陸地棉GhUGT76C1基因克隆、生物信息學(xué)分析及功能初探

唐成芬，林文妮，Josee ornella musaniwabo，劉愛玉，屠小菊

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410128)

【研究意義】棉花為世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，是紡織工業(yè)中最重要的可再生纖維[1]。矮化棉花品種能夠有效提高光能利用率和收獲指數(shù)，解決不耐肥的問題，并具有適宜密植及機(jī)械化管理、無公害、提高產(chǎn)量、降低勞動強(qiáng)度和節(jié)約成本等特點[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】細(xì)胞分裂素在擬南芥、水稻等植物中具有調(diào)控植物矮化的功能，但是未見與棉花矮化相關(guān)的報道。水稻OsAHP1基因和OsAHP2基因RNAi突變體表現(xiàn)出CK信號途徑缺陷和節(jié)間長度變小導(dǎo)致矮化的表型[3]。OsCKX4/RootEnhancer1(ren1-D)是CKX同源基因，其顯性突變的植物表現(xiàn)出細(xì)胞分裂素水平降低及半矮化表型[4]。OsCKX9介導(dǎo)細(xì)胞分裂素降解，其突變體株高降低[5]。OryzasativaVIN3-LIKE2(OsVIL2) 通過與細(xì)胞分裂素降解基因OsCKX2的啟動子結(jié)合來影響株高和生物量[6]。在擬南芥中，過量表達(dá)陸地棉GhDREB1基因會導(dǎo)致擬南芥矮化、晚開花及對細(xì)胞分裂素的敏感性降低的表型，這與2個CK信號途徑中的2個關(guān)鍵組分type-B和type-A的ARRs抑制表達(dá)相關(guān)[7]。在植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素穩(wěn)態(tài)的復(fù)雜過程中，N-葡萄糖基化是調(diào)控植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素代謝平衡的重要機(jī)制之一[8]。UGT76C1基因是細(xì)胞分裂素N-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76C1在植物體內(nèi)可使細(xì)胞分裂素發(fā)生糖基化修飾并使細(xì)胞分裂素失活和參與調(diào)控植物對細(xì)胞分裂素的響應(yīng)[6，9]。UGT76C1和UGT76C2能夠催化細(xì)胞分裂素形成細(xì)胞分裂素 N(7)-葡萄糖苷和N(9)-葡萄糖苷，UGT76C1缺失突變體ugt76C1細(xì)胞分裂素N-糖苷的積累顯著降低，而UGT76C1過表達(dá)株增加了細(xì)胞分裂素N-糖苷的積累，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76C1可以通過細(xì)胞分裂素的N-葡萄糖基化精細(xì)調(diào)節(jié)植物中的細(xì)胞分裂素反應(yīng)[10]。擬南芥中UGT76C1基因與細(xì)胞分裂素的含量有重要關(guān)系，在擬南芥UGT家族中，只有UGT76C1、UGT76C2和UGT85A13個基因可使細(xì)胞分裂素失活[11]。但是目前未見UGT76C1基因調(diào)控植物矮化的報道?！颈狙芯壳腥朦c】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，GhUGT76C1基因與陸地棉矮化突變體LA-1的矮化密切相關(guān)。本實驗通過克隆陸地棉GhUGT76C1基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，轉(zhuǎn)化擬南芥獲得過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，并觀察不同光質(zhì)光強(qiáng)條件下的表型性狀?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步研究GhUGT76C1基因的功能及其與LA-1矮化的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)，為篩選陸地棉矮化基因及解析陸地棉矮化突變體LA-1矮化的分子機(jī)理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

陸地棉矮化突變體LA-1材料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所提供。本文用于保存質(zhì)粒與擴(kuò)繁的菌種為大腸桿菌DH5α，所用質(zhì)粒型號為pCUbi1390，用于轉(zhuǎn)染擬南芥所用菌種為農(nóng)桿菌GV3101，均為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所實驗室保存菌種。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由SIGMA公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1GhUGT76C1基因克隆 以陸地棉矮化突變體LA-1葉片為材料，采用SIGMA公司RNA提取試劑盒提取總 RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，設(shè)計引物序列(UGT76C1-F：5′-TGCACTAGGTACCTGCAGATGAAACTGAAGGGTCGTGGATC-3′；UGT76C 1-R：5′-GGATCCGTCGACCTGCAGCATAGAAAGTAT GTAACTAACCAAATTGTC-3′)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2GhUGT76C1基因生物信息學(xué)分析 將克隆得到的GhUGT76C1基因的cDNA序列用NCBI(http://ncbi.nlm.ncih.gov/)中的Blastn和Blastp進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用proparam (https://web.expasy.org/protparam/)在線工具和DNAStar軟件對編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，利用SOPMA對陸地棉GhUGT76C1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。在NCBI基因庫中選取不同物種的UGT76C1基因進(jìn)行序列比對，并選取其cds序列，用MEGAX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3GhUGT76C1基因過量表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 將pCUbi1390載體進(jìn)行Pst1單酶切，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒將酶切產(chǎn)物及克隆得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，通過連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α，篩選獲得陽性克隆，得到的重組質(zhì)粒采用液氮凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，篩選陽性菌落，并通過菌落PCR驗證，將檢測成功的陽性菌液送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.2.4GhUGT76C1基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的篩選及表型分析 利用浸花法將測序成功的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，并篩選陽性苗，獲得GhUGT76C1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。為了研究GhUGT76C1基因在植物生長過程中發(fā)揮的作用，將Col-0和GhUGT76C1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系材料分別放置在黑暗、白光、藍(lán)光、紅光及遠(yuǎn)紅光下進(jìn)行培養(yǎng)，光強(qiáng)設(shè)置為 0.1、1.0、10.0、30.0 μmol/(m2·s)，6 d后，每個處理取10株擬南芥測量下胚軸長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhUGT76C1基因克隆

以陸地棉矮化突變體LA-1葉片為材料，提取總 RNA，電泳檢測顯示RNA條帶清晰，能夠進(jìn)行下一步實驗。將RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用UGT76C1-F和UGT76C1-R引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得約1400 bp PCR產(chǎn)物(圖1)，測序結(jié)果表明，得到1447 bp的片段，在NCBI的BLAST比對中發(fā)現(xiàn)，克隆得到的序列與GossypiumhirsutumUDP-glycosyltransferase76C2-like基因(GenBank:XM_016830413.1)序列同源性高達(dá)99.77%，表明成功克隆了GhUGT76C1基因。

A: 陸地棉RNA檢測; 1, 2, 3: RNA條帶; B: GhUGT76C1基因克隆; M: DL2000 DNA marker; 1, 2: GhUGT76C1基因擴(kuò)增產(chǎn)物A: RNA detection of upland cotton; 1, 2, 3: RNA stripe; B: Cloning of GhUGT76C1; M: DL2000 DNA marker; 1, 2: Amplification product of GhUGT76C1 gene圖1 陸地棉RNA提取及GhUGT76C1基因克隆Fig.1 RNA extract from Gossypium hirsutum and cloning of GhUGT76C1

2.2 GhUGT76C1基因的開放閱讀框及理化性質(zhì)分析

根據(jù)陸地棉GhUGT76C1基因cds序列進(jìn)行開放閱讀框(圖2)分析，序列中有1個最長為1365 bp的開放閱讀框，其中起始密碼子位于1 bp處，終止密碼子位于1365 bp處。使用BLAST和DNAstar等軟件得出的結(jié)果一致，推測此開放閱讀框可編碼455個氨基酸。使用proparam在線工具和DNAStar軟件對編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，該序列編碼產(chǎn)物的分子式為C4190H7017N1365O1770S286，原子總數(shù)為14 628。理論分子量約為 51.31 kD，不存在二硫鍵。理論等電點為5.40，編碼的 454個氨基酸中，組成最多的是Ala，所占比例為5.1%。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為52，帶正電荷的殘基總數(shù)為40，不穩(wěn)定系數(shù)為44.94，GhUGT76C1基因編碼不穩(wěn)定蛋白。親水性的平均值(GRAVY)為0.065，為疏水性蛋白。

圖2 陸地棉GhUGT76C1基因序列的ORF分析Fig.2 ORF analysis of GhUGT76C1 gene sequence in Gossypium hirsutum

2.3 陸地棉GhUGT76C1蛋白結(jié)構(gòu)及氨基酸序列同源性比對分析

利用SOPMA對陸地棉GhUGT76C1蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖3)預(yù)測，GhUGT76C1蛋白由ɑ-螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈以及β-轉(zhuǎn)角組成，分別占43.39%，35.68%，13.66%和 7.27%。利用NCBI上的blastp程序檢索同源蛋白，獲取多個物種的UGT76C1 同源蛋白序列(圖4), 物種包括水蜜桃(Prunuspersica,ID: 18786137)、葡萄(Vitisvinifera,ID: 100244489)、小麥(Triticumaestivum,ID: 1004 15862)、花生(Arachishypogaea,ID: 112736258、擬南芥(Arabidopsisthaliana,ID: 821732)、陸地棉(Gossypiumhirsutum,ID:107931078)、黃連苔草(CoptischinensisFranch,ID: 1000500)。利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出陸地棉與擬南芥同源蛋白在進(jìn)化過程中屬于同一分支，親緣關(guān)系最近。

藍(lán)色: ɑ-螺旋; 橙色: 無規(guī)卷曲; 紅色: 延伸鏈; 綠色: β-轉(zhuǎn)角Blue: Alpha helix; Orange: Random coil; Red: Extended strand; Green: Beta turn圖3 GhUGT76C1蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of GhUGT76C1 protein

圖4 陸地棉GhUGT76C1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.4 Analysis of development tree of Gossypium hirsutum GhUGT76C1 protein system

2.4 陸地棉GhUGT76C1基因過表達(dá)載體構(gòu)建

將GhUGT76C1基因及pCUbi1390載體進(jìn)行酶切連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，挑選陽性克隆進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明，克隆的基因序列與NCBI基因序列完全一致，說明成功構(gòu)建了pCUbi1390-GhUGT76C1重組質(zhì)粒。將得到的重組質(zhì)粒采用液氮凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，菌液PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子 (圖5)。其中1、2、3號樣本都成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，含有目的基因, 可以直接應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化。

M: Trans 5K marker;1, 2, 3號為PCR產(chǎn)物M: Trans 5K marker;No.1, 2, 3 is the PCR product圖5 重組質(zhì)粒菌液PCR檢測Fig.5 Detection of recombinant plasmids by Escherichia coli gel electrophoresis

2.5 不同光質(zhì)光強(qiáng)處理下GhUGT76C1基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系表型分析

黑暗條件下，GhUGT76C1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系下胚軸長度顯著大于Col-0(圖6)，白光處理條件下，2種材料的下胚軸長度無顯著差異。不同光強(qiáng)度的藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光處理條件下，GhUGT76C1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與Col-0的下胚軸長度存在差異，尤其是在藍(lán)光及遠(yuǎn)紅光處理條件下，差異較明顯。其中在光強(qiáng)為0.1和1.0 μmol/(m2·s)藍(lán)光處理條件下，兩種材料的差異達(dá)到顯著水平；0.1 μmol/(m2·s)遠(yuǎn)紅光光強(qiáng)處理條件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系下胚軸長度明顯大于Col-0；在不同光照強(qiáng)度紅光處理條件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的下胚軸長度均大于Col-0，但是差異不顯著。說明GhUGT76C1基因在黑暗及低光強(qiáng)藍(lán)光及遠(yuǎn)紅光條件下對植株下胚軸生長發(fā)揮正調(diào)控作用。

A, B, C, D, E分別表示黑暗, 白光, 藍(lán)光, 紅光, 遠(yuǎn)紅光處理A, B, C, D and E represent dark, white, blue, red, and far-red processing，respectively圖6 黑暗、白光及不同光質(zhì)處理下突變體下胚軸長度Fig.6 Hypocotyl length of mutants treated with dark, white and different light quality

3 討 論

自1922年P(guān)arnell發(fā)現(xiàn)矮化水稻后，60多種矮化的水稻被檢測出來[12]。另外，在小麥、玉米、大豆及甘藍(lán)型油菜等多種作物上均發(fā)現(xiàn)了不同種類的矮化突變體[13-16]。目前，關(guān)于矮化突變體的研究主要集中在植物激素調(diào)控矮化方面，包括植物形態(tài)、細(xì)胞學(xué)和激素調(diào)控矮化的機(jī)理研究等[17]。研究表明，多數(shù)植物矮化突變體都是激素合成途徑或者應(yīng)答調(diào)節(jié)發(fā)生突變使植物莖的生長發(fā)育發(fā)生改變造成的[18]，主要與植物赤霉素(GA)和油菜素類固醇(BR)有關(guān)，少數(shù)與其他激素相關(guān)[19]。細(xì)胞分裂素能夠調(diào)控植物生長和發(fā)育的各個方面，包括細(xì)胞分裂、芽的萌發(fā)和分化、種子發(fā)育等，在植物生長中發(fā)揮極其重要的作用[20]。

目前，關(guān)于細(xì)胞分裂素N-糖基轉(zhuǎn)移酶基因研究的報道較少，更未見該基因調(diào)控陸地棉株高的研究。本研究在前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)[21]上，篩選得到的GhUGT76C1基因可能與陸地棉矮化突變體LA-1的矮化相關(guān)。并克隆獲得約1400 bp PCR產(chǎn)物，在NCBI的BLAST比對中發(fā)現(xiàn)，克隆得到的序列與GossypiumhirsutumUDP-glycosyltransferase76C2-like基因(GenBank:XM_016830413.1)序列同源性達(dá)99.77%。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其序列中有一個最長為1365 bp的開放閱讀框，編碼455個氨基酸。并對GhUGT76C1基因的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了深入的分析，本研究首次成功克隆了陸地棉GhUGT76C1基因。

葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT76C1 能夠?qū)?N(7)-和 N(9)-位置的不同細(xì)胞分裂素進(jìn)行 N-葡萄糖基化，最早在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，擬南芥中UGT76C1基因調(diào)控細(xì)胞分裂素在植物體內(nèi)的含量，在細(xì)胞分裂素代謝途徑中，udp-糖基轉(zhuǎn)移酶通過細(xì)胞分裂素的糖基化，對細(xì)胞分裂素進(jìn)行修飾，對維持細(xì)胞正常的生理活動有極其重要的作用[6]。但是還未見關(guān)于UGT76C1基因調(diào)控植物株高的研究。本研究通過構(gòu)建GhUGT76C1基因的過量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥獲得了轉(zhuǎn)基因株系。通過對轉(zhuǎn)基因株系的表型分析發(fā)現(xiàn)，黑暗及較低強(qiáng)度的藍(lán)光和遠(yuǎn)紅光處理條件下，UGT76C1基因過表達(dá)突變體下胚軸長度均大于Col-0。研究表明，不同激素之間可以通過相互作用調(diào)節(jié)植物生長。MsGH3.5的過表達(dá)可以顯著增加植物體內(nèi)CK含量，降低游離IAA含量，導(dǎo)致突變體表現(xiàn)出明顯的矮化表型[22]。黑暗誘導(dǎo)的生長的主要特征是下胚軸的快速伸長，植物中ABA 缺乏導(dǎo)致下胚軸生長減少，外源ABA可恢復(fù)生長，ABA通過增強(qiáng)編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 SlKRP1 和 SlKRP3 抑制劑的基因的表達(dá)以及降低細(xì)胞分裂素水平來促進(jìn) DNA 核內(nèi)復(fù)制從而導(dǎo)致下胚軸的增長[23]，在黑暗及不同的弱光照處理條件下，GhUGT76C1基因過量表達(dá)是否通過使CK失活，導(dǎo)致GhUGT76C1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)BA含量增加，從而使其下胚軸較長，GhUGT76C1是否通過調(diào)控不同激素之間的含量變化，從而引起株高表型差異，還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了陸地棉GhUGT76C1基因，基因全長1447 bp，cds序列1365 bp，編碼454個氨基酸，成功構(gòu)建了陸地棉GhUGT76C1基因過量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥獲得過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系在黑暗、低光強(qiáng)藍(lán)光及遠(yuǎn)紅光條件下均出現(xiàn)顯著的下胚軸增長的表型。