不同桑品種的桑葉和桑椹α-生育酚含量測(cè)定分析

唐 露，黃傳書，宋志光，邢康康，劉 艷

(1. 重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400700；2. 重慶市中藥研究院，重慶 400065)

【研究意義】生育酚(維生素E)，根據(jù)甲基數(shù)目和位置的不同分為α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚4種不同形式[1]，是一類脂溶性的強(qiáng)抗氧化劑的同類物質(zhì)統(tǒng)稱，在體內(nèi)具有良好的抗氧化活性，體內(nèi)活性順序?yàn)棣?生育酚>β-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚，其中α-生育酚的生物活性最強(qiáng)，通常生育酚活性主要由α-生育酚體現(xiàn)[2]。α-生育酚作為一種重要的微量營(yíng)養(yǎng)成分，參與功能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控及抗低溫脅迫等多種代謝途徑，在提高動(dòng)物和人體的免疫力和應(yīng)激力、維持正常的生殖功能、清除細(xì)胞自由基、抑制不飽和脂肪酸腐敗及植物葉綠體提供光合保護(hù)作用等方面都發(fā)揮著重要作用[3-4]。生育酚具有重要的生物學(xué)功能，只能由具有光合能力的生物合成，人類和動(dòng)物只能通過食用植物性食物或提純的維生素E膠囊進(jìn)行補(bǔ)充[5]。因此挖掘高α-生育酚含量的植物資源，為維生素E產(chǎn)品的開發(fā)利用奠定原料基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】桑樹(Morusalba)在中國(guó)有幾千年的栽植歷史，種質(zhì)資源豐富，傳統(tǒng)栽桑主要用于養(yǎng)蠶。桑樹中含有生物堿、黃酮、多糖、多酚、氨基酸、維生素等豐富的功能性活性物質(zhì)，具有抗炎[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、降血壓[10]、清除自由基抗衰老[11]等多種功效。目前，桑樹在營(yíng)養(yǎng)保健、畜禽養(yǎng)殖、生態(tài)治理等方面已得到很好的利用。對(duì)桑樹功能物質(zhì)的研究主要包括DNJ、黃酮類物質(zhì)、花青素、多酚及多糖等幾大類[12-15]。【本研究切入點(diǎn)】重慶市蠶科院“桑樹種質(zhì)資源創(chuàng)新及應(yīng)用”課題組在前期研究中對(duì)桑樹葉片的α-、β-、γ-、δ- 4種生育酚含量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)葉片中α-生育酚含量最高，達(dá) 55.07%，但目前關(guān)于西南地區(qū)主推桑樹資源α-生育酚含量的研究還未見報(bào)道。本研究擬對(duì)西南地區(qū)主推桑資源的桑葉、桑椹中α-生育酚含量進(jìn)行檢測(cè)比較，以篩選高生育酚含量的桑資源，為當(dāng)?shù)厣Ｆ贩N改良及綜合開發(fā)利用提供新的途徑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)西南地區(qū)32個(gè)主推桑品種的桑葉及13個(gè)果桑的桑椹中α-生育酚含量進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)定分析，篩選出高α-生育酚含量材料，以對(duì)桑樹中天然α-生育酚的提取及利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，為高生育酚含量桑品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料 供試材料來自重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院的桑品種保護(hù)資源圃，樹齡35年，其中編號(hào)2～35的材料為葉用桑，編號(hào)36～48的材料為果桑品種，具體編號(hào)及品種名詳見表1。

表1 供試桑品種及編號(hào)

續(xù)表1 Continued table 1

1.1.2 主要試劑與儀器 干式氮吹儀(無錫沃信儀器有限公司)、島津LC-20AT液相(日本島津公司)、C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司)、低溫離心機(jī)TLG-16(湖南湘儀動(dòng)力測(cè)試儀器有限公司)、甲醇(色譜級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)、超純水。α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備 稱取α-生育酚對(duì)照品1 mg，置于1 mL容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，配置濃度為1000 μg/mL的儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理 2020年5月4日上午9時(shí)，天氣晴朗，每個(gè)品種隨機(jī)選取5株桑樹，每株從同側(cè)、中上段采集完全成熟的桑葉、桑椹，用去離子水沖洗，吸水紙干燥后，放入裝有干冰的泡沫箱，帶回實(shí)驗(yàn)室先放入-20、-40 ℃低溫冰箱分別冷適應(yīng)1 h，隨后保存于超低溫冰箱中備用。將供試樣品用液氮冷凍后經(jīng)高通量植物組織研磨器磨碎，精確稱取0.1 g樣本，加入1 mL的1%BHT乙醇溶液，混勻后加入1 mL 10%氫氧化鉀溶液，混勻于85 ℃恒溫金屬浴中恒溫提取40 min。冷卻后加入2 mL石油醚振蕩萃取10 min，取出醚相，用超純水清洗3次，將清洗后的醚相氮吹至干，加入1 mL甲醇復(fù)溶，用針頭式過濾器過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)待測(cè)。

1.2.3 測(cè)定方法 α-生育酚的HPLC液相條件：島津高效液相色譜儀，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相的配制：超純水與甲醇的體積比為20∶80。開啟電腦、檢測(cè)器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，走樣時(shí)間25 min，檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm，設(shè)置完畢保存方法組。用流動(dòng)相過柱子，待基線穩(wěn)定后開始加樣。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPSS 23.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、單因素ANOVA分析及Duncan多重比較、系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對(duì)配置的對(duì)照α-生育酚標(biāo)液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，測(cè)試所得α-生育酚在11.899 min出現(xiàn)峰(圖1)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，生育酚含量為橫坐標(biāo)(x)計(jì)算得到其校正曲線，y=7285.6x-69.1，R2=0.9998，表明其線性關(guān)系良好。

圖1 α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.1 Atlas of α-tocopherol standard

2.2 描述性統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)32個(gè)品種的桑葉及13個(gè)品種的桑椹中α-生育酚含量進(jìn)行總體描述性分析(表2)。可以看出，32個(gè)品種的桑葉中α-生育酚含量變化范圍為13.44～64.14 μg/g，均值為32.78 μg/g，變異系數(shù)為0.33，表明α-生育酚含量在桑樹葉片中存在豐富的變異，偏度和峰度系數(shù)大于0，表示其數(shù)據(jù)呈尖峰右偏分布；13個(gè)品種桑椹中α-生育酚含量變化范圍為0.48～13.10 μg/g，均值為5.48 μg/g，變異系數(shù)為0.83，表明變異極為豐富，數(shù)據(jù)整體呈扁平右偏分布?？傮w而言，桑葉中的α-生育酚含量大于桑椹中含量，其均值為桑椹平均含量的5.98倍。

表2 桑葉及桑椹的α-生育酚含量總體分析

2.3 品種間桑葉、桑椹中α-生育酚含量比較

方差分析(表3)表明，不同桑品種的桑葉α-生育酚含量存在極顯著差異(F=895.232，P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在供試桑品種中，桑葉α-生育酚含量最高的是魯桑系品種農(nóng)桑12(16號(hào)材料)，其含量高達(dá)64.14 μg/g，顯著高于其余31個(gè)品種；含量最低的是魯桑系湖桑14(21號(hào)材料)，含量?jī)H為13.44 μg/g，約為最高含量的1/5，為平均含量的2/5，顯著低于其他品種。

表3 32個(gè)品種的桑葉α-生育酚含量比較

方差分析(表4)表明，不同品種的桑椹α-生育酚含量間存在極顯著差異(F=1100.219，P<0.01)。其中，桑椹α-生育酚含量最高的是魯桑系品種紅果1號(hào)，為13.1 μg/g，最低的是嘉陵30號(hào)，僅為0.48 μg/g。

表4 13個(gè)品種的桑椹α-生育酚含量比較

2.4 不同桑系的α-生育酚含量比較

對(duì)不同桑系的α-生育酚含量進(jìn)行比較分析(表5)，魯桑系桑樹葉片的α-生育酚含量最高，變異范圍為12.91～64.52 μg/g，均值為34.88 μg/g；山桑系的α-生育酚含量最低，變異范圍20.20～41.78 μg/g，均值為30.58 μg/g；白桑系的α-生育酚含量亦較低，均值為31.51 μg/g。

表5 不同桑系的α-生育酚含量比較

2.5 聚類分析

當(dāng)歐式平方距離值為3時(shí)，可將32份材料聚類成3大類及2個(gè)單樣(圖2)，將2個(gè)單獨(dú)聚類的個(gè)體(編號(hào)16、21)根據(jù)特性歸屬到3大類中。類群1有8個(gè)品種(編號(hào)為18、22、8、5、9、10、13、20)，其α-生育酚含量范圍在30.17～35.52 μg/g，均值為32.65 μg/g，主要集中了中等含量的品種；類群2共有13個(gè)品種(編號(hào)為24、32、29、7、30、14、6、33、35、12、23、19、21)，其α-生育酚含量范圍在13.44～27.13 μg/g，均值為22.79 μg/g，主要集中了較低含量的品種；類群3包括了α-生育酚含量較高的11個(gè)品種(編號(hào)為26、27、28、34、2、3、4、11、17、14、16)，其變化范圍為37.36～64.14 μg/g，均值達(dá)到44.69 μg/g。

圖2 32個(gè)葉用桑品種的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 32 mulberry varieties for leaves

2.6 高α-生育酚含量桑資源鑒定

參照李國(guó)營(yíng)等提出的谷子高生育酚含量分類標(biāo)準(zhǔn)[16]，以樣品α-生育酚含量的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為分類依據(jù)，得到α-生育酚含量閾值分別為43.61、21.95 μg/g，即高α-生育酚含量≥43.61 μg/g，低α-生育酚含量≤21.95 μg/g，中等α-生育酚含量為21.95～43.61 μg/g。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，在32個(gè)桑品種中，α-生育酚含量大于43.61 μg/g的共有5個(gè)品種，分別為農(nóng)桑2號(hào)、育2號(hào)、樂山紅花桑、農(nóng)桑8號(hào)、荷葉白，占供試品種數(shù)的15.6%；低α-生育酚含量組共有4個(gè)品種，分別為湖桑14、新一之瀨、西農(nóng)8202、青皮湖桑，占供試品種數(shù)的12.5%；中α-生育酚含量組共有23個(gè)品種，占供試品種數(shù)的71.9%(圖3)。

圖3 32個(gè)桑品種的α-生育酚含量分類Fig.3 Classification of α-tocopherol content in 32 mulberry varieties

3 討 論

α-生育酚作為生育酚的重要成分之一，在人體及動(dòng)物中氧化活性最高。前人研究表明，植物葉片中生育酚以α-生育酚為主，且α-生育酚與總生育酚含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，故研究桑葉及桑椹的α-生育酚是符合客觀規(guī)律及科學(xué)實(shí)踐要求的。本研究通過測(cè)定和分析顯示，32個(gè)葉用桑的葉片α-生育酚平均含量為32.78 μg/g，桑椹α-生育酚平均含量?jī)H為5.48 μg/g，桑葉α-生育酚含量是桑椹的5.98倍。閆蒼等[17]研究認(rèn)為，不同組織中生育酚含量及比例的不同，可能與各成分在不同組織中所發(fā)揮的作用不同相關(guān)。馮光燕等[18]對(duì)16個(gè)紫花苜蓿(MedicagosativaL.)材料葉片的生育酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，其維生素E含量平均值為31.81 μg/g，其中α-生育酚含量介于17.09～59.92 μg/g，均值為30.5 μg/g；謝蒙膠等[19]研究表明，16個(gè)生菜(LactucasativaL.)葉中維生素E含量?jī)H為0.2～0.8 μg/g。本研究中桑葉α-生育酚含量高于上述兩物種，表明桑葉可作為天然維生素E提取及利用的良好原料。Munné-Bosch等[20]研究認(rèn)為，不同生長(zhǎng)期的植物體內(nèi)VE含量會(huì)表現(xiàn)出明顯的差異，本研究?jī)H對(duì)春季桑葉及桑椹中α-生育酚含量進(jìn)行了測(cè)定，未對(duì)不同生長(zhǎng)階段、不同器官組織的生育酚含量做系統(tǒng)分析，今后應(yīng)進(jìn)一步探究桑樹不同生育期、不同部位的生育酚含量變化規(guī)律。

結(jié)合品種所屬桑種分析發(fā)現(xiàn)，魯桑系品種的葉片α-生育酚含量最高，山桑系和白桑系品種的α-生育酚含量較低，可見，α-生育酚含量在不同桑系中有較大差異，可能是桑樹品種在生長(zhǎng)過程中，不同地域和生態(tài)條件下對(duì)其進(jìn)行自然選擇的結(jié)果。本研究?jī)H對(duì)西南地區(qū)主推的桑品種進(jìn)行了測(cè)定分析，所選桑品種不夠全面，下一步還需擴(kuò)大范圍，研究全國(guó)不同區(qū)域的桑品種生育酚含量分布規(guī)律，探討地理環(huán)境和遺傳選擇對(duì)桑樹生育酚含量的影響。

Abbasi等[21]研究認(rèn)為，α-生育酚含量增高可以提高植物對(duì)鹽分脅迫的耐受性和抵抗力；隋炯明等[22]研究也表明，在花生(ArachishypogaeaLinn.)中過表達(dá)生育酚合成關(guān)鍵基因以提高生育酚含量，增強(qiáng)了花生對(duì)鹽分脅迫的耐受能力；Collin等[23]研究表明，重金屬離子脅迫會(huì)誘導(dǎo)生育酚合成基因表達(dá)，以抵抗重金屬的侵害；Cela等[24]發(fā)現(xiàn)擬南芥中生育酚含量的變化可影響植物對(duì)生物脅迫的反應(yīng)；郭娟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)vtel基因的煙草(NicotianatabacumL.)較野生型植株，具有更強(qiáng)的抗旱性和耐鹽性。綜上，生育酚在植物逆境生長(zhǎng)中可能發(fā)揮著積極的作用，生育酚含量是否可以作為抗逆桑品種選育的一個(gè)參考指標(biāo)，進(jìn)行優(yōu)良抗逆性狀聚合育種在今后的試驗(yàn)中需要更深入的研究。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)桑樹α-生育酚含量進(jìn)行測(cè)定分析，將參試32個(gè)葉用桑品種分為3類，即中等含量組(8個(gè)品種)、低含量組(13個(gè)品種)及較高含量組(11個(gè)品種)3類；鑒定出農(nóng)桑2號(hào)、育2號(hào)、樂山紅花桑、農(nóng)桑8號(hào)、荷葉白等5個(gè)高α-生育酚含量桑品種，為今后桑種質(zhì)資源的挖掘和品質(zhì)改良育種提供有益思考。