氧依賴性殺菌系統(tǒng)的重要組成部分。堿性磷酸酶是機體防御感染的因子之一。劉小倩等在研究長期飼喂高精料可否致奶牛發(fā)生內(nèi)源性乳房炎的試驗中，應(yīng)用ELISA試劑盒測定了乳及乳腺組織中NAG、AKP、MPO、NAG及LPS炎性指標(biāo)，試驗表明，牛乳中NAG、AKP活性顯著上升，LPS含量極顯著升高，其它指標(biāo)差異不顯著，結(jié)果說明NAG、LPS和AKP可作為隱性乳房炎的診斷指標(biāo)。印度學(xué)者建立了一種斑點試驗，根據(jù)奶樣中胰蛋白酶抑制劑的檢測結(jié)果診斷隱性乳房炎，該方法敏感性和特異性分別為88.2%和89.8%。Ball等通過檢測N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶檢測隱性乳房炎；黃權(quán)利等認為乳房炎乳的LDH、ACP、GOT和GPT活性均增加。葛影影等也證實，奶牛血清ALB水平及NAG活性的顯著變化與乳房炎的感染和發(fā)生關(guān)系密切，故這些指標(biāo)可作為診斷奶牛乳房炎和乳腺組織損傷程度的血清學(xué)敏感指標(biāo)。

髓過氧化物酶是PMN、單核細胞、巨噬細胞釋放的嗜天青顆粒的主要成分，已經(jīng)證實，MPO可作為乳房炎的診斷指標(biāo)。瑞典學(xué)者制備了奶牛MPO單克隆抗體，建立了針對牛乳MPO的MPO-ELISA方法。牛國慶等選取隱性乳房炎牛，進行奶樣MPO測定試驗。結(jié)果奶樣中SCC和MPO濃度的相關(guān)系數(shù)值為0.257，隨著SCC增高，MPO水平也增高，兩者具有正相關(guān)性。MPO與CMT的相關(guān)系數(shù)為0.546，相關(guān)顯著。結(jié)果表明，奶液中MPO可作為隱性乳房炎指示物，利用ELISA方法檢測奶樣中MPO的方法快速、簡便，可對奶牛隱性乳房炎做出早期診斷。

3 血清學(xué)炎性蛋白指標(biāo)

炎癥會激發(fā)動物機體產(chǎn)生急性炎性反應(yīng)。在炎癥過程中急性期蛋白含量將顯著升高。奶牛發(fā)生隱性乳腺炎后，結(jié)合珠蛋白、α1-酸性糖蛋白、淀粉樣蛋白A等會隨著炎癥的發(fā)展而增加，且C-反應(yīng)蛋白也與SCC具有一定相關(guān)性。在急性炎癥反應(yīng)期，動物在肝臟中血合成清淀粉樣A蛋白、結(jié)合珠蛋白（Hp）等急性期蛋白抵御感染。結(jié)合珠蛋白，又稱觸珠蛋白，是一種酸性糖蛋白。健康牛血清Hp濃度低于20mg/L，乳房炎牛2d內(nèi)升至2g/L。Hp還可作為子宮炎、腸炎、肺炎等指征。血清淀粉樣蛋白A在急性炎癥刺激下，血清SAA1、SAA2水平在5～6 h升高約1000倍。α1-酸性糖蛋白，又稱類黏蛋白，蔣磊選取健康奶牛和不同發(fā)病程度隱性乳房炎患牛，采用α1-酸性糖蛋白ELISA試劑盒測定各組乳清樣品中α1-酸性糖蛋白的含量，結(jié)果顯示，隱性乳房炎組奶牛乳清中α1-酸性糖蛋白的含量顯著或極顯著高于健康組奶牛，且隨著奶牛隱性乳房炎病情的加重及乳中體細胞數(shù)的增加，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈現(xiàn)出遞增趨勢。研究證實，乳腺炎癥引發(fā)的乳腺損傷及乳中體細胞數(shù)增加與乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈正相關(guān)性。研究證實，乳房炎期間乳清中轉(zhuǎn)鐵蛋白和白蛋白含量升高，而α乳清蛋白和β乳球蛋白含量降低。程郁昕等研究表明，奶牛血清中α乳蛋白與體細胞計數(shù)相關(guān)性為0.60，血清中乳蛋白可作為乳房炎診斷依據(jù)。奶牛血清或乳汁中結(jié)合珠蛋白、血清淀粉樣蛋白和α-酸性糖蛋白等在乳房炎診斷中具有重要價值。