87份水稻材料中抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)

劉軍化，黃成志，蔣靜玥，呂直文，劉忠賢，蔡鐘亞，雷樹(shù)凡

(1. 重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404155；2. 重慶三峽學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404020)

【研究意義】稻瘟病又稱稻熱病，系水稻常見(jiàn)病害之一，是由稻瘟病菌Magnaportheoryzae引起的世界性水稻真菌病害。稻瘟病在全球廣泛發(fā)生，其生理小種分布廣且多變，每年造成的水稻減產(chǎn)在10%～30%，嚴(yán)重時(shí)能夠達(dá)到50%以上，還會(huì)降低稻米食味品質(zhì)，影響口感[1-2]，嚴(yán)重阻礙水稻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，稻瘟病的防治方法主要有推廣應(yīng)用抗病新品種、采用生物防治和化學(xué)防治等。前兩者投入周期長(zhǎng)，且因稻瘟病生理小種變異迅速和頻繁，抗病品種種植3～5年后就喪失了抗性，防治效果不太理想；而大量使用化學(xué)農(nóng)藥防治，常會(huì)造成植物體內(nèi)農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染，威脅生態(tài)環(huán)境和食品安全[3-5]。相比傳統(tǒng)選育手段存在耗時(shí)長(zhǎng)、易出現(xiàn)目標(biāo)抗性基因錯(cuò)選或漏選等缺點(diǎn)，分子輔助育種可以有針對(duì)性地選擇抗性基因，能更加便捷、高效地培育稻瘟病抗性新品種。因此發(fā)掘稻瘟病抗性基因，利用分子輔助選擇培育抗稻瘟病的水稻新品種，是稻瘟病防治的基本策略之一[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】稻瘟病抗性基因的挖掘是解析水稻抗病分子機(jī)理的重要途徑。目前報(bào)道的稻瘟病抗性基因已有100個(gè)左右[7-8]，已克隆的基因約有30個(gè)[9]。由于這些抗性基因的表達(dá)、來(lái)源及植株生長(zhǎng)環(huán)境的不同，水稻材料具有高度多樣性和變異性等特點(diǎn)，增加了稻瘟病抗性基因的多樣性，豐富了育種家選育的優(yōu)良稻瘟病抗性新品種[10]。單一抗性基因的長(zhǎng)期利用會(huì)造成抗病能力逐年減弱，直至喪失抗性；而利用聚合基因選育的新品種抗病能力則表現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性。前人通過(guò)分子標(biāo)記法對(duì)多基因的抗性表達(dá)進(jìn)行研究，得出有些基因聚合能使水稻抗性增強(qiáng)，如廣譜抗性基因Pi9為主效基因時(shí)，同時(shí)聚合Pi-ta和Pi-b基因可以持久提高水稻的抗病能力[11]；但也有研究表明導(dǎo)入基因Pi21會(huì)減弱水稻的抗病能力[12]；抗性表達(dá)需要聚合抗性強(qiáng)的主基因，后期多次回交和自交才能消除其與稻瘟病抗性間的不利連鎖反應(yīng)，因此有針對(duì)性地進(jìn)行基因間的聚合研究是非常有必要的[13]；同時(shí)，因抗性基因的時(shí)限性與不確定性，且病菌群易發(fā)生變異，長(zhǎng)期使用單一R基因進(jìn)行抗病育種是不可取的，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生新的病菌群，原有效抗性基因會(huì)失去抗性[14]。因此，多方面深入研究抗性基因聚合與抗病等級(jí)的相關(guān)性，引進(jìn)多樣的抗性資源和探索新的抗性基因，合理布局和輪換使用抗稻瘟病品種，是減輕稻瘟病危害的有效途徑[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記是水稻抗病育種的有效手段，但稻瘟病菌生理小種具有高度變異性，為了應(yīng)對(duì)抗性變化，針對(duì)性地利用抗性基因改良品種抗性，育種工作者需要了解材料或品種本身的田間稻瘟病抗性及基因型分布，避免育種工作的盲目性。因此，本研究利用Pi1[16-17]、Pib[18-19]、Pi2[20-21]、Pi5[22-23]、Pi9[21,24]、Pita[25-26]、Pigm[27]、Pik[28-29]、Pik-m[30-31]9個(gè)稻瘟病主效抗性基因功能性分子標(biāo)記，結(jié)合PARMS SNP分型技術(shù)，對(duì)87份水稻資源進(jìn)行基因型分析，探明水稻種質(zhì)資源抗性表達(dá)與基因型之間的相關(guān)性，精準(zhǔn)選擇所需要的稻瘟病抗性育種材料?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】綜合87份水稻材料的稻瘟病田間鑒定及抗性基因分子檢測(cè)結(jié)果，分析稻瘟病抗性基因分布對(duì)水稻大田葉瘟、穗頸瘟發(fā)病程度的影響，為篩選水稻抗性資源提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料為重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究室多年選育而成。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)點(diǎn)選取重慶市萬(wàn)州區(qū)甘寧鎮(zhèn)永勝村(108.24°E、30.67°N)、湖北省恩施土家族苗族自治州恩施市白果鄉(xiāng)兩河口村(109.22°E、30.17°N)、貴州省湄潭縣興隆鎮(zhèn)廟塘壩村(107.30°E、27.40°N)3個(gè)稻瘟病抗性鑒定基地。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 稻瘟病抗性鑒定 2021年3月中旬在萬(wàn)州區(qū)甘寧鎮(zhèn)常規(guī)育秧，5月中旬移栽至甘寧鎮(zhèn)、白果鄉(xiāng)稻瘟病抗性鑒定基地，對(duì)照品種為麗江黑谷；6月上旬和9月中旬分別調(diào)查其葉瘟和穗頸瘟發(fā)病情況，葉瘟按照五點(diǎn)抓取法對(duì)所選區(qū)域病葉的病斑大小進(jìn)行分級(jí)，穗頸瘟調(diào)查按照2021年國(guó)家區(qū)試方案和《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程》[32]進(jìn)行。湄潭縣興隆鎮(zhèn)試驗(yàn)點(diǎn)的水稻種植及稻瘟病抗性鑒定委托湄潭縣植保站進(jìn)行。

1.3.2 DNA提取 綜合分析甘寧和恩施兩點(diǎn)的水稻穗頸瘟鑒定結(jié)果，選擇恩施點(diǎn)稻瘟病抗性基地中稻瘟病抗性在中抗及以上的水稻材料87份，取其劍葉，編號(hào)，裝在2 mL離心管中，放入加有冰袋的泡沫箱中密封。采用CTAB法提取劍葉中的DNA[33]。

1.3.3 分子標(biāo)記分析 采用PARMS SNP分型技術(shù)(景肽生物科技有限公司)，根據(jù)PARMS master mix說(shuō)明書(shū)配置10 μL PCR反應(yīng)體系(表1)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如表2所示。分子特異性標(biāo)記引物由景肽生物科技有限公司提供。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

1.3.4 熒光顯色 PARMS采用FAM和HEX作為報(bào)告熒光，ROX作為參比熒光，可在具有3種熒光檢測(cè)通道的酶標(biāo)儀及定量PCR儀中進(jìn)行快速檢測(cè)，A點(diǎn)接FAM(藍(lán)色熒光)，若檢出是純合基因，在分型圖上顯藍(lán)色，輸出結(jié)果為FAM；C點(diǎn)接HEX(綠色熒光)，若檢出是純合基因，在分型圖上顯綠色，輸出結(jié)果為HEX，若是雜合基因，在分型圖上顯紅色，輸出結(jié)果為FAMHEX；灰色的是沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)的點(diǎn)(圖1)。PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶標(biāo)儀讀取熒光信號(hào)，利用在線軟件Snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，得到清晰直觀的分型圖，并根據(jù)顏色不同，輸出基因型結(jié)果。

#1. Allele 1 FAM熒光通用引物；#2. Allele 2 HEX 熒光通用引物；#3. Allele 1 特異擴(kuò)增引物(標(biāo)記引物)；#4. Allele 2 特異擴(kuò)增引物(標(biāo)記引物)；#5. Locus 特異擴(kuò)增引物(標(biāo)記引物)#1. Allele 1 FAM fluorescent universal primers; #2. Allele 2 HEX fluorescent universal primers; #3. Allele 1 specific amplification primer (marker primer); #4. Allele 2 specific amplification primer (marker primer); #5. Locus specific amplification primer (marker primer)圖1 PARMS SNP檢測(cè)原理Fig.1 PARMS SNP detection principle

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性鑒定

2.1.1 葉瘟抗性等級(jí)調(diào)查 3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的水稻葉瘟抗性鑒定結(jié)果(圖2)：萬(wàn)州點(diǎn)抗病等級(jí)為1級(jí)的水稻材料有21份，2級(jí)材料有36份，3級(jí)材料有30份；恩施點(diǎn)抗病等級(jí)為1級(jí)材料有1份，2級(jí)材料有23份，3級(jí)材料有63份；湄潭點(diǎn)抗病等級(jí)為1級(jí)材料有0份，2級(jí)材料有22份，3級(jí)材料有41份，4級(jí)材料有24份。分析3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的葉瘟抗病等級(jí)，發(fā)現(xiàn)在萬(wàn)州本地篩選出的抗病水稻材料，其抗性在恩施市白果鄉(xiāng)和湄潭縣興隆鎮(zhèn)表現(xiàn)出逐漸減弱的趨勢(shì)。

圖2 87份水稻材料的葉瘟抗病等級(jí)Fig.2 Disease resistance grades to leaf blast in 87 rice materials

2.1.2 穗頸瘟抗性等級(jí)調(diào)查 3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的水稻穗頸瘟抗性鑒定結(jié)果(圖3)：萬(wàn)州點(diǎn)抗病等級(jí)為1級(jí)材料有40份，3級(jí)材料有47份；恩施點(diǎn)抗病等級(jí)為1級(jí)材料有16份，3級(jí)材料有52份，5級(jí)材料有19份；湄潭點(diǎn)抗病等級(jí)為5級(jí)材料有14份，7級(jí)材料有60份，9級(jí)材料有13份。綜合分析，萬(wàn)州點(diǎn)和恩施點(diǎn)材料的抗性等級(jí)多數(shù)在中抗及以上，或因兩個(gè)地區(qū)的地理位置相近和生態(tài)環(huán)境相似，導(dǎo)致稻瘟病生理小種致病性相近；而湄潭點(diǎn)材料在中感病以后，基本喪失了對(duì)稻瘟病的抗性。

圖3 87份水稻材料的穗頸瘟抗病等級(jí)Fig.3 Disease resistance grades to panicle blast in 87 rice materials

2.2 稻瘟病抗性基因檢測(cè)

利用TECAN infinite M1000酶標(biāo)儀讀取熒光信號(hào)，得到9個(gè)稻瘟病抗性基因Pi1、Pib、Pi2、Pi5、Pi9、Pita、Pigm、Pik、Pik-m的分型圖(圖4)。根據(jù)分型圖顏色不同，解析轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，輸出基因型檢測(cè)結(jié)果(表3)。在87份水稻材料中，未檢測(cè)到9個(gè)抗性基因的材料有2份，檢測(cè)到單基因的材料有10份，含2個(gè)聚合基因的材料有31份，3個(gè)聚合基因的材料有33份，4個(gè)聚合基因的材料有10份，5個(gè)聚合基因的材料有1份。9個(gè)稻瘟病抗性基因分布情況，含有Pi1基因的材料有4份，占比4.60%；含有Pib基因的材料53份(雜合基因材料5份)，占比60.92%；含Pi2基因的材料有47份(雜合基因材料9份)，占比54.02%；含Pi5基因的材料有72份(雜合基因材料5份)，占比82.76%；含Pi9和Pik基因的材料0份；含Pita基因的材料36份(雜合基因材料8份)，占比41.38%；含Pigm基因的材料有14份(雜合基因材料3份)，占比16.09%；含Pik-m基因的材料有21份，占比24.14%。綜合抗性分析，萬(wàn)州區(qū)甘寧鎮(zhèn)和恩施市白果鄉(xiāng)的地理位置和生態(tài)環(huán)境相近，稻瘟病生理小種的致病性相近，表現(xiàn)出的抗性結(jié)果也相近；而湄潭縣興隆鎮(zhèn)的地理位置和生態(tài)環(huán)境不同，所選材料對(duì)該點(diǎn)生理小種的抗病能力減弱。結(jié)果表明，中感病(MS)材料有52份，占比59.77%；感病(S)材料有22份，占比25.29%；高感病(HS)材料有13份，占比14.94%。

A. Pi1檢測(cè)結(jié)果；B. Pib檢測(cè)結(jié)果；C. Pi2檢測(cè)結(jié)果；D. Pi5檢測(cè)結(jié)果；E. Pi9檢測(cè)結(jié)果；F. Pita檢測(cè)結(jié)果；G. Pigm檢測(cè)結(jié)果；H. Pik檢測(cè)結(jié)果；I. Pik-m檢測(cè)結(jié)果?！熬G色點(diǎn)”表示感病純合基因；“藍(lán)色點(diǎn)”表示抗病純合基因；“紅色點(diǎn)”表示雜合基因；“灰色點(diǎn)”表示該基因無(wú)擴(kuò)增信號(hào)點(diǎn)A. Pi1 test results；B. Pib test results；C. Pi2 test results；D. Pi5 test results；E. Pi9 test results；F. Pita test results；G. Pigm test results；H. Pik test results；I. Pik-m test results.‘Green dot’ indicates susceptible homozygous gene; ‘Blue dot’ indicates disease resistance homozygous gene; ‘Red dot’ indicates heterozygous gene; ‘Gray dot’ indicates that the gene has no amplification signal point 圖4 9個(gè)抗性基因的熒光掃描分型Fig.4 Fluorescence scanning fractal of 9 resistance genes

表3 87份材料的抗性基因熒光解析結(jié)果及綜合抗性

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

3 討 論

試驗(yàn)重點(diǎn)檢測(cè)9個(gè)稻瘟病抗性基因Pi1、Pib、Pi2、Pi5、Pi9、Pita、Pigm、Pik、Pik-m在水稻稻瘟病抗性材料中的分布情況。Pi1、Pik、Pik-m基因連鎖位于第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端，Pi1對(duì)水稻葉瘟病抗性具有較強(qiáng)作用[34]；Pik是主效抗稻瘟病基因，對(duì)國(guó)內(nèi)許多稻瘟病生理小種有穩(wěn)定的、較強(qiáng)的抗性[28]；Pik-m是Pik的等位基因，在中國(guó)南方稻區(qū)具有廣泛的抗性[29]。Pib位于第2號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端，在日本表現(xiàn)出廣泛抗性，對(duì)中國(guó)的菌株ZB13和ZC15也表現(xiàn)抗病反應(yīng)[18]。Pi9與Pi2、Pigm位于第6號(hào)染色體Piz位點(diǎn)的復(fù)等位基因，Pi9與Pi2的抗譜相當(dāng)廣，對(duì)大多數(shù)國(guó)家的稻瘟病生理小種表現(xiàn)出抗性[21]。Pigm是一個(gè)廣譜抗稻瘟病基因，比公認(rèn)的廣譜抗性基因Pi1、Pi2、Pi3的抗譜更廣[35-36]。Pi5位于第11號(hào)染色體，是識(shí)別稻瘟病效應(yīng)子AVR-CO39所必需的，遺傳分析表明只有RGA5-A具有抗性[22]。Pita位于第12號(hào)染色體，是稻瘟病抗性基因成簇分布的熱點(diǎn)區(qū)域之一[26]；范方軍等[37]利用分子標(biāo)記檢測(cè)64份水稻品系，結(jié)果表明抗稻瘟病基因Pi-ta與穗頸瘟發(fā)生程度之間存在顯著相關(guān)性。

在供試87份水稻材料中，未檢測(cè)到這9個(gè)抗性基因分布的材料有2份，檢測(cè)到單基因分布的材料也很少，僅有Pi5分布的材料有6份，僅有Pi2分布的材料有2份，Pita和Pik-m分布的材料各1份；多數(shù)材料至少含2個(gè)聚合基因，最多的含有5個(gè)聚合基因。研究表明，稻瘟病抗性基因的分布與葉瘟、穗頸瘟發(fā)病程度之間沒(méi)有明顯的規(guī)律，有的材料雖然基因分布相同，但其表現(xiàn)出的稻瘟病抗病等級(jí)不同，可能是這些材料中含有未被檢測(cè)到的稻瘟病抗性基因在發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證；此外也揭示了水稻對(duì)稻瘟病的抗性并不因聚合的抗性基因越多而越強(qiáng)，可能是稻瘟病抗性基因的抗性隨著稻瘟病生理小種的變異而減弱，今后應(yīng)加大對(duì)稻瘟病抗性新基因的挖掘與應(yīng)用。

4 結(jié) 論

綜合分析萬(wàn)州點(diǎn)、恩施點(diǎn)和湄潭點(diǎn)水稻材料的稻瘟病田間抗性鑒定結(jié)果及9個(gè)抗性基因分布檢測(cè)結(jié)果，可以明確這些基因在三峽庫(kù)區(qū)仍保留對(duì)部分稻區(qū)中稻瘟病生理小種的抗性，且對(duì)葉瘟的抗性較穗頸瘟更強(qiáng)，但其抗性優(yōu)勢(shì)有減弱的趨勢(shì)。因此在今后的稻瘟病抗性品種選育中，引進(jìn)稻瘟病廣譜抗性強(qiáng)的新資源和挖掘新的抗性基因，是選育抗稻瘟病新品種的有效途徑。