番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法研究及種質(zhì)資源抗病性評價(jià)

李小紅，趙 雯，周鵬澤，周雪榮，馬雪靜，楊雯雯，田飛燕，王曉敏，3，4，5

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021； 2.澳大利亞聯(lián)邦科工組織 澳大利亞堪培拉 2600 3.寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心 銀川 750021； 4.寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 銀川 750021；5.寧夏設(shè)施園藝（寧夏大學(xué)）技術(shù)創(chuàng)新中心 銀川 750021）

番茄白粉病（Tomoto powdery mildew）是番茄生產(chǎn)中一種危害非常嚴(yán)重的世界性真菌病害，已成為制約番茄綠色生產(chǎn)的主要障礙[1]。該病害在我國最早發(fā)生于臺灣省，近年來我國遼寧、新疆、河南、臺灣等地相繼報(bào)道了該病害的發(fā)生[2-4]。隨著寧夏地區(qū)番茄產(chǎn)業(yè)規(guī)?；б骘@著、種植面積的不斷擴(kuò)大，在露地和設(shè)施栽培中，番茄白粉病危害越來越嚴(yán)重[5]。白粉病主要發(fā)生在番茄生長的中、后期，病原菌會通過侵染葉片，導(dǎo)致葉片布滿白色病斑，甚至枯萎，使番茄光合作用受到嚴(yán)重影響，對番茄果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量有很大影響，可造成番茄產(chǎn)量下降30%～50%，嚴(yán)重時(shí)甚至絕產(chǎn)[6-10]。

我國已經(jīng)報(bào)道能夠引起番茄白粉病的病原菌主要有蓼白粉菌（Erysiphe polygoniDC）、韃靼內(nèi)絲白粉菌（Leveillula taurica）和新番茄粉孢菌（Oidium neolycopersiciL.Kiss），屬于子囊菌亞門真菌，專性寄生菌，用培養(yǎng)基無法培養(yǎng)保存[11-13]。保存番茄白粉病病原菌主要有活體保存、葉片生根保存和離體葉片保存等方法，活體保存法保存時(shí)間最長為80 d，需要注意隔離保存[14]。已報(bào)道對黃瓜白粉菌保存方法[15]最好的是二甲基亞砜保存，保存90 d 后病情指數(shù)為32.8%，且該方法能純化保存病原菌。因此，借鑒黃瓜白粉菌的保存方法對番茄白粉菌的保存方法進(jìn)行研究，旨在為番茄白粉菌的保存提供最佳的保存條件。

可靠的抗病性鑒定方法是抗病育種的基礎(chǔ)。鄭坤[14]系統(tǒng)地研究了番茄白粉病苗期抗病性鑒定的苗齡、孢子懸浮液濃度、接種方法，卻沒有考慮接種后保濕時(shí)間這一因素，且保濕時(shí)間是孢子萌發(fā)的重要因素，所以上述方法不是番茄白粉病抗病性鑒定的最佳方法。筆者擬通過對番茄白粉菌不同保存方法的研究，篩選出最佳的保存方法。采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出最佳的番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法，通過該方法對30份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行室內(nèi)苗期白粉病抗性評價(jià)，為有效開展番茄白粉病防治與白粉病抗病育種提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 番茄白粉菌材料：選取寧夏銀川地區(qū)新番茄粉孢菌，配制成約1×106個(gè)·mL-1孢子懸浮液，用刷葉法接種到健康的感病品種Moneymaker（MM）上擴(kuò)繁，并隔離保存。番茄品種：感病品種MM 用于抗病性鑒定方法研究。番茄種質(zhì)資源：由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜課題組與寧夏巨豐種苗有限責(zé)任公司共同收集的30 份番茄種質(zhì)資源，用于種質(zhì)資源抗病性評價(jià)。種質(zhì)資源信息詳見表1。

表1 30 份番茄種質(zhì)資源信息

1.1.2 儀器 奧林巴斯SC180 光學(xué)顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、5 mL 離心管、150 mL 噴壺、培養(yǎng)皿、載玻片。

1.2 方法

1.2.1 白粉菌保存條件篩選 于2021 年9 月在寧夏大學(xué)科技樓705 室采用低溫保存法、甘油保存法和二甲基亞砜保存法對番茄白粉病菌進(jìn)行保存，分別于不同時(shí)期（30、60、90 d）測定孢子的萌發(fā)率及病情指數(shù)，從而篩選出最佳的菌種保存條件。

低溫保存法：將干燥的孢子取等量分別裝入無菌離心管中，放置到不同溫度（4、-20、-80 ℃）下進(jìn)行菌種保存。甘油保存法：將干燥的孢子裝入干燥且無菌的離心管中并加入甘油至孢子完全浸沒，將孢子混合液置于-20 ℃放置24 h，再放入-80 ℃低溫冰箱中保存。二甲基亞砜保存法：將干燥的孢子裝入干燥且無菌離心管中并加入10%蔗糖（φ，后同）+12%甘油+7%二甲基亞砜+8%脫脂牛乳的混合液至孢子完全浸沒，將孢子混合液置于不同溫度（-20 ℃、-20 ℃放置24 h 后轉(zhuǎn)至-80 ℃、-80 ℃）下進(jìn)行菌種保存。分別以室溫保存和新鮮番茄白粉菌分生孢子的萌發(fā)率和病情指數(shù)為參照（CK1、CK2），采用水瓊脂平板法[16]測定孢子的萌發(fā)率，接種后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)，從而篩選出最佳的菌種保存條件。萌發(fā)率/%=已萌發(fā)孢子數(shù)/觀察孢子數(shù)×100，病情指數(shù)（DI）=Σ（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)査總?cè)~數(shù)×最高級代表值）×100[17]。

1.2.2 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法正交試驗(yàn) 2021 年10 月在寧夏大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場育苗溫室將試驗(yàn)材料MM 播種到98 孔穴盤，待幼苗生長至2 葉1 心，移至育苗缽（18 cm×15 cm×13 cm）繼續(xù)緩苗，待幼苗長至3、4、5 葉期進(jìn)行人工接種。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對番茄苗齡（A）、孢子懸浮液濃度（B）、接種方法（C）及保濕時(shí)間（D）4 個(gè)因素，進(jìn)一步優(yōu)化番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)種3 株番茄，試驗(yàn)小區(qū)面積為6.2 m2，株距為18 cm，行距為38 cm。設(shè)計(jì)因素與水平詳見（表2、表3）。

表2 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定試驗(yàn)因素與水平

表3 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)

接種后觀察發(fā)病情況，25 d 后病害充分發(fā)生并穩(wěn)定，調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)：發(fā)病率/%=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100，病情指數(shù)（DI）=Σ（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)査總?cè)~數(shù)×最高級代表值）×100[18]。分級標(biāo)準(zhǔn)參照鄭坤[14]的報(bào)道，具體如下：0級，不發(fā)??；1 級，葉片有粉斑，莖稈、葉柄無病斑；2級，葉片有粉斑，葉柄病斑≤5%，莖稈上無病斑；3級，葉片有粉斑，5%＜葉柄病斑≤30%，莖稈上無病斑；4 級，葉片有粉斑，葉柄病斑大于30%，莖稈上有病斑。

1.2.3 番茄種質(zhì)資源室內(nèi)苗期白粉病抗病性評價(jià) 選用1.2.2 中最優(yōu)的抗病性鑒定方法，在2021年12 月對30 份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行了抗病性鑒定分析，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，25 d 后調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù)。

抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)如下[13]：免疫（I），病情指數(shù)為0；抗?。≧），病情指數(shù)在20.00 以下；中抗（MR），病情指數(shù)在20.01～40.00；感?。⊿），病情指數(shù)在40.01～60.00；極感?。‥S），病情指數(shù)在60.00 以上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄白粉病病原菌保存方法研究

由表4 可見，處理1 在30 d 時(shí)的病情指數(shù)與處理2 無顯著差異，與其他處理的孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)均存在顯著差異。處理1 在60 d 時(shí)孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)與其他8 個(gè)處理均有顯著差異，處理1 在90 d 時(shí)與處理6 無顯著差異，與其他7 個(gè)處理均有顯著差異。處理1 低溫保存法，保存條件4 ℃，在30 d 時(shí)，孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)分別為44.20%和22.50；60 d 時(shí)，孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)為39.60%和22.00；90 d 時(shí)，孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)為27.50%和16.30。處理1 在對應(yīng)的時(shí)間內(nèi)，孢子的萌發(fā)率和病情指數(shù)均高于除CK2 外的其他7 個(gè)處理。表明低溫保存法保存溫度為4 ℃是番茄白粉菌的最佳保存條件。

表4 番茄白粉菌不同保存方法研究

2.2 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法篩選

由表5 可以看出，在不同接種方法處理25 d 后對番茄白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù)進(jìn)行調(diào)查，處理5 僅與處理9 無顯著差異，與其他7 個(gè)處理均存在顯著差異。處理5 的發(fā)病率為76.45%，病情指數(shù)為46.06，均高于其他8 個(gè)處理。因此，處理5 為最佳的番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法，即接種苗齡為4 葉期、接種濃度為106個(gè)·mL-1、刷葉法、保濕時(shí)間為24 h。

表5 番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法研究結(jié)果

2.3 30 份番茄種質(zhì)資源室內(nèi)苗期白粉病抗病性評價(jià)

30 份種質(zhì)資源白粉病抗病性評價(jià)結(jié)果見表6，30 份材料中，62850-1 病情指數(shù)最低，為19.85，為抗病材料；62754-1 病情指數(shù)最高，為62.11，是極感病材料；中抗材料有15 份，為62767-1、D6220G-1、62579- 1、62756- 1、62755- 1、62613- 1、62612- 1、62890- 1、62828- 1、62569- 1、63187- 1、63102- 1、63191-1、63022-1、63014-1；感病材料有13 份，為62615- 1、62640- 1、62865- 1、62758- 1、62765- 1、62764- 1、62763- 1、62760- 1、61972- 7- 1- 3- 16、62736-1、62749-1、62752-1、63052-1。

表6 30 份番茄種質(zhì)資源抗白粉病評價(jià)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

番茄白粉菌屬于子囊亞門真菌，用培養(yǎng)基無法培養(yǎng)保存，不論是無性階段的分生孢子還是菌絲體，均無法在脫離活體寄主后長期保持活力，而病原菌的長期保存有利于對抗病、致病機(jī)制研究，加快抗病育種進(jìn)程[19-21]。筆者通過借鑒小麥白粉菌和黃瓜白粉菌的保存方法[15,22-24]，對比低溫保存法、甘油保存法和二甲基亞砜保存法與不同保存條件及2個(gè)對照共9 個(gè)處理后測定孢子萌發(fā)率和病情指數(shù)，篩選番茄白粉菌最適宜的保存方法。筆者的研究結(jié)果明確了番茄白粉菌最適宜保存方法是低溫保存法（4 ℃），保存90 d 后檢測孢子的萌發(fā)率和病情指數(shù)，除低于對照新鮮孢子外，均高于其他保存方法。鄭坤[14]采用活體植株保存法、葉片生根保存法和離體葉片保存法3 種方法均可保存，其中活體植株保存法可保存時(shí)間最長達(dá)80 d，但受寄主植株生育期限制，需要隔離保存，較為麻煩。吳明藻等[22]和李中存等[23]對小麥白粉菌分別采用試管小苗培養(yǎng)保存、四圃純化白粉病保存，保存簡單方便、時(shí)間長、不易污染，缺點(diǎn)是保存菌量較少、不能為抗病育種提供足夠的病原菌。康萍芝等[15]研究黃瓜白粉病菌適宜的保存方法為10%蔗糖+12%甘油+7%二甲基亞砜+8%脫脂牛乳混合液保存法，在-20 ℃冰箱中保存效果較好，優(yōu)點(diǎn)在于脫離活體寄主進(jìn)行保存。但筆者的研究表明，該方法對番茄白粉菌的保存效果較差，沒有低溫保存法（4 ℃）效果好，這可能與白粉菌不同種屬、不同生理小種本身特性有關(guān)，需要對白粉菌的特性進(jìn)行進(jìn)一步研究。后續(xù)也可以在4 ℃保存的基礎(chǔ)上增加其他因素來研究白粉菌的保存時(shí)間是否更長。

高效的抗病鑒定技術(shù)是篩選抗病種質(zhì)資源的重要手段。抗病性鑒定方法與試驗(yàn)材料抗性、苗齡、接種方法、保濕時(shí)間等因素互相作用有關(guān)[24]。李成偉等[25]將孢子懸浮液濃度調(diào)至2×104個(gè)·mL-1，在番茄苗齡為4～5 片真葉時(shí)進(jìn)行噴霧接種。王聯(lián)德等[26]采用葉片摩擦法將孢子接種到4 葉期的感病番茄第一生長葉片上，他們對接種方法沒有研究。鄭坤[14]以東農(nóng)714 為材料，通過正交試驗(yàn)，對番茄白粉病苗期的抗病性鑒定方法進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明，接種方法為噴霧法、接種苗齡為4 葉期和接種孢子懸浮液濃度為106個(gè)·mL-1是最佳組合。筆者的研究結(jié)果表明，刷葉法和噴霧法均可作為番茄苗期室內(nèi)抗病性鑒定方法，其中刷葉法所需苗齡較小，孢子濃度低，可提前接種，噴霧法所需苗齡較刷葉法大，用菌量較大。與鄭坤[14]不同的主要原因有兩方面，一是用于抗病性鑒定的材料不同；二是增加了保濕時(shí)間這一因素，綜合考慮了苗齡、孢子濃度、接種方法及保濕時(shí)間4 個(gè)因素之間交互作用，更加系統(tǒng)全面地研究了番茄苗期白粉病抗病性鑒定方法。從30 份番茄種質(zhì)資源中篩選出1 份抗病材料和1 份易感材料，15 份中抗材料，13 份感病材料?？共〔牧虾透胁〔牧峡煞謩e用于番茄白粉病的抗病機(jī)制和致病機(jī)制研究，抗病材料也可用于抗病育種，但抗病材料太少。因此當(dāng)前最緊迫的工作是廣泛地從國內(nèi)外番茄種質(zhì)中心及野生種質(zhì)中收集抗源，為白粉病抗病品系選育提供材料。

筆者的研究結(jié)果明確了4 ℃是最佳的白粉菌保 存 條 件；4 葉 期，孢 子 濃 度 為1×106個(gè)·mL-1，采用刷葉法，保濕24 h 是最佳的番茄白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定條件；最抗病番茄材料為62850-1。