紅樹植物擬海桑及其親本的根際細(xì)菌群落特征分析

葉錦成, 陳毅青, 高琳, 周鮮嬌, 鐘才榮, 張穎, 王蕓

1. 嶺南師范學(xué)院紅樹林研究院, 廣東 湛江 524048;

2. 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)學(xué)系, 廣東 廣州 510632;

3. 海南省林業(yè)科學(xué)研究院(海南省紅樹林研究院), 海南 ?？?571129

紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)廣泛分布于熱帶、亞熱帶海岸, 具有美化環(huán)境、保護(hù)海岸、支持沿岸區(qū)域水生生物的棲息和覓食等生態(tài)服務(wù)功能(Giri et al,2011; Alongi, 2014; 江睿 等, 2021)。紅樹林濕地還擁有豐富的生物多樣性, 但由于氣候變化、海平面上升和人為活動(dòng)的影響, 紅樹林濕地面積迅速減少,全球每年會(huì)減少1%～2%(Duke et al, 2007; Giri et al,2011; Luis et al, 2019)。在過去的半個(gè)世紀(jì)里, 紅樹林濕地的面積已經(jīng)下降了 30%～50%(Duke et al,2007; Polidoro et al, 2010; Donato et al, 2011)。如何保護(hù)并修復(fù)紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)是當(dāng)前紅樹林生態(tài)保護(hù)工作的一個(gè)重要研究內(nèi)容。

海桑屬(Sonneratia)紅樹植物是紅樹林的重要樹種之一, 通常被認(rèn)為是紅樹林海岸的先鋒種(毛禮米等, 2009; 李詩川 等, 2014), 開展海桑屬紅樹植物的研究對(duì)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)具有重要意義。在我國的海桑屬目前包含 6 個(gè)有效種(Duke, 1994;Zhong et al, 2020), 分別為: 海桑(S.caseolaris)、杯萼海桑(S.alba)、卵葉海桑(S.ovata)、擬海桑(S.×gulngai)、海南海桑(S.×hainanensis)和無瓣海桑(S.apetala)。擬海桑(S.×gulngai)最早由Muller 等(1966)發(fā)現(xiàn), 但未正式命名, 后由Duke(1984)于澳大利亞東北部再次發(fā)現(xiàn)并命名。1993 年, 華南植物所高蘊(yùn)璋(1993)在我國海南島首次發(fā)現(xiàn)海桑屬新種擬海桑。王瑞江 等(1999)通過形態(tài)學(xué)、花粉學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及其他方面的比較研究, 認(rèn)為在中國海南發(fā)現(xiàn)的擬海桑為雜交種, 它的嫌疑親本為杯萼海桑(S.alba)和海桑(S.caseolaris), 并歸并入S.×gulngaiN. C. Duke。植物分類學(xué)家通過對(duì)擬海桑的分類學(xué)特征研究發(fā)現(xiàn), 擬海桑是海桑和杯萼海桑的自然雜交種, 擬海桑及其親本是廣布種, 在中國海南省以及澳大利亞等地均有分布(Muller et al,1966; 高蘊(yùn)璋, 1993; 王瑞江 等, 1999; Zhong et al,2020)。王瑞江 等(1999)通過對(duì)野外雜交種植株的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 擬海桑植株個(gè)體明顯比杯萼海桑和海桑高大, 這與Duke(1984)對(duì)澳大利亞的海桑植物雜種研究結(jié)果一致。

已有大量的研究表明, 根際微生物在植物的生長發(fā)育和植物病蟲害的生物防治等方面都具有十分重要的生態(tài)學(xué)意義(李晴晴 等, 2019; 劉京偉 等,2021)。此外, 宿主遺傳學(xué)和植物微生物組成之間存在相互作用, 其中與根相關(guān)的微生物群落部分會(huì)受宿主遺傳因素的影響(Peiffer et al, 2013; Schlaeppi et al, 2014; Edwards et al, 2015; Naylor et al, 2017;Deng et al, 2021), 植物表型能作為微生物組功能的預(yù)測(cè)因子和讀數(shù)(Wagner, 2021)。最新研究表明, 根際微生物群還可以促進(jìn)植物表型可塑性, 可以通過植物激素的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育(Lu et al,2018)。Wang 等(2010)還從紅樹植物中分離出一種在溫室被證實(shí)能夠顯著改善實(shí)驗(yàn)植物生長的AMF(arbuscular mycorrhizal fungi), 可導(dǎo)致植物的高度、地面直徑和生物量增加, 并使實(shí)驗(yàn)植物對(duì)N、P 和K 的吸收增加。因此研究子代雜交種擬海桑與其親本的根際微生物群落關(guān)系對(duì)于解釋雜交種擬海桑生長優(yōu)勢(shì)具有重要意義。

盡管目前研究者們已經(jīng)在植物微生物群、根系分泌物和植物生長繁殖之間的相互作用等方面取得了重大進(jìn)展, 但是對(duì)海桑屬紅樹植物根際微生物這方面的報(bào)道仍然較少(Yang et al, 2014; 顏棟美 等,2018; Muwawa et al, 2021)。針對(duì)野外雜交種擬海桑生長能力較強(qiáng)的特性, 國內(nèi)外尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)造成這種現(xiàn)象的原因進(jìn)行解釋。目前第二代測(cè)序技術(shù)——高通量測(cè)序技術(shù)因其高效性、準(zhǔn)確性成為研究土壤微生物的主要方法(Margulies et al, 2005;Quail et al, 2008; 周曉光 等, 2010; 閆紹鵬 等,2012)。故本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中國海南島東寨港的雜交種擬海桑及其親本海桑和杯萼海桑的根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究, 分析雜交子代與親本間的根際細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征的差異, 對(duì)解釋擬海桑的生存優(yōu)勢(shì)和紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和修復(fù)工作具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)樣本于2018 年6 月采集自海南省東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)內(nèi), 在采樣區(qū)100m×200m 的區(qū)域中,采用蛇形采樣, 每種植物每隔30m 選一個(gè)點(diǎn), 利用土壤取樣器在植物根區(qū), 分別采集5 份土壤混合均勻后裝入無菌樣品袋中, 并保存在專門的便攜式冷卻器中, 共獲得土樣9 個(gè)。采集當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理, 在實(shí)驗(yàn)室中, 每個(gè)土樣被分成兩份: 一份用于土壤理化性質(zhì)分析, 在4℃下儲(chǔ)存, 另一份在–80℃下儲(chǔ)存用于進(jìn)一步的根際土壤總DNA 提取。本研究所采樣本海桑的縮寫為Sc, 杯萼海?？s寫為Sal、擬海?？s寫為Sg。

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤全氮(total nitrogen, TN)和土壤全碳(total carbon, TC)利用碳氮元素分析儀(Elementar Vario EL Ⅲ, Elementar, 德國)測(cè)定(張威 等, 2009)。土壤全磷(total phosphorus, TP)采用鉬銻抗顯比色法測(cè)出,速效鉀(available potassium, AK)采用醋酸銨浸提—火焰光度計(jì)法測(cè)出(鮑士旦, 2000), 每個(gè)土樣重復(fù)3 次。

1.3 土壤細(xì)菌群落組成測(cè)定

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 Alpha 多樣性分析

單樣本的OTU 多樣性分析(alpha diversity)可以反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性, 利用每個(gè)OTU 在樣品中的有效序列的絕對(duì)豐度和相對(duì)信息(Edgar, 2013), 使用 Qiime(Version1.9.1)計(jì)算Observed-OTUs、ACE、Shannon、Simpson 和Chao1等指數(shù), 以評(píng)估各樣本中微生物群落的物種豐富度和多樣性等差異。Chao1 和ACE 指數(shù)簡單指群落中物種的數(shù)量, 而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。

1.4.2 Beta 多樣性分析

利用Qiime(Version1.9.1)軟件對(duì)所測(cè)所有樣本的細(xì)菌群落構(gòu)成進(jìn)行分析, 采用主坐標(biāo)分析(PCoA)和PERMANOVA 對(duì)樣本間的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)差異顯著性進(jìn)行分析。

1.4.3 細(xì)菌類群的分類

為更好地尋找影響微生物群落的關(guān)鍵種, 確定所有微生物類群的作用和貢獻(xiàn), 根據(jù)Dai 等(2016)提出的物種豐度劃分, 把稀有類群的閾值設(shè)置為0.1%, 豐富類群的閾值設(shè)置為1%, 并根據(jù)它們的豐度將所有可操作的分類單元分為如下6 個(gè)專屬類別:稀有物種(rare taxa, RT), 即在所有的樣本中豐度均低于0.1%; 豐富物種(abundant taxa, AT), 在所有的樣本中豐度均高于1%; 中等物種(moderate taxa,MT), 在所有樣本中豐度在0.1%至1%之間; 條件稀有物種(conditionally rare taxa, CRT), 在所有樣本中豐度均低于1%, 同時(shí)在部分樣本中豐度低于0.1%;條件豐富物種(conditionally abundant taxa, CAT), 在所有樣本中豐度均高于0.1%, 同時(shí)在部分樣本中豐度高于1%; 條件稀有或豐富物種(conditionally rare or abundant taxa, CRAT), 在部分樣本中的豐度在低于0.1%, 同時(shí)在部分樣本中的豐度高于1%。使用R語言(Version3.5.0)按照拆分標(biāo)準(zhǔn)把所有的OTUs 進(jìn)行拆分。

1.4.4 PICRUSt 功能預(yù)測(cè)

PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)功能預(yù)測(cè)是基于微生物16S 序列間的進(jìn)化距離以及已知全序列的微生物的功能基因拷貝數(shù), 對(duì)其他微生物物種功能基因的拷貝數(shù)進(jìn)行推測(cè), 進(jìn)而估計(jì)整個(gè)樣品中各個(gè)功能基因的豐度分布的一種方法。其可以較準(zhǔn)確地對(duì)微生物群落的功能進(jìn)行分析。根據(jù)PICRUSt 開發(fā)者的評(píng)測(cè), 對(duì)于NSTI＜0.05 的腸道微生物樣品和NSTI≈0.17 的土壤樣品, PICRUSt 的預(yù)測(cè)結(jié)果較好, 而對(duì)于 NSTI≈0.23 的微生物樣品,PICRUSt 的預(yù)測(cè)結(jié)果較差。該方法首先通過祖源序列重建算法, 對(duì)GreenGene 數(shù)據(jù)庫中收錄的微生物進(jìn)行16S rRNA 拷貝數(shù)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 、 eggCOG(Evolutionary Genealogy of Genes: Clusters of Orthologous Groups of proteins)及RFAM 功能注釋對(duì)應(yīng)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行推測(cè), 得到每個(gè)物種單位拷貝的16S rDNA 對(duì)應(yīng)的功能注釋的豐度。然后根據(jù)上一步推測(cè)得到的數(shù)據(jù), 對(duì)樣品中各個(gè)物種的16S rRNA 拷貝數(shù)進(jìn)行校正。之后根據(jù)校正后的16S rRNA 拷貝數(shù), 對(duì)樣品中各個(gè)功能或注釋條目的拷貝數(shù)進(jìn)行估計(jì), 并進(jìn)行后續(xù)的差異分析。最后根據(jù)KEGG 和eggCOG 數(shù)據(jù)庫中的分層分類信息, 在不同層級(jí)將功能基因進(jìn)行歸類, 并計(jì)算不同分層水平下, 不同類別功能基因在樣品中的豐度(Langille et al, 2013)。

現(xiàn)代企業(yè)的管理者和領(lǐng)導(dǎo)者要想繼續(xù)提升自身的能力和技能，大多通過商學(xué)院教育獲得，途徑相對(duì)單一。目前，雖然商學(xué)院的發(fā)展已經(jīng)初具規(guī)模，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前企業(yè)的需要，這也是加強(qiáng)商學(xué)院人才培養(yǎng)，積極拓展路徑的現(xiàn)實(shí)需要。商學(xué)院的發(fā)展必然跟經(jīng)濟(jì)體系的發(fā)展有著直接的關(guān)系，作為經(jīng)濟(jì)生活的重要參與者和建構(gòu)者，商學(xué)院的發(fā)展與經(jīng)濟(jì)發(fā)展密切相關(guān)，商學(xué)院的發(fā)展要順應(yīng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要和趨勢(shì)，在人才培養(yǎng)路徑上要切合經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)的需求。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Qiime(Version1.9.1)軟件評(píng)估樣品的根際土壤細(xì)菌菌群多樣性, 計(jì)算多樣性指數(shù)后使用SPSS(Version13.0)進(jìn)行ANOVA+Turkey HSD test。根據(jù)不同的距離矩陣計(jì)算方式計(jì)算 Unweighted Unifrac, Weighted Unifrac, Bray Curtis, Euclidean 距離矩陣后使用R 語言(Version 3.5.0)進(jìn)行PCoA 分析和作PCoA 圖進(jìn)行Beta 多樣性展示(Hamady et al,2010; Yatsunenko et al, 2012; Jiang et al, 2013)。使用Microsoft Excel 2016 對(duì)測(cè)序所得的原始OTUtable中的各分類菌群進(jìn)行豐度的排序, 選擇優(yōu)勢(shì)菌群使用GraphPad Prism(Version 8.0)繪制相對(duì)豐度累加圖展示。此外還使用SPSS(Version13.0)對(duì)土壤理化性質(zhì)環(huán)境因子進(jìn)行ANOVA+Duncan 檢驗(yàn)以及其和菌群的相關(guān)性分析(Spearman), 檢驗(yàn)顯著性水平為P＜0.05。此外PERMANOVA 組間相似性統(tǒng)計(jì)分析、物種豐度拆分、熱圖、三元圖的繪制均由R 語言(Version 3.5.0)進(jìn)行(Oksanen et al, 2007)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)

對(duì)三種樣品, 每種三個(gè)重復(fù), 共9 個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果如表1。根據(jù)測(cè)序數(shù)量可知, 每個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)量均超過3 萬條, 稀釋性曲線趨于平臺(tái)期(數(shù)據(jù)沒有顯示), 說明結(jié)果能夠比較全面真實(shí)地反映根際土壤微生物群落組成。聚類后共獲得11475個(gè)有效OTU(97%的相似度)。共獲得30 門, 242 科,251 屬的根際土壤細(xì)菌。門、科、屬、種的可注釋水平分別為86.95%、41.53%、10.41%和0.36%。

表1 土壤樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)Tab. 1 Statistics of soil samples volume sequencing data

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與差異性分析

在門水平上, 由圖1a 可知, 三種樣品的根際土壤細(xì)菌主要類群包括變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、棲熱菌門(Thermi)和厚壁菌門(Firmicutes)7 個(gè)類群。變形菌門是所有樣本共同的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門, 在各組樣本中占比均達(dá)到40%以上。不同樣品的豐富細(xì)菌類群種類和相對(duì)豐度具有差異。在Sc 樣品中豐度排名前四的門依次是變形菌門(Proteobacteria) 40.38%、綠彎菌門(Chloroflexi)14.37%、浮霉菌門(Planctomycetes)6.02%、擬桿菌門(Bacteroidetes)4.33%。豐度占比達(dá)65.15%。在Sg 樣品中豐度排名前四的門依次是變形菌 門 (Proteobacteria)45.78% 、 浮 霉 菌 門(Planctomycetes)11.25% 、 綠 彎 菌 門(Chloroflexi)6.84%、酸桿菌門(Acidobacteria)6.5%。豐度占比達(dá)70.37%。在Sal 樣品中豐度排名前四的門依次是變形菌門(Proteobacteria)47.35%、棲熱菌門(Thermi)19.84%、擬桿菌門(Bacteroidetes)13.32%、厚壁菌門(Firmicutes)5.86%。豐度占比達(dá)86.37%。其中Sal樣品的豐度豐富細(xì)菌類群在三種樣品中豐度占比最高, 具有高優(yōu)勢(shì)。從豐度豐富細(xì)菌類群組成方面分析, 樣品Sg 的菌群各門與Sc 更為相似, 樣品Sal 的菌群組成與Sc、Sg 的差異較大。從豐度方面分析, 豐富細(xì)菌類群在子代和親本的豐度具有顯著差異(圖2),例如 Sg 的酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的豐度分別為4.3%和6.5%, 顯著高于親本的1%～2%的含量, 且與Sc 比較更為顯著。在Sal中占比高達(dá)19.8%的棲熱菌門(Thermi)在Sg 和Sc 中占比少于1%。占比5%的熱袍菌門(Thermotogae)在Sg 中消失。在屬水平上, 結(jié)合圖1b 分析, 發(fā)現(xiàn)在屬水平上不同樣品間的豐度豐富根際細(xì)菌類群的組成也具有較大的差異。在數(shù)量上, 隨著分類水平的降低, 三種樣品屬水平豐度豐富菌群種類減少。此外Sg 浮霉菌門的Planctomyces屬相對(duì)豐度高于其他樣品, 棲熱菌門的g__B-42 屬和變形菌門的Sulfurimonas屬的相對(duì)豐度低于其他樣品。

圖1 各樣本細(xì)菌群落構(gòu)成與比較。a. 各樣品菌群組成在門水平相對(duì)豐度; b. 各樣品菌群組成在屬水平相對(duì)豐度; c. Venn 圖展示不同樣本的共有和特有的OTU 數(shù)量; d.基于Weighted unifrac 距離的主坐標(biāo)分析Fig. 1 Composition and comparison of bacterial community in each mangrove species. (a) Relative abundance map at phylum level. (b) Relative abundance map at genus level. (c) The Venn diagram shows the number of common and unique OTUs for different samples. (d) Principal coordinate analysis generated using Weighted unifrac distance

圖2 主要細(xì)菌菌群(門水平)的豐度差異配對(duì)樣本T 檢驗(yàn), ***P＜0.001; **P＜0.01; *P ＜0.05; ns P>0.05Fig. 2 The difference in the abundance of the main bacterial flora(Phylum level, Paired-Samples T Test , ***P＜0.001;**P＜0.01; *P ＜0.05; ns P>0.05)

2.3 Venn 圖分析

通過維恩圖可以直觀地比較不同海桑樣品根際土壤樣本間共有和特有的OTU 數(shù)量, 并反映出樣本在OTU 水平上的細(xì)菌物種組成差異(圖1c)。三種海桑樣品, 9 個(gè)樣本共測(cè)出11475 條OTU, 其中Sc5980條、Sg6838 條、Sal1329 條。三種樣品共有OTU 數(shù)目為331, 占比2.8%。Sc 和Sg 共有的細(xì)菌OTU 數(shù)量為1255, 同時(shí)Sc 特有OTU 數(shù)量為4048, Sg 為5113; Sc 和Sg 兩者共有細(xì)菌OTU 數(shù)量占14.12%,同時(shí)Sc 和Sg 各自特有的OTU 數(shù)量分別占35%和43.5%。Sal 和Sg 共有的細(xì)菌OTU 數(shù)量為139, 同時(shí)Sal 特有OTU 數(shù)量為513, Sg 為5113; Sal 和Sg兩者共有細(xì)菌OTU 數(shù)量占1.18%, 同時(shí)Sal 特有的OTU 數(shù)量占4.36%。說明三種樣品中菌群結(jié)構(gòu)差異程度各不相同。Sc 和Sg 的共有OTU 數(shù)目最多, 差異程度最小, 相似性最高。Sal 和Sg 的差異程度大,相似性低。

2.4 Alpha 多樣性分析

根際細(xì)菌群落的各α多樣性指數(shù)的計(jì)算結(jié)果表明, 三種海桑根際細(xì)菌群落多樣性高(表2)。對(duì)樣本間的多樣性指數(shù)進(jìn)行ANOVA+Turkey HSD test發(fā)現(xiàn), Sc 和 Sg 樣本的 Observed-OTUs、ACE、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Chao1 指數(shù)數(shù)值相似性高, 而 Sal 樣本的 Observed-OTUs、ACE、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Chao1 指數(shù)與Sc和Sg 樣本比較顯著偏低。表明樣本Sc 和樣本Sg間的多樣性無顯著性差異, 而Sc 與Sal、Sal 與Sg之間存在顯著差異性。

表2 三種海桑的根際細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Tab. 2 Alpha diversity index of rhizosphere bacterial community of three species of Sonneratia (Mean±SD)

2.5 Beta 多樣性分析

Beta 多樣性統(tǒng)計(jì)分析揭示了樣本之間的細(xì)菌群落差異, 基于Bary-Curtis、Enclidean、unweighted Unifrac、weighted Unifrac 距離。利用PCoA 分析, 不同距離矩陣PCoA 結(jié)果均表明不同海桑樣品之間的根際微生物細(xì)菌的群落組成具有一定的差異性, 其中Weighted Unifrac 距離關(guān)注樣品間物種種類以及數(shù)量的組成差異。不同樣本間的Weighted unifrac distance 均值Sc 與Sg 為0.57, Sal 與Sg 為0.73, Sc與Sal 為0.73。PCoA 分析結(jié)果(圖1d)顯示Sg 與Sc的距離值更短, 表明它們根際細(xì)菌菌群的物種種類以及數(shù)量的組成更為相似。 進(jìn)一步利用PERMANOVA 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三種樣品根際土壤細(xì)菌群落組成差異并不顯著。

2.6 物種豐度劃分

所有細(xì)菌OTU 被劃分到6 個(gè)分類群類別, 對(duì)于潛在的區(qū)分群落的關(guān)鍵類群AT、CAT、CRAT 的歸類情況如下: 沒有OTU 被歸類為AT(在所有樣本中相對(duì)豐度都高于1%的OTU), CAT(僅在一些樣本中相對(duì)豐度高于1%, 但從不低于0.01%的OTU)包含2個(gè)OTU, 均屬于變形菌門, CRAT 組(在部分樣本中的相對(duì)豐度低于0.1%, 同時(shí)在部分樣本中的相對(duì)豐度高于1%)包含31 個(gè)OTU。研究認(rèn)為微生物群落的特征是少數(shù)優(yōu)勢(shì)高豐度分類群和低豐度稀有分類群影響的結(jié)果(Sogin et al, 2006; Pedrós-Alió, 2007;Galand et al, 2009), 參考Dai 等(2016)的研究方法,對(duì)本研究的每組劃分結(jié)果進(jìn)行綜合分析后認(rèn)為本研究的CRAT 組最具代表意義。對(duì)該組的物種繪制熱圖(圖3)直觀地呈現(xiàn)出多個(gè)樣本多個(gè)OTU 的全局豐度分布變化和多OTU 豐度分布的聚類關(guān)系, 并繪制三元圖(圖 4)分析各根際細(xì)菌群落之間的差異性O(shè)TUs 的貢獻(xiàn)度, 等邊三角形中圓點(diǎn)的位置由三種海桑屬樣本的根際微生物群對(duì)各OTU 相對(duì)豐度的貢獻(xiàn)確定(Dombrowski et al, 2017)。由圖3 可知,CRAT 組中Sc 樣本的高豐度OTU 均屬于變形菌門(2 個(gè)), Sg 樣本的高豐度OTU 屬于變形菌門(4 個(gè))和厚壁菌門(2 個(gè))。Sal 樣本的高豐度OTU 屬于變形菌門(12 個(gè))、擬桿菌門(4 個(gè))、綠菌門(3 個(gè))、厚壁菌門(2 個(gè))、熱袍菌門(1 個(gè))和棲熱菌門(2 個(gè))。三種樣品根據(jù)多組值間兩兩的差異程度(歐氏距離)進(jìn)行聚類發(fā)現(xiàn)樣本在系統(tǒng)關(guān)系上(圖上方的樹狀結(jié)構(gòu))分為了兩類。一類是Sc 和Sg, 另一類是Sal。結(jié)合三種樣本關(guān)鍵類群的數(shù)量和分類的差異說明了菌群的相似程度為Sc 和Sg 更相似, Sal 樣本中的菌群異質(zhì)性相對(duì)較高。圖4 中三角形的三個(gè)點(diǎn)分別代表三個(gè)樣品組, 從圖中看出距離Sc 近的有一個(gè)OTU, 來自變形菌門, 距離Sg 近的有兩個(gè)OTU 來自變形菌門和擬桿菌門, 距離Sal 近的也有兩個(gè)OTU 來自厚壁菌門和變形菌門。綜合圖3 和圖4 分析, 三種樣品中確實(shí)存在能區(qū)分三種樣品根際土壤細(xì)菌群落的關(guān)鍵OTU。

圖3 各樣本CRAT 拆分組OTU 水平熱圖Fig. 3 Heat map of OTU level of each sample CRAT split group

圖4 各樣本CRAT 拆分組OTU 水平的三元相圖Fig. 4 The ternary plot of the OTU level of each sample CRAT split group

2.7 土壤理化性質(zhì)與微生物群落多樣性的關(guān)系

對(duì)不同樣品土壤測(cè)定了全碳(TC)、全氮(TN)、全磷(TP)和速效鉀(AK)含量, 并分析計(jì)算得出碳氮比(C/N)和氮磷比(N/P), 各數(shù)值如表3 所示。結(jié)果顯示Sc 樣品的土壤全碳含量較高; Sc 和Sal 的根際土壤全氮量比Sg 高3 倍以上。

表3 土壤樣品的理化性質(zhì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)和ANOVA 顯著性分析、Duncan 檢驗(yàn)多重比較結(jié)果Tab. 3 Physicochemical characteristics of soil samples (Mean±SD) and ANOVA significance analysis, Duncan test multiple comparison results

應(yīng)用相關(guān)分析方法研究TC, TN, TP, AK, C/N,N/P 和變形菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、綠菌門、芽單胞菌門、WS3、螺旋體門、酸桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、棲熱菌門、熱袍菌門之間的相關(guān)關(guān)系, 使用Spearman 相關(guān)系數(shù)表示相關(guān)關(guān)系的強(qiáng)弱情況, 結(jié)果如表4 所示。由表4 可知, TC 與變形菌門豐度具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系; TN 和浮霉菌門、酸桿菌門、放線菌門豐度之間具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,而與綠菌門、厚壁菌門、棲熱菌門、熱袍菌門豐度之間有著顯著的正相關(guān)關(guān)系; TP 與變形菌門豐度具有顯著正相關(guān)關(guān)系。

表4 土壤理化性質(zhì)與門水平主要細(xì)菌的相關(guān)性Tab. 4 Correlation between soil physical and chemical properties and main bacteria at phylum level

2.8 PICRUSt 功能預(yù)測(cè)

本研究的樣本豐度≥0.1%OTU 水平下的NSTI值為0.15～0.18, 根據(jù)PICRUSt 開發(fā)者的評(píng)測(cè)結(jié)果(Langille et al, 2013)認(rèn)為該預(yù)測(cè)結(jié)果較好。KEGG 功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示(圖5), Environmental Information Processing 中的Membrance Transport 功能基因豐度和Metabolism 中的碳水化合物、氨基酸、能量以及脂質(zhì)代謝等功能基因在Sg 樣品中豐度比親本高。而COG 功能預(yù)測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)Metabolism 功能相關(guān)的碳水化合物、氨基酸、能量代謝等基因豐度在Sg 樣品中高于親本。RFAM 功能預(yù)測(cè)在 RFAM 數(shù)據(jù)庫(http://rfam.xfam.org/)對(duì)比發(fā)現(xiàn)Sg 樣品的RF01687(Acido-Lenti-1, 主要在變形菌門和酸桿菌門中的物種發(fā)現(xiàn))、RF01383(編碼一種屬于谷氨酸門控離子通道家族的蛋白質(zhì), 只在變形菌門中的1 個(gè)物種發(fā)現(xiàn))、RF00519(一種蛋白質(zhì)編碼的RNA, 全部在細(xì)菌的變形菌門的物種中發(fā)現(xiàn))、RF01668(一種蛋白質(zhì)編碼的RNA, 全部在細(xì)菌的變形菌門的物種中發(fā)現(xiàn))、RF00023(transfer-messenger, 主要在變形菌門、厚壁菌門、放線菌門的物種中發(fā)現(xiàn))、RF00169(細(xì)菌小信號(hào)識(shí)別顆粒RNA, 主要在變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門的物種中發(fā)現(xiàn))和 RF00010(Bacterial RNase P class A, 主要在變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門的物種中發(fā)現(xiàn))等RNA 分子的豐度顯著上升。

圖5 KEGG 二級(jí)分類預(yù)測(cè)豐度聚類熱圖功能基因豐度是功能基因數(shù)目取log10 值所得Fig. 5 KEGG secondary classification prediction of abundance clustering heat map Functional gene abundance is obtained by taking the log10 value of the number of functional genes

3 討論

紅樹林已經(jīng)適應(yīng)了潮間帶—陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)之間的界面。研究表明, 紅樹林在生理、生態(tài)和基因組水平上具有適應(yīng)性進(jìn)化(Feng et al, 2020)。以往學(xué)者們對(duì)于紅樹植物的研究大多集中于分類、分布、生理生態(tài)、用途及價(jià)值等方面(李海生, 2003), 對(duì)海桑屬紅樹植物的研究多關(guān)注無瓣海桑的引種及其所造成的影響(Ren et al, 2009, 2010; 曹雷雷 等,2015, Yu et al, 2020)。在微生物水平上研究區(qū)域的紅樹林濕地的沉積物的微生物群落結(jié)構(gòu)、污染物對(duì)微生物群落的影響、參與生物化學(xué)循環(huán)的功能菌等

(Bharathi et al, 1991; Brito et al, 2006; Tian et al,2008; Zhou et al, 2009; Jiang et al, 2013)。本文采用高通量測(cè)序技術(shù), 對(duì)具有親緣關(guān)系的三種海桑屬紅樹植物: 海桑(Sc)、杯萼海桑(Sal)、擬海桑(Sg)的根際土壤細(xì)菌種類進(jìn)行鑒定, 分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、菌群多樣性, 預(yù)測(cè)細(xì)菌的生物學(xué)功能。認(rèn)識(shí)了海桑屬紅樹植物根際土壤細(xì)菌菌群的一般結(jié)構(gòu), 探究了具有親緣關(guān)系的不同海桑屬之間在根際細(xì)菌結(jié)構(gòu)上的相似性和異質(zhì)性, 并嘗試從微生物角度去探討根際微生物組成與雜交擬海桑具有的生長優(yōu)勢(shì)的關(guān)系。

擬海桑及其親本三種海桑屬樣品的根際土壤細(xì)菌多樣性較高。本研究的擬海桑及其親本的根際細(xì)菌群落Shannon 指數(shù)為5.12～10.73, 高于任健 等(2012)對(duì)東寨港秋茄林(Shannon 指數(shù)4.15～4.96)和無瓣海桑(Shannon 指數(shù)3.3～3.6)的土壤細(xì)菌多樣性研究結(jié)果, 以及陳玉軍 等(2004)對(duì)海南省瓊山縣三江河兩岸的紅樹植物無瓣海桑(Shannon 指數(shù)為1.18～1.88)、海桑(Shannon 指數(shù)為1.29～2.22)、秋茄(Shannon 指數(shù)為0.70～1.33)三種人工林群落的系統(tǒng)研究結(jié)果。

三種海桑樣品的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較高的相似性。變形菌門細(xì)菌廣泛生活在土壤、海水和灘涂淤泥中(王勇忠, 2015; 吳冬梅, 2018, 柳旭, 2019;張起暢 等, 2020)。變形菌門在各海桑樣本的根際細(xì)菌群落相對(duì)豐度均超過40%, 為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門。與任健等(2012)對(duì)無瓣海桑林下土壤細(xì)菌組成的研究結(jié)果相似, 但是低于張起暢 等(2020)研究海南東寨港紅樹林淤泥中的變形菌門占比為83.78%的水平。各海桑樣本除優(yōu)勢(shì)門變形菌門外, 其余豐度豐富菌群在組成和豐度上均具有明顯差異。其他較豐富的類群包括: 浮霉菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、厚壁菌門等。除變形菌門外, 其余的豐度豐富菌群的豐度均在擬海桑和海桑樣品間存在顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)親本杯萼海桑(Sal)的豐度豐富菌群種類少但是占比高, 具有高優(yōu)勢(shì), 這是造成Sal 較Sc、Sg菌群多樣性偏低的主要原因。杯萼海桑的棲熱菌門的OTU 屬于楚帕氏菌科(Trueperaceae), g_B-42 屬,g_B-42 屬的具體功能尚未清楚, 楚帕氏菌科細(xì)菌被證實(shí)為堆肥過程中的降溫期和成熟期的標(biāo)志微生物,具有碳代謝和氨基酸代謝的重要功能(Zhang et al,2020)。擬海桑及其親本樣品的根際土壤細(xì)菌在菌群多樣性和結(jié)構(gòu)方面對(duì)比三亞灣海草根際微生物(周衛(wèi)國 等, 2019)和三沙灣沙灘微生物(王勇忠, 2015)發(fā)現(xiàn), 優(yōu)勢(shì)門變形菌門在海草根際微生物和沙灘中占比最高, 海草為70.87%, 沙灘為50.0%, 海草的Shannon 指數(shù)為7.74, 故擬海桑和海桑樣品的根際土壤細(xì)菌在菌群多樣性比海草高。而杯萼海桑則比海草低。子代擬海桑的根際細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與親本具有差異, 表明盡管根際微生物能從親本傳遞給子代,但會(huì)發(fā)生過濾, 在過濾作用下, 親本的個(gè)別豐度豐富菌群在子代的豐度顯著降低, 甚至消失。

擬海桑及其親本的根際細(xì)菌的群落物種組成的異質(zhì)性不高。利用物種豐度劃分的方法尋找可能造成異質(zhì)性的關(guān)鍵種, 發(fā)現(xiàn)條件稀有或豐富類群(CRAT)的OTUs 來自豐度占優(yōu)勢(shì)的變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、熱袍菌門和棲熱菌門。三元圖對(duì)CRAT 的OTUs 進(jìn)行貢獻(xiàn)度分析發(fā)現(xiàn)對(duì)擬海桑及其親本根際細(xì)菌群落區(qū)分貢獻(xiàn)度大的OTU 來自變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。說明在細(xì)菌群落物種組成上, 三種樣品間存在著能區(qū)分群落的OTU 但是數(shù)量較少。

子代擬海桑根際微生物群落中放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的豐度顯著升高。放線菌門是土壤中分布最廣的細(xì)菌門之一,以其在體外降解植物殘?bào)w的能力而著稱, 能促使土壤中的動(dòng)物和植物遺骸腐爛(Bao et al, 2021)。Li 等(2018)研究發(fā)現(xiàn)放線菌門的根際促生菌可以產(chǎn)生吲哚乙酸(indole-3-aceticacid, IAA), 豐富的根際微生物之一節(jié)桿菌(屬于放線菌門)已被報(bào)道具有產(chǎn)生IAA 促進(jìn)植物生長的能力。酸桿菌門(Acidobacteria)是一類重要的功能菌。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門(Acidobacteria)在重要生態(tài)過程中的動(dòng)態(tài)作用, 即調(diào)節(jié)生物地球化學(xué)循環(huán)、分解生物聚合物、分泌胞外多糖和促進(jìn)植物生長, 還具有多種代謝途徑所涉及的基因, 這些基因可能有助于根際存活和競爭定殖(王光華 等, 2016; Kalam et al, 2020)。本研究通過PICRUSt 功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Sg 樣本的碳水化合物、氨基酸、能量以及脂質(zhì)代謝等與代謝相關(guān)的功能基因豐度明顯高于親本。酸桿菌門和放線菌門細(xì)菌的豐度增加, 使得相關(guān)功能基因增加, 并導(dǎo)致擬海桑的根際細(xì)菌代謝能力增強(qiáng), 代謝產(chǎn)物增多, 供養(yǎng)增多,能為擬海桑生長提供更多的營養(yǎng)。這提高了擬海桑的生存能力, 使其具有生長優(yōu)勢(shì)。

土壤理化性質(zhì)的測(cè)定中, 海桑和杯萼海桑的土壤全氮量比擬海桑的數(shù)值高 3 倍, 對(duì)比任健 等(2012)同一地區(qū)的無瓣海桑林的土壤理化性質(zhì), 發(fā)現(xiàn)本研究的根際土壤樣品的TN、TP 等含量均增加。Lu 等(2021)模擬氮沉降對(duì)黃河三角洲濱海濕地土壤微生物群落多樣性的影響研究發(fā)現(xiàn), TN 和TC 的含量是影響土壤細(xì)菌多樣性的最重要因素, 模擬TN含量增高會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌多樣性下降, 人為提高TN 含量會(huì)導(dǎo)致富營養(yǎng)類群(變形菌門)豐度提高, 降低貧營養(yǎng)類群(酸桿菌)的豐度。此外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)高的TN 含量會(huì)抑制或降低微生物菌群的多樣性(Van Diepen et al, 2010; 袁穎紅 等, 2013; Li et al,2016; 沈芳芳 等, 2019; 林婉奇 等, 2020)。本研究的客觀結(jié)果是Sg 樣本的TN 含量顯著低于親本, 且其變形菌門的豐度與親本比較并無顯著降低, 相反其酸桿菌門的豐度還明顯增高。所以擬海桑TN 含量降低不是人為因素導(dǎo)致的。Wang 等(2010)從紅樹植物中分離出使實(shí)驗(yàn)植物對(duì)N、P 和K 的吸收增加的AMF, 故擬海桑放線菌門和酸桿菌門細(xì)菌豐度的增加也可能促進(jìn)擬海桑對(duì)N 元素的吸收增加。研究還發(fā)現(xiàn)植物分泌的化感物質(zhì)(如酚類、酸類物質(zhì))也有助于植物吸收 N、P 以及金屬離子等營養(yǎng)成分(Chapin III, 1995; Bradley et al, 1997)。齊璐(2019)研究表明Proteobacteria 在有機(jī)基質(zhì)降解方面作用巨大,并在其中已發(fā)現(xiàn)多種可進(jìn)行固氮的細(xì)菌, 但細(xì)菌的活性受多因素影響, 如pH 等, 而根際土壤的pH 值受植物根系的分泌物所形成的根際效應(yīng)影響(張福鎖 等, 1992; 朱麗霞 等, 2003)。故造成海桑與親本間的TN 含量差異可能是植物-根際微生物互作的結(jié)果。相關(guān)性分析研究了TN 和13 項(xiàng)豐度豐富門細(xì)菌之間的相關(guān)關(guān)系后發(fā)現(xiàn), 擬海桑樣品的酸桿菌門、放線菌門豐度顯著升高與TN 含量低相關(guān)。酸桿菌門和放線菌門的細(xì)菌含有的代謝功能基因豐富, 根系是植物吸收營養(yǎng)的場(chǎng)所, 根際微生物作為植物的第二基因組能夠影響植物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。綜上所述, 擬海桑生長優(yōu)勢(shì)的出現(xiàn)與其根際微生物的結(jié)構(gòu)和功能的變化是相關(guān)聯(lián)的。營養(yǎng)物質(zhì)、根際微生物結(jié)構(gòu)和代謝能力的變化等多因素綜合作用可導(dǎo)致擬海桑的生長優(yōu)勢(shì)的出現(xiàn)。此外還有許多預(yù)計(jì)會(huì)影響微生物組成和活動(dòng)的植物性狀的因素, 例如根系分泌物(Zhalnina et al, 2018)和根系結(jié)構(gòu)(Saleem et al,2018), 并且可能由大量基因控制(Deng et al, 2021)。本研究增加了我們對(duì)近緣海桑屬紅樹植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及其生態(tài)功能的了解。

在分析親緣關(guān)系對(duì)微生物群分類組成的影響時(shí), 由于16S rRNA 基因測(cè)序相對(duì)簡單且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,因此本研究使用這一當(dāng)前廣泛應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行量化。然而, 由于rRNA 基因變異的分辨率不足和分類群之間的功能冗余, 該技術(shù)無法有效區(qū)分對(duì)宿主有功能影響和沒有功能影響的微生物, 并面臨著一系列問題和挑戰(zhàn)(黃志強(qiáng) 等, 2021)。未來在相關(guān)研究中, 期待能發(fā)展、完善或發(fā)現(xiàn)更有效的方法。