紅豆草苗期耐鹽種質(zhì)篩選及綜合評(píng)價(jià)

劉 鑫，汪 堃，梁鵬飛，魏少萍，陳 潔，李景峰，南麗麗

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

【研究意義】土壤鹽漬化的程度嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)與發(fā)育。在我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展進(jìn)程中，鹽漬化土壤限制植物的營(yíng)養(yǎng)吸收，影響植物的生長(zhǎng)，嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)的發(fā)展[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鹽脅迫下，植物的形態(tài)特征和生理特性等會(huì)發(fā)生一系列變化。研究發(fā)現(xiàn)，開展植物耐鹽能力篩選的兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期分別在萌發(fā)出苗[2]和幼苗生長(zhǎng)階段[3]。當(dāng)植物受到鹽分脅迫時(shí)，根系是植物表現(xiàn)最敏感且受害最嚴(yán)重的器官[4]。陳曉晶等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期，耐鹽品種“白燕2號(hào)”燕麥其地上部及地下部干重、根總長(zhǎng)度、表面積、體積及平均直徑均高于鹽敏感品種“白燕5號(hào)”燕麥。鹽脅迫下，植物為維持其生長(zhǎng)平衡，通常采用調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)、改善離子分布、清除多余活性氧等方式以應(yīng)對(duì)脅迫[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】紅豆草(Onobrychisviciaefolia)是寒旱地區(qū)廣泛種植的優(yōu)質(zhì)豆科牧草。目前關(guān)于紅豆草的研究主要集中在改土效益[7]、病害[8]、干旱[9]、鹽漬[10]、霜凍[11]、耐低磷[12]、草產(chǎn)量及品質(zhì)[13]等方面，但不同紅豆草材料，其耐鹽能力存在顯著差異[14-15]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)以9份紅豆草為供試材料，研究鹽脅迫對(duì)紅豆草幼苗生長(zhǎng)及生理的影響，確定不同材料耐鹽性差異，為優(yōu)良耐鹽紅豆草新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紅豆草共9份，其中編號(hào)1、5、6、7456、9155、9860、9977共7份由農(nóng)業(yè)部全國(guó)畜牧獸醫(yī)總站牧草種質(zhì)資源搜集保護(hù)項(xiàng)目協(xié)作組從俄羅斯瓦維洛夫植物基因庫(kù)引進(jìn)，蒙農(nóng)紅豆草(Onobrychisviciaefolia‘Mengnong’，MN，育成品種)種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，甘肅紅豆草(O.viciaefolia‘Gansu’，GS，地方品種)種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用消毒后的細(xì)沙(121 ℃，高溫滅菌30 min)500 g裝入塑料杯中，消毒(HgCl2溶液)后的紅豆草種子均勻撒播在杯中并覆沙3～4 cm，出苗后每杯選留10株分布均勻且生長(zhǎng)統(tǒng)一的幼苗，每隔2 d澆灌50 mL Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。NaCl脅迫處理選擇在30 d后進(jìn)行，其濃度為0%、0.4%、0.8%和1.2%，連續(xù)脅迫處理7 d后采集紅豆草幼苗葉片和根系測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

株高(Plant height，PH)用卷尺測(cè)定；地上、地下鮮重(Above/Below ground fresh weight，AFW、BFW)采用稱重法；根系形態(tài)指標(biāo)采用臺(tái)式掃描儀對(duì)根系進(jìn)行掃描，用根系分析系統(tǒng)軟件獲得根系總長(zhǎng)度(Root length，RL)、根系總表面積(Root surface area，RSA)、根系平均直徑(Average root diamater，ARD)、根體積(Root volume，RV)和根尖數(shù)(Root tip number，RTN)等。

生理指標(biāo)參考鄒琦[16]的方法進(jìn)行，其中可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法測(cè)定，可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，脯氨酸(Proline，Pro)含量采用酸性茚三酮比色法測(cè)定，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定，過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，K+、Na+含量采用火焰光度計(jì)法[17]測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并做表，采用隸屬函數(shù)對(duì)供試紅豆草進(jìn)行耐鹽性綜合評(píng)價(jià)，利用SPSS 20.0進(jìn)行相關(guān)性分析、聚類分析和主成分分析。為使材料間的差異最小化，各處理采用相對(duì)值表示，能準(zhǔn)確反映不同材料的耐鹽性，各指標(biāo)耐鹽系數(shù)=處理測(cè)定值/對(duì)照測(cè)定值[18]。

用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，對(duì)與鹽脅迫呈正相關(guān)的指標(biāo)采用公式Fij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)計(jì)算；對(duì)與鹽脅迫呈負(fù)相關(guān)指標(biāo)采用公式Fij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)計(jì)算。式中，F(xiàn)ij為i品種的j性狀測(cè)定的具體隸屬值；Xij為i品種j性狀測(cè)定值；Xjmin為j性狀中測(cè)定的最小值；Xjmax為j性狀中測(cè)定的最大值。

權(quán)重采用客觀賦權(quán)法進(jìn)行計(jì)算：Ij=Cj/Sj，式中，Ij是一個(gè)無量綱數(shù)，表示某評(píng)價(jià)指標(biāo)在鹽脅迫下的測(cè)定值相對(duì)于對(duì)照組的比值。Cj為第j個(gè)指標(biāo)正常組的測(cè)定值，Sj為第j個(gè)指標(biāo)在某個(gè)脅迫處理下所測(cè)定的平均值。如果是負(fù)相關(guān)，則計(jì)算式為Ij=Sj/Cj。最后通過歸一化，計(jì)算出每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重：Wj=Ij/∑Ij。綜合評(píng)價(jià)值：D=∑(Fij×Wj)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)紅豆草幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可知，供試植物PH、AFW、BFW、ARD、RV、RSA、RL和RTN耐鹽系數(shù)分別在0.71～0.98、0.48～0.92、1.06～2.14、0.58～0.98、1.07～4.85、1.03～1.45、1.06～1.61和1.01～3.02范圍內(nèi)變化，其中PH、AFW、ARD的耐鹽系數(shù)小于1，且隨鹽濃度的增加而不斷降低；其他形態(tài)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)均大于1，并隨鹽濃度增加而不斷上升。

表1 鹽脅迫下供試材料形態(tài)指標(biāo)耐鹽系數(shù)

2.2 鹽脅迫對(duì)紅豆草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及MDA含量的影響

由表2可知，供試材料葉片和根系SS、SP、Pro、MDA耐鹽系數(shù)分別在0.77～3.95和0.17～0.83、0.81～1.23和1.05～1.60、1.15～3.18和1.16～11.35、1.05～2.05和1.11～3.50范圍內(nèi)變化。隨鹽濃度的增加，葉片SS、SP耐鹽系數(shù)先增加后降低、根系SS耐鹽系數(shù)不斷下降，根系SP耐鹽系數(shù)不斷增加；葉片Pro耐鹽系數(shù)不斷上升，根系Pro耐鹽系數(shù)先升后降；葉片、根系MDA耐鹽系數(shù)不斷增加。

表2 鹽脅迫下供試材料滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和MDA的耐鹽系數(shù)

續(xù)表2 Continued table 2

2.3 鹽脅迫對(duì)紅豆草酶活性及K+、Na+含量的影響

由表3可知，供試材料葉片和根系POD、CAT、SOD、K+、Na+耐鹽系數(shù)分別在1.06～3.91和1.09～2.75、1.01～1.48和0.83～0.99、0.93～3.94和1.04～3.30、0.58～0.99和0.31～0.92、2.32～28.40和1.19～17.39范圍內(nèi)變化。隨鹽濃度的增加，葉片和根系POD、Na+耐鹽系數(shù)不斷升高；葉片CAT耐鹽系數(shù)不斷增加，根系CAT耐鹽系數(shù)不斷降低；葉片SOD 耐鹽系數(shù)先升后降，根系SOD 耐鹽系數(shù)不斷上升；葉片和根系K+耐鹽系數(shù)不斷下降。

表3 鹽脅迫下供試材料抗氧化物酶和K+、Na+耐鹽系數(shù)

續(xù)表3 Continued table 3

2.4 性狀相關(guān)性分析

由表4可知，鹽脅迫下，供試紅豆草材料生長(zhǎng)狀況與生理指標(biāo)間整體相關(guān)性密切，但各單項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)不一，這表明各單項(xiàng)指標(biāo)不能準(zhǔn)確有效的評(píng)價(jià)紅豆草耐鹽性的差異，應(yīng)考慮其綜合性狀所帶來的影響。

表4 鹽脅迫下各性狀的耐鹽系數(shù)相關(guān)性

2.5 主成分分析

由表5可知，主成分中排名前5的貢獻(xiàn)率分別為38.91%、13.82%、11.80%、8.94%、8.32%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為81.79%，其中第1、2、3、4、5主成分各自的特征值分別為6.615、2.349、2.006、1.519、1.415，對(duì)應(yīng)較大的特征向量分別是AFW、Pro、POD、RSA、SP，因此這5個(gè)指標(biāo)可作為不同紅豆草耐鹽性篩選與評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。

表5 各綜合指標(biāo)特征根及貢獻(xiàn)率

2.6 綜合評(píng)價(jià)

2.6.1 隸屬函數(shù)分析 由表6可知，對(duì)供試紅豆草材料鹽脅迫能力進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)，結(jié)合17項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)加權(quán)平均值對(duì)其耐鹽能力強(qiáng)弱排序結(jié)果為：材料9860>9977>GS>6>7456>5>9155>MN>1。

表6 鹽脅迫下各指標(biāo)隸屬值及綜合評(píng)價(jià)

續(xù)表6 Continued table 6

2.6.2 聚類分析 通過歐式距離平方法及系統(tǒng)聚類法對(duì)不同紅豆草材料隸屬值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(圖1)，將9份材料轉(zhuǎn)化為3類，第1類：耐鹽性較強(qiáng)，包括材料9860和9977；第2類：耐鹽性中等，包括材料GS、6、7456、5、9155；第3類：耐鹽性較弱，包括材料MN和1。

圖1 不同紅豆草材料耐鹽性聚類圖Fig.1 Cluster diagram of different sainfoin materials based on comprehensive evaluation value

3 討 論

3.1 鹽脅迫對(duì)紅豆草幼苗生長(zhǎng)的影響

根系是植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收與傳送的主要器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化影響植物的生長(zhǎng)狀況[20]。本研究表明，隨鹽脅迫濃度增加，供試材料的PH、AFW、ARD均下降，而BFW、RV、RSA、RL和RTN均增加，表明鹽分過量引起滲透脅迫和離子毒害，使植物生長(zhǎng)緩慢，其PH和AFW均下降，抑制了地上部的發(fā)育；植株需要消耗更多的能量和有機(jī)物質(zhì)以支持根系吸收水分和養(yǎng)分，改變了生物量分配格局，使BFW增加，這與賈茵等[21]對(duì)小報(bào)春耐鹽性的研究結(jié)果相一致。

3.2 鹽脅迫對(duì)紅豆草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及MDA的影響

鹽脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)部可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如Pro、SS、SP)加速積累，從而降低胞內(nèi)滲透勢(shì)確保水份能夠正常吸收[22]。有研究表明，植物體內(nèi)的SS只作為耐鹽性的參考指標(biāo)[23]，本研究中，SS與鹽害指數(shù)的相關(guān)性不緊密，表明其在植物耐鹽性中的影響較低；本研究中，鹽脅迫下葉片SP含量先升后降，這是由于低濃度脅迫下SP合成增強(qiáng)并參與滲透調(diào)節(jié)，提高紅豆草抗逆性，保護(hù)自身機(jī)制免受傷害；當(dāng)脅迫濃度超出一定范圍，SP合成受阻，紅豆草的自我調(diào)節(jié)機(jī)制受到破壞，使幼苗生長(zhǎng)受到影響[24]。逆境下Pro含量增加能增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵御作用[25]。本研究中，鹽脅迫下葉片和根系Pro含量均大于CK，表明Pro有效抵御了鹽脅迫對(duì)植物的傷害；葉片Pro含量不斷升高、而根系Pro含量先升后降，這是植物自身采取的一種保護(hù)措施，當(dāng)鹽濃度超過一定范圍后，其Pro含量降低，植物的自我保護(hù)已被破壞[26]。

MDA是膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物。Fu等[27]研究認(rèn)為，植物在受到鹽分脅迫時(shí)會(huì)引起細(xì)胞的膜透性和完整性遭到破壞，導(dǎo)致膜脂過氧化。本研究中，鹽脅迫下材料6的膜脂過氧化程度較低，材料MN和9155的過氧化程度較高，其他植物居中。

3.3 鹽脅迫對(duì)紅豆草抗氧化酶活性及離子含量的影響

逆境條件下，植物為了維持體內(nèi)的平衡，在SOD、POD 等抗氧化酶的協(xié)同作用下建立防御系統(tǒng)，清除體內(nèi)過剩的活性氧[28]。本研究表明，鹽脅迫后各植物葉片和根系POD、葉片CAT及根系SOD活性均高于CK，受損的膜在活性氧清除速度快于其產(chǎn)生速度的狀態(tài)下得到修復(fù)，使脅迫程度得到了緩解。

鹽脅迫下，維持植物體內(nèi)較高K+/Na+是評(píng)價(jià)植物耐鹽性的一個(gè)重要指標(biāo)[10]。本研究中，低鹽脅迫(0.4%)下，紅豆草幼苗通過維持體內(nèi)K+、Na+穩(wěn)態(tài)平衡抵御鹽脅迫；而在高鹽(0.8%、1.2%)脅迫下，紅豆草地上地下積累大量Na+，但因Na+區(qū)域化分布嚴(yán)重，環(huán)境影響滯后K+的運(yùn)輸，植物體內(nèi)K+、Na+穩(wěn)態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生離子毒害效應(yīng)，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受限[29]。

3.4 植物耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

植物耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的過程，為避免利用單項(xiàng)指標(biāo)描述耐鹽性的局限性，本試驗(yàn)通過隸屬函數(shù)分析對(duì)供試材料耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，利用該法對(duì)植物抗逆能力進(jìn)行評(píng)價(jià)已在花生[30]、薄荷[31]等中得到應(yīng)用。

4 結(jié) 論

紅豆草耐鹽性與形態(tài)特征和生理生化密切相關(guān)，隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)得出9份材料耐鹽性強(qiáng)弱順序?yàn)椴牧?860>9977>甘肅紅豆草>6>7456>5>9155>蒙農(nóng)紅豆草>1。其結(jié)果可為耐鹽紅豆草新品種選育提供新種質(zhì)。