甜瓜抗白粉病的苗期鑒定

康保珊，郝小苑，吳會(huì)杰，彭 斌，劉莉銘，古勤生

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009）

白粉病是甜瓜生產(chǎn)中一種重要的真菌性病害，從植株苗期到成熟期均可發(fā)生，但在中、后期危害嚴(yán)重，主要危害葉片，嚴(yán)重時(shí)亦可危害葉柄、莖蔓和果實(shí)。白粉病發(fā)生初期在葉面產(chǎn)生白色粉斑，隨后病斑迅速擴(kuò)大連片，白粉層加厚，葉片逐漸萎黃干枯，植株光合效能減弱，嚴(yán)重影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，隨著我國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型升級(jí)，設(shè)施甜瓜種植面積不斷擴(kuò)大，其特有的高溫、高濕環(huán)境條件，加劇白粉病的發(fā)生和危害。目前生產(chǎn)中防治該病害仍然過度依賴化學(xué)農(nóng)藥，而過量使用農(nóng)藥帶來的藥害、環(huán)境污染和抗藥性等問題日益突出。因此，選育推廣抗白粉病甜瓜品種顯得尤為迫切。

抗病性鑒定是選育和推廣抗病品種的關(guān)鍵步驟，鑒定結(jié)果受多種因素的影響，包括孢子懸浮液濃度、苗齡和調(diào)查時(shí)間等。田間接種鑒定不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且環(huán)境條件變化大易導(dǎo)致重復(fù)性差、鑒定不準(zhǔn)確等問題。目前大多數(shù)研究采用室內(nèi)苗期噴霧法接種鑒定[1-4]，但接種的具體參數(shù)和細(xì)節(jié)不盡相同。首先接種苗齡不同，有文獻(xiàn)報(bào)道甜瓜白粉病接種宜在子葉展開時(shí)進(jìn)行[5-6]，但也有報(bào)道顯示最佳接種時(shí)期為2 葉1 心期或4 葉1 心期[7-9]；其次，接種采用的孢子濃度不同，從103～106個(gè)·mL-1均有報(bào)道[1，6，9-10]；鑒定方法的差異可能導(dǎo)致不同的鑒定結(jié)果。為此，筆者通過設(shè)置不同接種參數(shù)分析接種白粉病后甜瓜的病情指數(shù)，確定耗時(shí)短且結(jié)果穩(wěn)定的鑒定方法，以期為培育抗白粉病的甜瓜新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2021 年9 月至2022 年5 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所進(jìn)行。為篩選高效的接種方法，供試材料選用經(jīng)前期試驗(yàn)確定具有抗性差異的6 個(gè)甜瓜品種，其中白玫由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心惠贈(zèng)；MJ21、SD4、SD6 為F1 代雜交種，MX-20、VP-20 為自交種，均來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所。MX-20 和VP-20 分別為高感和高抗品種，其他4 個(gè)品種抗性依次為SD4>SD6>白玫≈MJ21。

供試白粉病病原菌：采集于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所試驗(yàn)基地大棚內(nèi)具有典型白粉病病斑的甜瓜病葉，分離物經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）后，接種于健康的甜瓜品種MX-20 上進(jìn)行繁殖，新長(zhǎng)出的孢子作為接種用病原體；病原菌采用活體保存，病株置于光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。

1.2 處理方法

供試甜瓜品種催芽后，播種于裝有滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽中，于23～27 ℃培養(yǎng)室條件下生長(zhǎng)，常規(guī)管理，待幼苗生長(zhǎng)到接種所需時(shí)期后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中待用。

將白粉病病菌孢子收集到含0.05%（φ）吐溫20的無菌水中，充分震蕩，取少量稀釋一定倍數(shù)后用血球計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)，確定原始孢子懸浮液濃度，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行10 倍梯度稀釋，分別制成不同濃度梯度的孢子懸浮液，采用噴霧接種法均勻噴灑到幼苗葉片上，放置于人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件：25 ℃，濕度75%；之后置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件：23 ℃黑暗10 h，26 ℃光照14 h，濕度65%；待植株發(fā)病后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

不同接菌時(shí)期試驗(yàn)于2021 年進(jìn)行，供試品種為SD4、SD6、白玫和MX-20；設(shè)3 個(gè)接種時(shí)期：子葉期、2 葉1 心期、4 葉1 心期。確定最佳接種時(shí)期后于2022 年進(jìn)行不同接種濃度試驗(yàn)，供試品種為VP-20、SD4、MJ21 和MX-20，設(shè)置4 個(gè)孢子懸浮液濃度，分別為107、106、105、104個(gè)·mL-1。采用單因素分析方法，即分析接種時(shí)期時(shí)采用105個(gè)·mL-1噴施，于接種后12 d 調(diào)查病情指數(shù)；分析孢子懸浮液濃度時(shí)在2 葉1 心期噴施，分別于接種后8 d 和12 d 調(diào)查病情指數(shù)。每個(gè)處理12 株，3 次重復(fù)。

1.3 病情分級(jí)及抗性評(píng)價(jià)

病情分級(jí)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[11]及國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第2 部分：黃瓜抗白粉病鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T 1857.2－2010）[12]中的方法進(jìn)行。具體如下：以幼苗葉片出現(xiàn)病斑為感病指標(biāo)，從葉片出現(xiàn)癥狀時(shí)開始統(tǒng)計(jì)。調(diào)查每個(gè)單株葉片病情級(jí)別，按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：0 級(jí)，葉片無病癥；1 級(jí)，葉片病斑小且少，占葉片總面積的1/3 以下；2 級(jí)，白粉病斑較明顯，發(fā)病葉病斑面積占葉片總面積的1/3～2/3；3 級(jí)，白粉狀病斑連片為較大的病斑，發(fā)病葉病斑面積占葉片總面積的2/3 以上；4 級(jí)，白粉層濃厚，葉片病斑開始黃化；5 級(jí)，葉片病斑變褐干枯，或病葉枯死。病情指數(shù)按照下面公式計(jì)算：

病情指數(shù)（DI）=Σ（各級(jí)病葉數(shù)×該級(jí)代表值）/調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)數(shù)×100。

抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：免疫（I）DI=0；高抗（HR）0＜DI≤15；抗 ?。≧）15＜DI≤35；中 抗（MR）35＜DI≤55；感?。⊿）55＜DI≤75；高感（HS）DI＞75。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 16.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病病原菌鏡檢觀察

收集白粉病孢子后取少量在顯微鏡下觀察，鏡檢結(jié)果顯示分生孢子均為橢圓形、單胞，串生呈念珠狀，且具有纖維狀體（圖1-A，B），根據(jù)其分生孢子形態(tài)及內(nèi)部含有發(fā)達(dá)的纖維狀體等特征初步確定筆者采集的白粉病菌為單囊殼屬單囊殼白粉菌（P.xanthii）。

圖1 白粉病病菌孢子

2.2 接種時(shí)期對(duì)甜瓜品種病情指數(shù)的影響

調(diào)查結(jié)果顯示，葉片最早開始出現(xiàn)白粉狀病斑的時(shí)間是接種后7～8 d，3 個(gè)接種時(shí)期無明顯差異。由表1 可知，4 個(gè)品種在2 葉1 心期接種的病情指數(shù)與4 葉1 心期相比較，病情指數(shù)差異均不顯著；除SD4 外，其他3 個(gè)品種在子葉期接種的病情指數(shù)與真葉期呈顯著差異。說明子葉期接種鑒定容易產(chǎn)生較大誤差，造成抗性評(píng)價(jià)不準(zhǔn)確，而相比2 葉1心期，植株生長(zhǎng)到4 葉期需要更長(zhǎng)的時(shí)間和更大的空間，因此，確定2 葉1 心期為甜瓜幼苗接種鑒定的最佳時(shí)期。

表1 甜瓜接種白粉病12 d 后的病情指數(shù)

2.3 孢子濃度對(duì)甜瓜品種病情指數(shù)的影響

由表2 和圖2 可以看出，孢子濃度為104個(gè)·mL-1時(shí)，4 個(gè)品種只有MX-20 和MJ21 在接種后12 d 出現(xiàn)白粉狀病斑，且病情指數(shù)均小于35，未達(dá)到感病級(jí)別；孢子濃度為105個(gè)·mL-1時(shí)，4 個(gè)品種中MX-20 和MJ21 在接種后8 d 的病情指數(shù)分別為38.20 和23.93，到接種12 d 時(shí)病情發(fā)展變緩，病情指數(shù)分別為75.15 和67.76，VP-20 和SD4 在接種后8 d 時(shí)均無明顯的發(fā)病癥狀，到接種后12 d 時(shí)的病情指數(shù)分別為4.63 和30.25，此時(shí)4 個(gè)品種表現(xiàn)出不同的抗性差異；孢子濃度為106個(gè)·mL-1時(shí)，4 個(gè)品種在接種后8 d 和12 d 的抗性等級(jí)均在同一等級(jí)，但品種間抗性存在差異；孢子濃度為107個(gè)·mL-1時(shí)，除MJ21 外，其他3 個(gè)品種在接種后8 d 和12 d的病情指數(shù)也顯示為同一抗性等級(jí)。另外，除SD4外，同一個(gè)品種接種濃度為105個(gè)·mL-1、接種后12 d的病情指數(shù)與濃度為106個(gè)·mL-1、接種后8 d 的病情指數(shù)差異不顯著，抗性等級(jí)相同。上述結(jié)果表明，有效接種的孢子濃度須高于104個(gè)·mL-1；隨著孢子濃度增大，病情發(fā)展速度加快，鑒定周期縮短；試驗(yàn)結(jié)果顯示，孢子濃度為107個(gè)·mL-1時(shí)，病情發(fā)展迅速，接種8 d 時(shí)感病品種MX-20 病情指數(shù)已達(dá)到82.50，對(duì)于抗病（R）或中抗（MR）品種（如SD4）容易出現(xiàn)病情指數(shù)偏高、抗病性偏差的結(jié)果；孢子濃度為105～106個(gè)·mL-1時(shí)，病情發(fā)展速度適中，品種間抗性存在差異，因此確定孢子濃度為105個(gè)·mL-1、接種后12 d 調(diào)查或孢子濃度為106個(gè)·mL-1、接種后8～12 d 調(diào)查為合適的接種鑒定條件。

表2 不同孢子濃度接種甜瓜后的病情指數(shù)

圖2 甜瓜品種接種白粉病菌P.xanthii（孢子濃度為105 個(gè)·mL-1，8 d）發(fā)病情況

3 討 論

白粉菌是一種專性寄生菌，只能在活體寄主上存活，目前的研究表明子囊菌亞門下有3 個(gè)屬6 個(gè)種的真菌均可引起葫蘆科植物白粉病，在我國(guó)致使葫蘆科作物發(fā)病的主要是單囊殼屬單囊殼白粉菌（P. xanthii）和白粉菌屬二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）[13-16]。這兩種白粉病菌產(chǎn)生所需要的環(huán)境條件不同，相對(duì)高溫高濕的條件下白粉病的發(fā)生主要由單囊殼白粉菌引起，在相對(duì)干燥的條件下白粉病多由二孢白粉菌引起，目前大多數(shù)研究鑒定的白粉病菌均屬于單囊殼白粉菌，筆者采集的白粉病菌經(jīng)鑒定也屬于單囊殼白粉菌，與趙光偉等[17]的鑒定結(jié)果一致。報(bào)道顯示其分生孢子萌發(fā)的最適條件為溫度25 ℃，相對(duì)濕度100%[18]。然而筆者在繁殖白粉病菌時(shí)觀察到當(dāng)相對(duì)濕度達(dá)到100%時(shí)，葉片產(chǎn)生露水，此時(shí)葉片上白粉狀病斑擴(kuò)展緩慢，白粉病菌產(chǎn)孢減少。于靜等[19]在研究茄白粉菌的生物學(xué)特性時(shí)也發(fā)現(xiàn)分生孢子一旦浸在水滴中就不再萌發(fā)。前人研究表明充足的氧氣對(duì)于孢子的萌發(fā)至關(guān)重要，當(dāng)環(huán)境濕度過大導(dǎo)致葉片表面有凝結(jié)水時(shí)，孢子周圍氧氣減少即可能導(dǎo)致孢子不萌發(fā)，影響最終鑒定結(jié)果[18-19]。

白粉病抗性鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)中有選擇在子葉期進(jìn)行接種鑒定的[2，5，20]，主要是因?yàn)樽尤~期接種耗時(shí)短，占用空間小，操作方便。但在筆者的研究中發(fā)現(xiàn)子葉期接種鑒定結(jié)果相比真葉期有顯著差異，如甜瓜品種白玫子葉期接種病情指數(shù)是33.81，表現(xiàn)為抗病，但真葉期接種病情指數(shù)可達(dá)到58.83～60.39，表現(xiàn)為感病，說明子葉和真葉的抗性存在差異。臧全宇等[7]研究指出某些甜瓜材料在子葉期抗性會(huì)增強(qiáng)；Ben-Naim 等[21]研究西瓜白粉病抗性時(shí)發(fā)現(xiàn)子葉期與真葉期抗性的差異是由于抗性基因的不同，子葉期抗性受1 對(duì)不完全顯性基因控制，而真葉期抗性是由3 對(duì)互補(bǔ)的不完全顯性基因控制。另外，光合效率也是影響植株抗性的一個(gè)重要因素，甜瓜子葉的光合效率顯著低于真葉，產(chǎn)生抗性物質(zhì)的速率和含量與真葉差異較大，這可能也是造成子葉與真葉抗性鑒定結(jié)果差異的一個(gè)重要原因[22-24]。王祿星等[9]認(rèn)為苗齡為4 葉1 心期是接種的最佳時(shí)期，筆者的研究結(jié)果表明，4 葉1 心期和2葉1 心期接種結(jié)果差異不顯著，而且相比4 葉1 心期，在2 葉1 心期接種鑒定周期縮短，效率提高，是最佳接種時(shí)期，這與張若緯等[8]的研究結(jié)果一致。

孢子濃度是影響病情指數(shù)的一個(gè)重要因素。筆者的研究結(jié)果表明，當(dāng)孢子懸浮液濃度低于105個(gè)·mL-1時(shí)，植株不發(fā)病或病情發(fā)展緩慢，病情指數(shù)偏低。王迪等[25]報(bào)道，當(dāng)接種孢子濃度為104個(gè)·mL-1時(shí)，甜瓜發(fā)病率僅為48%，表明甜瓜白粉病的有效接種濃度須高于104個(gè)·mL-1。另外，筆者的研究結(jié)果表明，當(dāng)孢子濃度達(dá)到107個(gè)·mL-1時(shí)，植株發(fā)病迅速，病情指數(shù)偏高，抗病品種表現(xiàn)為中抗，因此孢子濃度過低或過高都可能對(duì)品種真實(shí)抗性水平的影響產(chǎn)生較大差異。目前多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用的孢子濃度為105個(gè)·mL-1，筆者研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孢子濃度為106個(gè)·mL-1時(shí)，植株發(fā)病相對(duì)較快，接種后8 d 即可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查，但需菌量相對(duì)105個(gè)·mL-1較大。因此，在鑒定時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況選擇孢子濃度及相應(yīng)的調(diào)查時(shí)間。

總之，快速高效的接種鑒定方法可提高抗性種質(zhì)篩選、抗性品種選育的效率，筆者篩選出的接種條件對(duì)于其他葫蘆科作物的抗性鑒定具有一定的參考價(jià)值。

4 結(jié) 論

利用噴霧接種法鑒定甜瓜苗期白粉病抗性的最佳條件為：植株在2 葉1 心期接種濃度為105個(gè)·mL-1的孢子懸浮液并于接種后12 d 調(diào)查，或接種濃度為106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液并于接種后8～12 d 調(diào)查，其結(jié)果可表現(xiàn)不同品種間的抗性差異。