昆明犬IGF1R基因克隆及組織表達分析

韋云芳，李飛翔，星 云，李居東，萬九生，陳方良，陳 超

(1. 公安部昆明警犬基地，昆明 650204；2. 警犬技術公安部重點實驗室，昆明 650204；3. 云南農(nóng)業(yè)大學動科學院，昆明 650201)

【研究意義】昆明犬是中國唯一一個國產(chǎn)工作犬品種，經(jīng)過半個多世紀的培育，于2007年審定成為犬類國家級畜禽新品種。作為中國寶貴的工作犬犬業(yè)種質(zhì)資源，昆明犬在軍警工作犬領域具備極為廣泛的應用并形成了較大的影響力，成為了中國警犬的驕傲。近年來，隨著現(xiàn)代分子育種技術的不斷發(fā)展與進步，探明昆明犬生長發(fā)育遺傳變異機理進而應用分子育種技術進一步改良提高其生長發(fā)育性能也一直是繁育工作者所追求的目標。胰島素樣生長因子受體(Insuline-like growth factor 1 receptor,IGF1R)是一種細胞表面跨膜受體，屬于酪氨酸激酶受體超家族，其結(jié)構與胰島素受體非常相似，在胰島素樣生長因子(IGFs)的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著重要作用[1]。因此，探究昆明犬IGF1R基因序列結(jié)構特征及其組織表達模式，為探究IGF1R基因在昆明犬上生長發(fā)育的調(diào)控機制及分子遺傳育種的相關研究提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】IGF1R是IGFs家族中兩類生長因子IGF1和IGF2的主要結(jié)合受體，IGF1和IGF2通過與IGF1R結(jié)合來啟動胞內(nèi)相關信號的級聯(lián)反應，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等生理代謝過程，在胚胎和出生后機體生長發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF1基因突變會導致動物胚胎生長不足及生長發(fā)育遲緩等，表現(xiàn)為侏儒癥[4-5]。IGF2基因的功能性失活也會導致胚胎發(fā)育阻滯或生長遲緩[6]。IGF1R缺乏會導致人和小鼠生長發(fā)育受阻、體型重量減小[7-9]，而過表達則可能導致細胞的腫瘤轉(zhuǎn)化[10]。針對家犬的研究發(fā)現(xiàn)，IGF1通路在控制犬體型大小上發(fā)揮著關鍵作用，攜帶IGF1基因突變的犬體型較小，其體內(nèi)的IGF1激素水平也顯著降低[11]。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)在很多迷你型犬類身上同時存在IGF1R基因的突變[12]?！颈狙芯壳腥朦c】犬IGF1R基因位于3號染色體，基因全長361 103 bp，由21個外顯子構成(CanFam3.1, GCF_000002285.3)。盡管IGF1R作為調(diào)控動物生長發(fā)育的候選基因已在諸多動物中被克隆，然而目前尚未發(fā)現(xiàn)昆明犬有關IGF1R基因克隆及表達的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】作為對犬生長發(fā)育性狀有調(diào)控作用的重要因子，分析IGF1R基因結(jié)構功能并闡明其表達規(guī)律，在犬類的遺傳繁育和品種改良中具有重要意義。文章以昆明犬為研究對象，首次克隆獲得了昆明犬IGF1R基因編碼區(qū)序列，并對其結(jié)構、表達水平及編碼蛋白功能進行了初探，這些基本數(shù)據(jù)將有利于后續(xù)進一步對犬生長發(fā)育相關研究的開展與探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試的3頭動物選自公安部昆明警犬基地，為2.5月齡體況良好幼犬。犬只麻醉后立即取其心、肝、脾、肺、腎、肌肉組織于液氮凍存。主要試劑為TRIzol RNA分離試劑(美國Invitrogen公司生產(chǎn))；Taq酶、dNTP及Buffer等開展PCR實驗的試劑(上海生工生物股份有限公司生產(chǎn))；pMD18-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細胞等分子克隆相關試劑(TaKaRa公司生產(chǎn))；反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR相關試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn))。

1.2 引物設計與合成

以NCBI中公布的家犬IGF1R基因序列(XM_545828.6)為參考序列，利用Primer 5.0設計引物?；贗GF1R基因CDS區(qū)較長，分成5個片段依次進行引物設計。另外，以GAPDH基因(NM_001003142.2)為內(nèi)參基因，設計qRT-PCR引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物相關信息見表1。

表1 引物信息

1.3 總RNA提取及cDNA合成

上述昆明犬6種組織樣本的總RNA按照TRIzol RNA分離試劑說明書中的步驟進行提取，獲得的RNA進行質(zhì)量檢測后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訰NA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA。

1.4 CDS擴增、克隆與測序

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板來開展昆明犬IGF1R編碼的CDS序列的擴增，PCR體系(總25 μL)：含12.5 μL PCR Buffer(2×)，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，1 μL反轉(zhuǎn)錄所得cDNA(100 ng/μL)，0.2 μLTaq酶(5 U/μL)，最后加DNase-free ddH2O 10.1 μL。開展擴增的程序為預變性(95 ℃) 3 min；變性(94 ℃)30 s，分別依據(jù)表1中各引物的退火溫度退火30 s，延伸(72 ℃) 40 s，共32個循環(huán)；后延伸(72 ℃) 5 min；最終4 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，正確條帶通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行切膠回收，并與pMD18-T克隆載體進行連接轉(zhuǎn)化，鑒定后選擇陽性單克隆進行測序。

1.5 生物信息學分析

使用DNAStar比對IGF1R基因核苷酸序列同源性并構建系統(tǒng)進化樹。家犬(Canislupusfamiliaris，XM_038661228.1)、赤狐(Vulpesvulpes，XM_026001628.1)、牛(Bostaurus，NM_001244612.1)、小鼠(Musmusculus，NM_010513.2)、雞(Gallusgallus，NM_205032.3)、羊(Ovisaries，XM_027957015.2)、豬(Susscrofa，NM_214172.1)及貓(Feliscatus，XM_023254966.1)的序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫。參照文獻中的方法來進行該基因所編碼蛋白的理化參數(shù)、細胞定位及結(jié)構特征等的分析[13]。

1.6 昆明犬IGF1R基因表達檢測

通過qRT-PCR方法檢測IGF1R基因在2.5月齡昆明犬心、肝、脾、肺、腎及肌肉共6種組織中的表達量，用內(nèi)參基因GAPDH對昆明犬不同組織的表達水平進行定量結(jié)果分析，每個樣品平行測定3次。20 μL反應體系，加入2.0 μL cDNA模板，各0.4 μL的上、下游引物(5 μmol/L)，10 μL PCR Master Mix(2×)，0.4 μL Rox Reference Dye(50×)，RNase-free H2O補足剩余體系。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法來處理數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析結(jié)果的差異性，差異性顯著的判斷標準為P<0.05，極顯著的判斷標準為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF1R基因分段克隆與測序

以cDNA為模板進行PCR，得到昆明犬IGF1R基因CDS區(qū)各片段，擴增產(chǎn)物長度分別約889、900、925、925、695 bp(圖1)。通過測序分析得到4104 bp CDS序列，編碼1367個氨基酸。

M：DL2000 DNA Marker；1～5：PCR擴增的IGF1R基因CDS區(qū)各片段M：DL2000 DNA Marker; 1-5：PCR amplified fragments of CDS region of IGF1R gene圖1 昆明犬IGF1R基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification products of IGF1R gene in Kunming dogs

2.2 GF1R基因同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構建

把昆明犬IGF1R基因序列與家犬、赤狐、貓等8個物種的核苷酸序列進行同源性分析顯示，昆明犬IGF1R基因核苷酸序列與家犬的同源性為100%，與同為犬科動物赤狐的同源性也較高(99.3%)，而與雞的同源性較低(78.8%，圖2)。系統(tǒng)進化樹(圖3)顯示，昆明犬與家犬聚為一枝，與赤狐聚為一類，與雞相距最遠，親緣關系也較遠，從而直觀地展示出不同動物間進化關系的差異，符合動物實際進化歷程。

圖2 不同物種IGF1R序列比對Fig.2 Alignment of IGF1R nucleotide sequences in different species

圖3 昆明犬與其它動物IGF1R基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of IGF1R gene in Kunming dog and other animals

2.3 昆明犬IGF1R蛋白結(jié)構和功能分析

2.3.1 理化性質(zhì)和疏水性 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)由組成它的氨基酸所決定，昆明犬IGF1R蛋白氨基酸組成分析表明，IGF1R蛋白分別具有149個帶正電荷(Arg+Lys)和175個帶負電荷的殘基數(shù)(Asp+Glu)(表2)，推測IGF1R蛋白可能帶負電。理化性質(zhì)分析表明其理論等電點為5.58(表3)，分子質(zhì)量為154 890.07 ku，屬不穩(wěn)定的親水性蛋白。蛋白疏水性分析(圖4)再次證實昆明犬IGF1R屬親水性蛋白(親水性殘基數(shù)高于疏水性殘基數(shù))，最大疏水值(3.189)位于第944位氨基酸處，最小疏水值(-3.567)位于第737位氨基酸處。

表2 昆明犬的IGF1R氨基酸

表3 昆明犬IGF1R蛋白理化性質(zhì)

圖4 昆明犬IGF1R疏水結(jié)構預測Fig.4 Prediction of hydrophobic structure of IGF1R in Kunming dogs

2.3.2 IGFIR蛋白跨膜區(qū)、信號肽預測與亞細胞定位分析 SignalP-5.0在線分析顯示,該蛋白信號肽剪切位點在第30～31位氨基酸間，概率為0.9378，表明其屬分泌型蛋白(圖5)。利用TMHMM-2.0分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在1個跨膜結(jié)構，位置處于第936～958位氨基酸間，前935位氨基酸處于膜外，第959～1367位氨基酸處于膜內(nèi)(圖6)，說明昆明犬IGF1R屬跨膜蛋白，與跨膜運輸調(diào)節(jié)有關。通過軟件PSORT分析發(fā)現(xiàn)，昆明犬IGFIR定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及質(zhì)膜上，三者比例均為33.3%，說明昆明犬IGF1R蛋白非常均勻地分布于這3個膜結(jié)構細胞器中，可能在跨膜信號識別中起重要作用。

圖5 昆明犬IGF1R蛋白的信號肽剪切位點預測Fig.5 Prediction of signal peptide cleavage sites of IGF1R protein in Kunming dogs

圖6 昆明犬IGF1R蛋白跨膜結(jié)構預測Fig.6 Transmembrane structure prediction of IGF1R protein in Kunming dogs

2.3.3 磷酸化位點預測 利用在線軟件NetPhos 3.1預測發(fā)現(xiàn)，昆明犬IGF1R蛋白含123個磷酸化位點(圖7)，分別為絲氨酸(Ser)63個、蘇氨酸(Thr)38個，酪氨酸(Tyr)22個，這些位點為蛋白發(fā)生磷酸化作用的潛在位點。

圖7 昆明犬IGF1R磷酸化潛能分析Fig.7 Analysis of phosphorylation potential of IGF1R in Kunming dogs

2.3.4 蛋白二級結(jié)構和三級結(jié)構的預測 昆明犬IGF1R蛋白二級結(jié)構的分析由在線軟件SOPMA完成，結(jié)果顯示該蛋白無規(guī)則卷曲(48.43%)和α-螺旋(25.24%)占比較多，其次是延伸鏈，占20.99%，β-轉(zhuǎn)角占5.34%(圖8)。SMART分析表明，昆明犬IGF1R具有IGF受體蛋白特征性結(jié)構域(圖9)，包括1個半胱氨酸富集區(qū)(FU, 227～270)，3個纖連蛋白型結(jié)構域(FN3, 489～914)，1個跨膜區(qū)(936～958)和1個酪氨酸蛋白激酶區(qū)(Tyrkc, 999～1266)。使用SWISS-MODEL預測的該蛋白三級結(jié)構見圖10，該蛋白預測結(jié)果與二級結(jié)構預測結(jié)果相符，蛋白結(jié)構主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成。

最長豎線：α-螺旋；次長豎線：延伸鏈；次短豎線：β-轉(zhuǎn)角；最短豎線：無規(guī)則卷曲The longest vertical line: Alpha helix; The second-long vertical line: Extended chain; The secondary short vertical line: Beta turn; The shortest vertical line: Random coil圖8 IGF1R二級結(jié)構預測Fig.8 IGF1R secondary structure prediction

圖9 昆明犬IGF1R蛋白功能結(jié)構域預測Fig.9 Functional domain prediction of IGF1R protein in Kunming dogs

圖10 IGF1R三級結(jié)構預測Fig.10 Predicted tertiary structure of Kunming dog IGF1R protein

2.4 IGF1R基因在昆明犬組織中的表達模式分析

IGF1R基因在昆明犬6種組織(心、肝、脾、肺、腎和肌肉)中的相對表達量具有明顯差異(圖11)，以肺臟為參照，雖然該基因在昆明犬不同組織中均有表達，但其在肝臟中的表達量最低(P<0.01)，在肌肉中也呈較低表達水平(P<0.01)，在脾臟中則呈低表達水平(P<0.01)，而在腎臟和心臟中呈高表達水平，且無顯著差異(P>0.05)。

**表示差異極顯著(P<0.01)** mean extremely significant difference (P<0.01)圖11 昆明犬6種組織中IGF1R基因的相對表達量Fig.11 Relative expression levels of IGF1R gene in six tissues of Kunming dogs

3 討 論

IGF1R是調(diào)節(jié)生長軸激素受體級聯(lián)反應的效應分子，是IGF1和IGF2發(fā)揮功能的關鍵受體，其作為GH-IGFs軸信號傳導的主要介導者，在機體新陳代謝的多種生物過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。例如，敲除IGF1R基因會導致小鼠胚胎時期肌肉發(fā)育不足或發(fā)生死亡[7]，肝組織再生能力下降、肺部發(fā)育出現(xiàn)異常[2,16]，相反，肌肉中IGF1R的過表達則出現(xiàn)肌肉發(fā)育過度、異常肥大[7]。有研究認為，IGF1R基因結(jié)構的變異、轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的降低可能是導致機體矮小的原因[17]，例如在小鼠和人上都已證實IGF1R基因突變會導致個體體型減小或重量降低及生長發(fā)育遲緩受阻[7,9]。目前，豬[18]、牛[19]、羊[20]、禽類[21]及水產(chǎn)動物[22]的IGF1R基因研究相對較多，而對于犬的IGF1R基因結(jié)構功能分析及表達模式的研究尚未見報道。

本研究克隆獲得昆明犬IGF1R基因完整CDS序列4104 bp，編碼1367個氨基酸。昆明犬IGF1R基因核苷酸序列與其它動物的同源性比對發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列與家犬同源性為100%，與同為犬科動物赤狐的同源性高達99.3%，初步說明IGF1R基因進化在犬科動物中是相當保守的。序列同源性在一定程度上反映了物種間親緣關系的遠近，本實驗中IGF1R基因序列同源性分析結(jié)果與系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果一致。同時，昆明犬IGF1R基因序列與其他哺乳動物如與貓、豬也具有較高的同源性(分別為94.3%、91.7%)，而與禽類雞的同源性較低(78.8%)，存在較大差異，說明其與哺乳動物的關系較禽類距離更近、保守性更高，推測該基因在哺乳動物應具備相似功能。IGF1R基因核苷酸序列在昆明犬與其它動物的系統(tǒng)進化關系與它們的分類學的地位、物種進化的結(jié)果相一致。磷酸化潛能的預測分析顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)具備潛在的123個磷酸化位點，這些不同的位點發(fā)生磷酸化作用后，將可能引發(fā)胞內(nèi)結(jié)構域裝配信號的改變，從而使多種途徑的信號轉(zhuǎn)導發(fā)生改變，最終導致細胞活動產(chǎn)生變化[23]。IGF1R蛋白功能結(jié)構域分析結(jié)果顯示，約400個氨基酸組成了昆明犬IGF1R的3個Ⅲ型纖連蛋白(FN3)結(jié)構域，該區(qū)域會有DNA、肝素等物質(zhì)在此結(jié)合[24]；1個富含半胱氨酸的FU代表furin-like結(jié)構域可與配體結(jié)合，導致酪氨酸殘基產(chǎn)生自身磷酸化，進而激活胞內(nèi)MAPK、P13K-KT等信號通路的傳導，由此調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡等[25]；位于936～958氨基酸位置的跨膜區(qū)證實IGF1R屬跨膜蛋白受體；酪氨酸激酶(TyrKc)結(jié)構域具備多種結(jié)合位點，可促發(fā)胞內(nèi)發(fā)生多種催化反應[22, 26]。研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的豬、綿羊IGF1R基因上存在大量的SNPs，其中部分突變會導致IGF1R蛋白構象的改變和表達的差異，進而對機體的生長性狀產(chǎn)生顯著影響，或造成品種體型上差異較大[27-28]。奶牛上的研究同樣發(fā)現(xiàn)IGF1R基因遺傳變異與產(chǎn)奶量、乳脂及乳蛋白性狀顯著相關，有望作為奶牛基因選育的分子標記[29]。

本研究對昆明犬IGF1R基因在多種組織中的表達模式進行了初探，結(jié)果顯示該基因在多種重要器官組織中均有表達，IGF1R的廣泛分布提示IGFs的功能除了通過內(nèi)分泌途徑實現(xiàn)，還有自分泌或旁分泌途徑；同時IGF1R高度富集于2.5月齡昆明犬心臟、肺臟及腎臟組織，提示IGF1R在幼犬的主要臟器生長發(fā)育中起重要作用。IGF1R在肺中高度富集，但在肝中的表達水平極低，這與南江黃羊的研究結(jié)果存在相似性[20]，而IGF1R在心臟和腎臟的高表達結(jié)果又與大花白及長大二元雜豬的表達模式相一致[30]。IGF1R基因在昆明犬不同組織的表達特征，例如在心臟、肺臟及腎臟中的相對高表達、肝組織中的相對低表達，可能提示其對重要器官的生長發(fā)育及功能的維持具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究首次克隆了昆明犬IGF1R基因CDS區(qū)全長序列，分析了其組織表達。研究發(fā)現(xiàn)，IGF1R基因編碼區(qū)序列在生物進化過程中具有較強的保守性。昆明犬IGF1R蛋白包含3個纖連蛋白型結(jié)構域，1個半胱氨酸富集區(qū)和1個酪氨酸激酶結(jié)構域，屬親水性跨膜蛋白，其均勻地分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及質(zhì)膜上這3個膜結(jié)構細胞器中。IGF1R基因在昆明犬6個組織中均有表達，其中心臟、肺臟及腎臟組織中的表達量較高。IGF1R是一類重要的生長調(diào)控因子，本研究對昆明犬IGF1R的克隆、序列和組織表達分析進一步深化對犬類IGFs受體分子的認識，也為昆明犬生長性狀分子標記輔助育種的研究提供參考。