長棘海星(Acanthaster planci)幼體特異性PCR 檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用*

張穎, 楊櫟潼, 劉冰,3, 鄭凡昱, 羅鵬, 陳償,4

1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州510301;

2. 廈門大學(xué)馬來西亞分校, 中國東盟海洋技術(shù)學(xué)院, 馬來西亞 雪蘭莪州 雪邦 43900;

3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;

4. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 海南西沙海洋環(huán)境國家野外科學(xué)觀測(cè)研究站, 廣東 廣州 510301

近幾十年來, 世界各地的珊瑚礁正在迅速減少(Hughes et al, 2017)。雖然氣候引起的周期性白化是全球珊瑚死亡的主要原因(Hughes et al, 2018), 但以珊瑚為食的長棘海星(Acanthaster planci, 英文名為crown-of-thorns seastar, 簡稱CoTS)數(shù)量的激增加劇了印度—太平洋地區(qū)的珊瑚礁退化(Baird et al, 2013;Nakamura et al, 2014; Saponari et al, 2015)。例如,1985 年至 2012 年期間, 澳大利亞大堡礁(Great Barrier Reef, GBR)的珊瑚覆蓋面積減少了約50%,其中 42%歸因于長棘海星的破壞(De'ath et al,2012)。目前, 大堡礁正在經(jīng)歷自20 世紀(jì)60 年代以來有記錄的第四次大規(guī)模長棘海星暴發(fā)(Pratchett et al, 2014, 2017)。與此同時(shí), 印度—太平洋地區(qū)的許多其他珊瑚礁也受到長棘海星的嚴(yán)重影響, 包括法屬波利尼西亞(Kayal et al, 2012)、印度尼西亞(Baird et al, 2013)和日本沖繩(Nakamura et al, 2014)的珊瑚礁。我國的珊瑚礁也未逃脫這一命運(yùn)。據(jù)報(bào)道, 自2004 年以來, 西沙群島海域珊瑚礁已經(jīng)經(jīng)歷了兩次長棘海星大規(guī)模暴發(fā)事件, 其中在第一次暴發(fā)期間,長棘海星的密度每公頃高達(dá)20000 只, 珊瑚的覆蓋率從最初的60%多退化到不足10%, 而且經(jīng)歷長棘海星暴發(fā)的珊瑚礁至少需要10～15 年的時(shí)間才能逐漸恢復(fù)(吳鐘解 等, 2011; 李元超 等, 2019)。

盡管在過去30 年里進(jìn)行了大量的研究工作, 但制定有效的管理戰(zhàn)略以控制長棘海星暴發(fā)仍然受到很多不確定性的限制(Pratchett et al, 2017)。其中一部分原因來自對(duì)野外原位長棘海星幼蟲的了解有限。海洋浮游動(dòng)物的分類鑒定通常是通過光學(xué)顯微鏡完成的, 要成功進(jìn)行這項(xiàng)工作, 往往需要豐富的技能和大量的培訓(xùn)。即便如此, 僅根據(jù)形態(tài)來區(qū)分長棘海星幼蟲與其他海星及海參的幼蟲幾乎是不可能的(Uthicke et al, 2015); 而且由于食物可獲得性的不同, 導(dǎo)致長棘海星幼蟲發(fā)育和形態(tài)上的表型可塑性, 使視覺識(shí)別更復(fù)雜且難度更高(Wolfe et al,2015)。因此, 研發(fā)一種新的識(shí)別手段尤為重要, 而遺傳鑒定是一種高效且有用的工具。

線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(mtCOI, mitochondrial cytochrome oxidase subunit I)基因是一種線粒體基因, 因其具有高度保守以及高拷貝數(shù)的特性, 常被用作許多類群的DNA 條形碼(Hebert et al, 2003; 位正鵬 等, 2009), 包括棘皮動(dòng)物(Ward et al, 2008)和浮游動(dòng)物(Bucklin et al, 2016)。而且, 相比核DNA,線粒體基因具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率高和母系遺傳等特點(diǎn)(Gérard et al, 2008)。此外,mtCOI序列信息在遺傳數(shù)據(jù)庫中的可獲得性, 使物種特定的遺傳序列得以確定。因此本研究以長棘海星ApmtCOI基因和線粒體基因?yàn)榘悬c(diǎn), 設(shè)計(jì)篩選引物, 以建立一種針對(duì)我國南海海域長棘海星特異性的PCR 檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

成體海星的采集: 藍(lán)指海星(Linckia laevigata)、面 包 海 星(Culcita novaeguineae) 、 粒 皮 海 星(Choriaster granulatus)和呂宋棘海星(Echinaster luzonicus)均 采 自 西 沙 七 連 嶼 趙 述 島(16°58.117′N,112°14.848′E)(圖1)。

圖1 各種海星樣品D5: 面包海星, L5: 藍(lán)指海星, X5: 粒皮海星, H5: 呂宋棘海星Fig. 1 Various starfish samples. D5: Culcita novaeguineae;L5: Linckia laevigata; X5: Choriaster granulatus; H5:Echinaster luzonicus

長棘海星幼體的采集: 2021 年9 月初將長棘海星成體采集上岸, 培養(yǎng)在循環(huán)水的水族缸中, 使用1-甲基腺嘌呤進(jìn)行體內(nèi)注射催產(chǎn)(Tian et al, 2017),取20 只原腸胚期幼蟲裝入2mL 凍存管中, 速凍于液氮用于后續(xù)基因組DNA 提取。

浮游生物樣品的采集: 基于長棘海星偏食石珊瑚的特性, 我們?cè)谖魃橙簫u七連嶼選取6 個(gè)具有不同活珊瑚覆蓋率的點(diǎn)作為樣品采集站位(表1)。2021年 10 月 21 日, 使用錐形淺水Ⅱ型浮游生物網(wǎng)(0.5mm 孔徑)從水下10m 至海面進(jìn)行垂直拖網(wǎng)采樣,每個(gè)站位拖網(wǎng)水體積總共為5m3, 富集為500mL,收集于白色塑料瓶中。將水樣立即帶回海南西沙海洋環(huán)境國家野外科學(xué)觀測(cè)研究站實(shí)驗(yàn)室, 0.45μm 濾膜真空抽濾后裝入2mL 凍存管, 速凍于液氮。

表1 樣品采集的站位Tab. 1 Sampling stations

1.2 基因組DNA 的提取

參照TIANamp Marine Animals DNA Kit 試劑盒(天根, 北京), 分別提取成體海星、長棘海星幼體和浮游生物樣品中的基因組DNA。所有樣品均使用NanoDrop-2000 分光光度計(jì)檢測(cè) DNA 的濃度和純度。然后凍存于–20 ℃, 備用。

1.3 引物來源及海星成體目的基因PCR 擴(kuò)增

基于完整的長棘海星線粒體 DNA(16234bp,GenBank 登錄號(hào)為AB231475.1), 通過NCBI 網(wǎng)站中的Primer-BLAST 根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則(Ye et al, 2012)設(shè)計(jì)了特異性引物對(duì)AcanP-TF/AcanP-TR, 其他引物則來自參考文獻(xiàn)(表2)。各引物由生工生物工程股份有限公司合成。

表2 PCR 引物Tab. 2 PCR primers

目的基因PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)總體積為25μL: 引物 0.6μL, 2×Phanta Max Master Mix(諾唯贊, 南京)12.5μL, DNA 模板(終濃度為1～10ng·μL–1)1μL,ddH2O 補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件: 95 ℃ 3min;95 ℃ 15s, 60 ℃ /57 ℃ 15s, 72 ℃ 30s/1min, 34個(gè)循環(huán);72 ℃ 10min 。各引物的退火溫度和延伸時(shí)間見表3,以ddH2O 作為陰性對(duì)照, 長棘海星幼體基因組DNA作為陽性對(duì)照。

1.4 長棘海星幼體特異性引物的最佳退火溫度

根據(jù)1.3 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 選取引物2aooniF/2aooniR進(jìn)一步研究。根據(jù)該引物的Tm 值, 將退火溫度分別設(shè)置為56.5、57.5、58.5、59.5、60.5 和61.5 ℃, 對(duì)長棘海星幼蟲樣品進(jìn)行梯度PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系同1.3, 其他擴(kuò)增條件見表3, 以ddH2O 作為陰性對(duì)照。

表3 PCR 反應(yīng)條件Tab. 3 PCR reaction conditions

1.5 長棘海星幼體特異性引物的靈敏度檢測(cè)

將長棘海星幼體基因組 DNA 的濃度4.17ng·μL–1按10 倍的梯度稀釋至4.17×10–8ng·μL–1,并根據(jù)1.4 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 選取引物2aooniF/2aooniR在58.5℃進(jìn)行該引物靈敏度的檢測(cè), 反應(yīng)體系和其余擴(kuò)增條件同1.4。

1.6 野外浮游生物樣品中長棘海星幼體的檢測(cè)

使用引物2aooniF/2aooniR, 在退火溫度為58.5℃時(shí)對(duì)浮游生物樣品基因組DNA 進(jìn)行長棘海星幼體目的片段的擴(kuò)增。反應(yīng)體系和其余擴(kuò)增條件同1.4。

1.7 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

使用1.2%的瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳(135V, 28min), 260nm 凝膠成像儀下觀察拍照, 確認(rèn)目的條帶。利用通用型DNA 純化回收試劑盒(天根,北京)對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化, 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物, 將純化產(chǎn)物送往公司進(jìn)行測(cè)序(天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司, 廣州)。利用 NCBI 中的BLAST 檢索, 將測(cè)序成功的序列與GenBank 中已記錄長棘海星線粒體基因序列進(jìn)行相似性比對(duì), 相似性高且E 值為0 的序列即為比對(duì)成功的序列, 比對(duì)成功的樣品即為陽性樣品。

2 結(jié)果

2.1 長棘海星特異性引物

利用4 對(duì)引物對(duì)長棘海星幼體和其他成體海星的基因組進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 4 對(duì)引物均只能擴(kuò)增出長棘海星幼體基因組目的片段, 無法擴(kuò)出其他海星的基因組DNA, 且擴(kuò)增的長棘海星目的條帶清晰,無雜帶或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。表明這4 對(duì)引物都可以用于鑒定長棘海星幼體。

圖2 不同引物的特異性檢測(cè)M: 2000bp marker; 1—6 分別為COST-F-1321/COST-R-1446 引物擴(kuò)增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性; 7—12分別為2aooniF/2aooniR 引物擴(kuò)增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性; 13—18 分別為AcanP-TF/TR 引物擴(kuò)增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性; 19—24 分別為COTS-F-69/COTS-R-987 引物擴(kuò)增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性Fig. 2 Specificity screening of different primers. M: 2000bp marker; 1-6: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by COST-F-1321/COST-R-1446 primer; 7-12: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by 2aooniF/2aooniR primer; 13-18: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by AcanP-TF/TR primer; 19-24: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by COTS-F-69/COTS-R-987 primer

2.2 長棘海星幼體特異性檢測(cè)引物的最佳退火溫度

鑒于長棘海星引物特異性檢測(cè)結(jié)果, 我們挑選2aooniF/2aooniR 引物進(jìn)行其最佳退火溫度的篩選。結(jié)果顯示, 改變2aooniF/2aooniR 引物的退火溫度,得到的目的條帶清晰且均無非特異性擴(kuò)增(圖3)。表明退火溫度在56.5～61.5℃之間時(shí), 2aooniF/2aooniR具有較佳的擴(kuò)增效果。

圖3 2aooniF/2aooniR 引物在不同退火溫度下對(duì)長棘海星幼體的擴(kuò)增M: 2000bp marker; 1—6 分別是退火溫度為56.5、57.5、58.5、59.5、60.5、61.5℃下對(duì)長棘海星幼體的擴(kuò)增; 7 為陰性對(duì)照Fig. 3 Amplification of 2aooniF/2aooniR primer at different annealing temperatures on CoTS larvae. M:2000bp marker; 1-6: the different annealing temperatures which were 56.5, 57.5, 58.5, 59.5, 60.5 and 61.5 ℃,respectively; 7: negative control sample

2.3 長棘海星幼體特異性引物的靈敏度檢測(cè)

基于2.2 的結(jié)果, 選取退火溫度為58.5℃進(jìn)行2aooniF/2aooniR 引物的靈敏度檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 當(dāng)DNA 濃度為4.17ng·μL–1時(shí), 條帶最亮。隨著DNA濃度的降低, 其擴(kuò)增的條帶亮度也逐漸減弱, 當(dāng)濃度為4.17×10–4ng·μL–1時(shí), 瓊脂糖凝膠電泳完全無法檢測(cè)到目的條帶, 而濃度為4.17×10–3ng·μL–1時(shí)可以檢測(cè)到目的片段(圖4)。表明2aooniF/2aooniR 引物對(duì)長棘海星幼體 DNA 檢測(cè)的濃度最低限為4.17pg·μL–1, 即皮克(pg)級(jí)別。

圖4 2aooniF/2aooniR 引物在退火溫度為58.5℃下, 對(duì)不同濃度長棘海星幼體的擴(kuò)增M: 2000bp marker; 1—9 濃度分別為4.17、4.17×10–1、4.17×10–2、4.17×10–3 、 4.17×10–4 、 4.17×10–5 、 4.17×10–6 、 4.17×10–7 、4.17×10–8ng·μL–1; 10 為陰性對(duì)照Fig. 4 Amplification of 2aooniF/2aooniR primer at 58.5 ℃annealing temperatures on CoTS larvae. M: 2000bp marker;1-9: 4.17, 4.17×10–1, 4.17×10–2, 4.17×10–3, 4.17×10–4,4.17×10–5, 4.17×10–6, 4.17×10–7 and 4.17×10–8 ng·μL–1,respectively; 10: negative control sample

2.4 野外浮游生物樣品長棘海星幼體的檢測(cè)

利用2.2 篩選的特異性引物2aooniF/2aooniR 和退火溫度58.5℃對(duì)西沙群島七連嶼浮游生物樣品進(jìn)行長棘海星幼體目的片段的擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在七連嶼的6 個(gè)站位中, 4 號(hào)、5 號(hào)和6 號(hào)三個(gè)站位樣品均能成功擴(kuò)增出目的基因, 而其他站位的樣品未擴(kuò)增出目的片段(圖5)。表明七連嶼中島、南島和北沙洲存在長棘海星幼體, 且所采集水體中長棘海星幼體的DNA 濃度高于皮克級(jí)別。

圖5 2aooniF/2aooniR 引物在58.5℃退火溫度下對(duì)浮游生物樣品的擴(kuò)增M: 為2000bp marker; 1—8 分別為58.5℃下擴(kuò)增的XSZ、ZS-1、ZS-2、ZD、ND、BSZ、陰性、陽性樣品Fig. 5 Amplification of 2aooniF/2aooniR primer at 58.5 ℃annealing temperatures on the plankton samples. M: 2000 bp marker; 1-8: XSZ, ZS-1, ZS-2, ZD, ND, BSZ, negative and positive control sample was amplified at 58.5 ℃annealing temperatures, respectively

3 討論

引物與目標(biāo)DNA 的成功結(jié)合是PCR 擴(kuò)增中的關(guān)鍵一步, 主要受到退火溫度的影響。本研究通過對(duì)引物特異性、靈敏性及其退火溫度的摸索, 建立了長棘海星幼體的檢測(cè)技術(shù), 并應(yīng)用到南海西沙七連嶼長棘海星幼體的檢測(cè)中。研究發(fā)現(xiàn)引物2aooniF/2aooniR 在退火溫度為58.5℃進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí), 其擴(kuò)增效果最佳, 其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到皮克級(jí)別, 并且分別在中島、南島和北沙洲檢測(cè)到長棘海星幼體。Suzuki 等(2016)也得到相似的結(jié)果, 引物2aooniF/2aooniR 可以成功擴(kuò)增出單個(gè)長棘海星幼蟲的目的片段。這表明2aooniF/2aooniR 引物的靈敏度高, 可應(yīng)用于環(huán)境樣品中長棘海星幼蟲的監(jiān)測(cè)。

有研究表明長棘海星浮游幼蟲孵化時(shí)間一般在9～43d 之間, 時(shí)長的波動(dòng)取決于食物和溫度等各種因素(Pratchett et al, 2017)。野外研究表明, 大堡礁長棘海星產(chǎn)卵幼蟲的浮游階段一般少于30d (Uthicke et al, 2015)。鑒于本研究所有浮游生物樣品均采集2021 年10 月21 日, 推測(cè)本研究檢測(cè)到的幼蟲可能來自2021 年9 月中旬至10 月中上旬, 表明南海長棘海星在9 月份和10 月份仍能產(chǎn)卵受精, 這進(jìn)一步拓展了前期關(guān)于南海長棘海星的產(chǎn)卵主要發(fā)生在8月份的推測(cè)(Tian et al, 2017)。

海洋建模預(yù)測(cè)表明長棘海星幼蟲一般的旅行距離是35～75km, 最大旅行距離為150km(Dight et al,1990)。雖然七連嶼諸島之間最遠(yuǎn)距離不超20km, 而且各島之間的距離處于長棘海星幼蟲能到達(dá)的區(qū)域范圍內(nèi)。但本研究僅在西沙七連嶼的北沙洲、南島和中島檢測(cè)到長棘海星幼蟲, 而趙述島和西沙洲均未檢測(cè)到, 這可能與其他因素有關(guān), 如洋流的速度、方向、強(qiáng)度以及幼蟲的食物等(Pratchett et al, 2017)。有研究表明, 在較慢的洋流中, 長棘海星幼蟲可以在單個(gè)珊瑚礁尺度上大量滯留(Wooldridge et al,2015)。中尺度和亞中尺度環(huán)流也會(huì)減少幼蟲的遠(yuǎn)距離擴(kuò)散(Wolanski et al, 1988)。此外, 浮游植物(如藻類等)會(huì)影響幼蟲在水體中的分布。Sameoto 等(2008)的研究表明, 幼蟲遇到藻類時(shí)會(huì)停止前行, 并在該位置發(fā)生聚集。由于環(huán)境因素的復(fù)雜性以及本研究所檢測(cè)環(huán)境因子的局限性, 無法探明影響長棘海星幼蟲地理分布特征的原因。因此要揭示幼蟲種群地理分布的驅(qū)動(dòng)機(jī)理, 需進(jìn)一步探究環(huán)境因子與幼蟲種群豐度和分布之間的耦合關(guān)系。此外, 盡管本研究建立了野外長棘海星幼蟲的檢測(cè)技術(shù), 但是要了解幼蟲種群的動(dòng)態(tài)變化, 對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行定量分析是必不可少的一步。因此在今后的研究中, 需著力開發(fā)一套針對(duì)長棘海星野外環(huán)境中幼蟲的定量檢測(cè)技術(shù)。