重金屬脅迫下四種紅樹植物幼苗生理響應(yīng)特征

謝勇 , 王友紹

1. 熱帶海洋環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國(guó)科學(xué)院大亞灣海洋生物綜合實(shí)驗(yàn)站, 廣東 深圳 518121;

3. 中國(guó)科學(xué)院南海生態(tài)與環(huán)境工程創(chuàng)新院, 廣東 廣州 510301;

4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;

5. 南方海洋科學(xué)與工程廣東實(shí)驗(yàn)室(廣州), 廣東 廣州 511458

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，經(jīng)濟(jì)效益提升的同時(shí)帶來了較大的污染問題，其中重金屬污染是一種常見的污染。由于重金屬污染物不能被生物降解，存在時(shí)間長(zhǎng)，可通過食物鏈富集，危害人類健康，因而受到廣泛的關(guān)注(王宏鑌 等, 2005，Sodango et al, 2018)。特別是沿海濕地的重金屬污染問題較為突出，與其他濕地生態(tài)系統(tǒng)一樣，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)也經(jīng)歷了陸源污染物輸入，而城市化的快速發(fā)展也加劇了紅樹林區(qū)污染，使其成為重金屬污染物的重要儲(chǔ)存庫(kù) (Usman et al, 2013; Bourgeois et al, 2019)。鄧?yán)?等(2014)發(fā)現(xiàn)深圳福田紅樹林自然保護(hù)區(qū)沉積物中重金屬 Cu、Pb、Zn 等全部超過《海洋沉積物質(zhì)量》(GB 18668-2002)中I 類標(biāo)準(zhǔn)。這些研究表明紅樹植物正遭受著不同程度的重金屬污染脅迫，高濃度的重金屬脅迫能夠干擾植物一些保護(hù)酶的活性，導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量累積，ROS 可以攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，造成氧化損傷(Hegedüs et al, 2004)，進(jìn)而對(duì)植物的光合作用和呼吸作用產(chǎn)生影響，限制植物生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡。在重金屬污染脅迫下紅樹植物的生長(zhǎng)與生理生化響應(yīng)已經(jīng)有較多研究(Zhang et al, 2007; 王友紹, 2019, 2021; 王芳洲 等, 2020; Wang et al,2021)，但是關(guān)于不同紅樹植物抗重金屬脅迫能力研究相對(duì)較少(王友紹 等, 2019)。

本實(shí)驗(yàn)選取 4 種常見的紅樹科植物, 紅海欖(Rhizophora stylosa)、秋茄(Kandelia obovate)、木欖(Bruguiera gymnorhiza)和角果木(Ceriops tagal)為研究對(duì)象，分析在不同濃度重金屬水溶液脅迫下四種紅樹植物幼苗葉片的生理生化變化，以篩選出抗重金屬能力更強(qiáng)的紅樹物種，為受損濕地人工種植選種提供參考，對(duì)紅樹林的生態(tài)恢復(fù)、保護(hù)與持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的紅海欖、秋茄、木欖、角果木幼苗均采自廣東省湛江市紅樹林育苗基地。所有紅樹幼苗均挑選六葉期的幼苗進(jìn)行培養(yǎng)，用自來水沖洗干凈之后分別栽培于裝有沙子的塑料盆中，每三天用1/2 Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液澆灌一次，以補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液是植物培養(yǎng)中的常用營(yíng)養(yǎng)液,主要成分包括鐵鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鎂和微量元素等。幼苗培養(yǎng)兩周后, 挑選無機(jī)械損傷、無蟲害的長(zhǎng)勢(shì)良好的幼苗移至人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置如下：溫度26℃、相對(duì)濕度75%、光照強(qiáng)度20000lux，光照周期12h·d–1，在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)馴化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將培養(yǎng)馴化好的紅樹幼苗各自分為5 組，用1/2 Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液配置成4 個(gè)濃度梯度的復(fù)合重金屬水溶液分別進(jìn)行脅迫處理，每3 天澆灌一次，每次澆灌600mL 復(fù)合重金屬水溶液。依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置了如下復(fù)合重金屬水溶液濃度，具體含量見表1。復(fù)合重金屬水溶液脅迫處理28d 后剪取四種植物的葉片進(jìn)行各生理生化指標(biāo)的測(cè)定(Zhang et al,2007)。

表1 不同處理重金屬濃度Tab. 1 Concentrations of heavy metals in the different treatments

1.3 植物葉片可溶性蛋白的測(cè)定

可溶性蛋白的測(cè)定參照考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白法(Bradford, 1976)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及注意事項(xiàng)參考考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量中細(xì)節(jié)問題的描述(蔣大程 等, 2018)。

1.4 植物葉片SOD、POD、MDA 的測(cè)定

氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光還原法測(cè)植物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、愈創(chuàng)木酚氧化法測(cè)植物過氧化物酶(peroxidase, POD)活性、 硫代巴比妥酸比色法測(cè)植物丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，所用試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有指標(biāo)的測(cè)定均作三次生物學(xué)重復(fù)，最后的結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 Graphpad prism 7 進(jìn)行作圖分析。使用SPSS(Version 21)進(jìn)行單因素方差分析、Pearson 相關(guān)性分析和主成分分析(principal component analysis, PCA)，直觀地反映各生理生化指標(biāo)之間的關(guān)系，標(biāo)注*的數(shù)據(jù)代表與對(duì)照組具有顯著性差異(P＜0.05)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 復(fù)合重金屬水溶液脅迫對(duì)四種紅樹植物葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖1 可知，重金屬脅迫下紅海欖葉片可溶性蛋白的含量除T2 組略高于對(duì)照組外，其余各組均低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。秋茄葉片的可溶性蛋白含量在各處理組均略低于對(duì)照組，差異不顯著(P>0.05)，木欖葉片可溶性蛋白含量除T2 組顯著低于對(duì)照組外，其余各組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。角果木葉片可溶性蛋白含量除T1 組外均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖1 重金屬脅迫對(duì)四種紅樹植物可溶性蛋白含量的影響Fig. 1 The effect of heavy metal stress on the soluble protein content of four mangrove plants

2.2 復(fù)合重金屬水溶液脅迫對(duì)四種紅樹植物葉片SOD 活性的影響

由圖2 可知，復(fù)合重金屬水溶液脅迫可以增加四種植物幼苗葉片的SOD 活性，隨重金屬水溶液處理濃度的提高，四種紅樹植物葉片中SOD 活性均表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，紅海欖葉片SOD 活性在各處理組均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，在T2 處理組達(dá)最大值，其中T2 組與T3 組SOD 活性很接近，分別為對(duì)照組的1.55 倍、1.52 倍，且均顯著高于對(duì)照組。秋茄和木欖葉片SOD 活性均在T2 處理組達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組的1.39 倍和1.56 倍。角果木葉片在T1 處理組達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.36倍，當(dāng)重金屬水溶液濃度超過T1 組濃度后，隨重金屬濃度的進(jìn)一步提高SOD 活性開始下降，在T4 組時(shí)甚至低于對(duì)照組的活性。

圖2 重金屬脅迫對(duì)四種紅樹植物SOD 活性的影響Fig. 2 The effect of heavy metal stress on SOD activity of four mangrove plants

2.3 復(fù)合重金屬水溶液脅迫對(duì)四種紅樹植物葉片POD 活性的影響

由圖3 可知重金屬水溶液脅迫處理后四種紅樹植物葉片內(nèi)POD 活性除木欖的T4 處理組、角果木的T3、T4 處理組外，葉片內(nèi)POD 活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，四種紅樹植物葉片中POD 活性均表現(xiàn)出隨重金屬水溶液處理濃度的增加先升高再下降的趨勢(shì)，紅海欖葉片POD 活性在T3 處理組達(dá)最大值，為對(duì)照組的1.77 倍; 秋茄、木欖葉片中POD活性在T2 處理組達(dá)最大值，分別為對(duì)照組的1.58倍、1.67 倍，角果木在T1 處理組達(dá)最大值，是對(duì)照組的1.59 倍，當(dāng)重金屬水溶液濃度超過T1 后，表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

圖3 重金屬脅迫對(duì)四種紅樹植物POD 活性的影響Fig. 3 The effect of heavy metal stress on POD activity of four mangrove plants

2.4 復(fù)合重金屬水溶液脅迫對(duì)四種紅樹植物葉片MDA 含量的影響

如圖4 所示，復(fù)合重金屬水溶液處理下四種紅樹植物幼苗中的MDA 含量基本呈現(xiàn)逐步升高的趨勢(shì)，其中紅海欖在較低濃度處理組T1、T2 組的MDA含量高于對(duì)照組，但并不顯著(P>0.05)，秋茄在T1處理組略低于對(duì)照組，木欖、角果木在T1 處理組高于對(duì)照組但并不顯著(P>0.05)，其他各組 MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。在T4 處理組時(shí)，四種紅樹植物葉片內(nèi)MDA 含量達(dá)最大值，紅海欖葉片內(nèi)MDA 含量最高為對(duì)照組的1.82 倍，秋茄是對(duì)照組的2.23 倍，木欖是對(duì)照組的2.25 倍，角果木是對(duì)照組的2.73 倍。

圖4 重金屬脅迫對(duì)四種紅樹植物MDA 含量的影響Fig. 4 The effect of heavy metal stress on MDA content of four mangrove plants

2.5 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明(表2)，紅樹植物葉片內(nèi)可溶性蛋白含量與POD、MDA 呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，MDA 含量與POD 活性成極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，SOD 活性與其他幾項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性不顯著(P>0.05)。

表2 重金屬脅迫下各生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性Tab. 2 Correlation between various physiological and biochemical indexes under heavy metal stress

利用SPSS 做主成分分析，對(duì)生理生化指標(biāo)進(jìn)行降維處理，可以直觀體現(xiàn)重金屬水溶液脅迫下生理生化指標(biāo)間的變化關(guān)系。結(jié)果如圖5 所示，生理生化指標(biāo)分為2 個(gè)主成分，PC1 描述了總方差的73.030%，PC2 描述了總方差的25.926%，二個(gè)主成分合計(jì)描述了總方差的98.956%。其中MDA 和POD距離較近，說明二者關(guān)系密切。

圖5 重金屬脅迫下各生理生化指標(biāo)的PCA 分析Fig. 5 PCA analysis of various physiological and biochemical indexes under heavy metal stress

3 討論

植物體內(nèi)的可溶性蛋白多是參與各種代謝活動(dòng)的酶類，其含量越多代表代謝活動(dòng)越強(qiáng)，因此可溶性蛋白含量的多少可以反映植物體代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱(孫天國(guó) 等, 2010)。另外由于重金屬離子的存在，外界滲透勢(shì)會(huì)降低，細(xì)胞內(nèi)的水會(huì)向低滲透勢(shì)的外界流失，導(dǎo)致植物缺水，對(duì)植物造成損傷。可溶性蛋白含量增加可以降低細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì)，提高植物的保水能力, 從而避免缺水導(dǎo)致的損傷?？扇苄缘鞍缀康亩嗌倏梢源碇参镎{(diào)節(jié)滲透壓能力的強(qiáng)弱，因此可作為關(guān)鍵的生理生化指標(biāo)，指示植物的抗逆性強(qiáng)弱和代謝情況(趙胡 等, 2016)。本實(shí)驗(yàn)中，紅海欖、秋茄葉片內(nèi)可溶性蛋白含量略小于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)，木欖葉片除T2 組可溶性蛋白含量顯著低于對(duì)照組外，其余各組與對(duì)照組相差不大，表明紅海欖、秋茄、木欖對(duì)重金屬脅迫有比較好的抗性，可溶性蛋白的含量能保持在一個(gè)較為正常的水平，維持滲透平衡，保證細(xì)胞代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行，而角果木葉片可溶性蛋白含量除T1 組外均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，說明角果木在遭受超過1 倍重金屬水溶液濃度脅迫時(shí)，葉片代謝活動(dòng)減弱，調(diào)節(jié)滲透壓的能力減弱，重金屬脅迫對(duì)角果木葉片的蛋白質(zhì)合成造成了影響。

氧化損傷是植物受重金屬脅迫傷害的主要機(jī)理之一，重金屬脅迫會(huì)導(dǎo)致ROS 的過度產(chǎn)生和積累(Sch ü tzendü bel et al, 2002)，高水平的 ROS 通常會(huì)破壞細(xì)胞成分，如細(xì)胞膜、核酸和葉綠素等(Tewari et al, 2002)，造成氧化損傷，影響植物發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育。低濃度的重金屬脅迫會(huì)激活植物的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)SOD、POD 等抗氧化酶活性增加，清除植物體內(nèi)活性氧 (Srivastava et al, 2004)，抗氧化酶的誘導(dǎo)是減少氧化損傷的重要保護(hù)機(jī)制，其中SOD 在誘導(dǎo)下活性增加，催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，過氧化氫也是一種自由基，也能對(duì)細(xì)胞膜造成氧化損傷，POD 則可以催化過氧化氫生成無毒害的水和氧氣，使植物體內(nèi)的自由基保持在較低水平，從而避免自由基對(duì)植物造成氧化傷害，是逆境下植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶(Blokhina et al, 2003)。本研究中，隨著重金屬水溶液處理濃度的增加，四種紅樹植物幼苗葉片內(nèi)的SOD、POD 活性均呈現(xiàn)出先升高再降低的變化趨勢(shì)，這與Cu2+處理下秋茄幼苗葉片的抗氧化酶變化情況一致(趙胡 等, 2016)，低濃度的重金屬脅迫誘導(dǎo)了抗氧化酶活性的提高，當(dāng)重金屬濃度超過承受閾值后，植物體內(nèi)的活性氧含量超過了正常的歧化能力，而對(duì)組織和細(xì)胞多種功能膜及酶系統(tǒng)造成破壞，反過來抑制了植物葉片內(nèi)SOD、POD等抗氧化酶的活性。紅海欖葉片中POD 活性在T3處理組達(dá)到最大值; SOD 活性在T2 處理組時(shí)達(dá)到最大值，其中T3 組與T2 組SOD 活性非常接近，無明顯差距且均顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組活性的1.52 倍和1.55 倍。秋茄、木欖葉片中POD、SOD活性均在 T2 處理組達(dá)最大值，而角果木葉片中POD、SOD 活性均在T1 處理組達(dá)到最大值，隨后再增加重金屬水溶液處理濃度，SOD、POD 活性開始受到抑制，活性下降。說明紅海欖在T3 處理組，秋茄、木欖在T2 處理組，角果木在T1 處理組的重金屬脅迫時(shí)具有最積極的抗氧化酶活性，此時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的ROS 能力最強(qiáng)，當(dāng)重金屬處理濃度持續(xù)增加，超過了植物承受閾值時(shí)，抗氧化酶活性受到抑制，清除ROS 能力減弱，導(dǎo)致植物過氧化水平加劇，進(jìn)而破壞膜結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)合成等各種代謝活動(dòng)，對(duì)植物產(chǎn)生損害。當(dāng)逆境發(fā)生時(shí)，植物會(huì)采取各種措施提高自身的抵抗力以適應(yīng)逆境壓力，但當(dāng)逆境壓力超過植物的耐受極限時(shí)，其自身防御系統(tǒng)也會(huì)遭到破壞(王友紹，2019)。

植物在遭受重金屬脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)積累大量ROS，這些活性氧會(huì)攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA，MDA 的產(chǎn)生能加劇膜的損傷，因此可以通過MDA 含量間接反映膜的受損程度(Knight et al, 1990)。本研究中，重金屬水溶液脅迫增加了四種紅樹植物葉片中的MDA含量，當(dāng)重金屬水溶液濃度增大時(shí)，葉片中的MDA含量持續(xù)增加，膜系統(tǒng)損傷加劇，植物受損程度加大。其中，紅海欖在T1、T2 濃度時(shí)MDA 含量雖然增加，但與對(duì)照相比，MDA 增加并不顯著(P>0.05)，表明T2 濃度的重金屬水溶液處理對(duì)紅海纜的損傷并不嚴(yán)重，同樣的，T1 濃度的重金屬污染對(duì)秋茄、木欖、角果木的損傷也不嚴(yán)重。紅海欖、秋茄、木欖、角果木四種植物在最高濃度處理組時(shí)， MDA含量分別為對(duì)照組的1.82、2.23、2.25、2.73 倍，表明在高濃度重金屬水溶液脅迫下，紅海欖受氧化損傷程度較低，秋茄、木欖受損程度相當(dāng)，角果木受損程度最重。

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示紅樹植物葉片內(nèi)可溶性蛋白含量與POD、MDA 呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，MDA 含量與POD 活性成極顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，SOD 活性與其他幾項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性不顯著(P>0.05)。MDA 含量的增加表明植物遭受重金屬脅迫后發(fā)生氧化損傷，植物體內(nèi)的氧自由基、過氧化物增多，刺激植物合成SOD、POD 等抗氧化酶，以清除體內(nèi)的過氧化物，減少氧化損傷，所以MDA與POD 呈正相關(guān)關(guān)系。而重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的化合物結(jié)合，影響植物代謝活動(dòng)，特別是影響蛋白質(zhì)的合成，所以MDA 含量與可溶性蛋白含量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。從PCA 分析圖中可知，將四個(gè)生理生化指標(biāo)分解到2 個(gè)主成分中，可以解釋總方差的98.956%，其中POD 和MDA 距離最近，表明二者相關(guān)性很強(qiáng)，當(dāng)重金屬脅迫產(chǎn)生氧化損傷時(shí)，MDA 含量增加，POD 活性也會(huì)提高，以清除氧自由基，減少氧化損傷。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四種紅樹植物幼苗在遭受重金屬水溶液脅迫時(shí)，均表現(xiàn)出一定的抵抗重金屬脅迫能力，SOD、POD 兩種抗氧化酶能在一定程度上能夠清除重金屬脅迫產(chǎn)生的氧自由基，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，避免氧化損傷。但是這種抵抗重金屬脅迫的能力有一定的限度，當(dāng)重金屬濃度超過承受極限時(shí)，抗氧化酶的活性將會(huì)被抑制，活性氧大量積累，氧化損傷加劇。其中，紅海欖在10 倍重金屬水溶液處理時(shí)仍具有較為積極的抗氧化酶活性, 秋茄、木欖在5 倍重金屬水溶液處理時(shí)具有較為積極的抗氧化酶活性, 角果木在1 倍重金屬水溶液處理時(shí)抗氧化酶活性最強(qiáng)，表明紅海欖抗氧化酶系統(tǒng)承受重金屬污染能力強(qiáng)于秋茄、木欖，角果木抗氧化酶系統(tǒng)承受重金屬污染能力最弱。高濃度重金屬水溶液處理下角果木受氧化損傷程度最高，木欖與秋茄相當(dāng)，紅海欖受氧化損傷程度最低。紅海欖的抗重金屬脅迫能力較強(qiáng)，秋茄與木欖的抗重金屬脅迫能力相當(dāng)，角果木抗重金屬脅迫能力最弱。四種紅樹科植物中，紅海欖的重金屬抗性最強(qiáng)，角果木的重金屬抗性最弱，在受重金屬污染嚴(yán)重的海岸帶更適合種植紅海欖進(jìn)行植物修復(fù)，恢復(fù)生態(tài)。本實(shí)驗(yàn)篩選出了抗重金屬能力較強(qiáng)的紅樹種類紅海欖，其相關(guān)抗性基因有待進(jìn)一步研究。