甜瓜離體葉片持綠培養(yǎng)基的篩選及相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定

劉夢(mèng)麗，賀玉花，2，戶克云，孔維虎，2，張 健，2，徐永陽，2，趙光偉，2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞國(guó)家南繁研究院 海南三亞 572000）

甜瓜（Cucumis meloL.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在生產(chǎn)中病害時(shí)有發(fā)生，病菌保存是開展病害研究的前提。然而，甜瓜的白粉病、霜霉病等病原菌屬專性寄生菌，必須進(jìn)行活體寄生保存[1-2]。當(dāng)前，對(duì)甜瓜白粉病、霜霉病病原菌的保存多采用幼苗不間斷接種保存，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，接種成功率低。離體接種保存不僅操作方便、環(huán)境可控，能夠保證接種效率和成功率，還便于開展大規(guī)?？剐澡b定[3-4]。通過培養(yǎng)離體葉片來保存活性寄生菌是一種行之有效的方法[5-6]。離體葉片的生理活性是決定病菌保存時(shí)間的關(guān)鍵。因此，篩選離體葉片的持綠培養(yǎng)基，保持其生理活性，延長(zhǎng)其持綠時(shí)間對(duì)于種質(zhì)資源的抗性鑒定和病原菌保存都具有重要意義[7]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，含有苯并咪唑的培養(yǎng)基保存小麥離體葉段能夠使葉片較長(zhǎng)時(shí)間保持綠色[5]。6-芐氨基嘌呤（6-BA）也有延緩小麥、蠶豆和牡丹等作物葉片衰老的作用[8-10]。激動(dòng)素（KT）不僅可用于青菜的保鮮，還能夠延緩紅掌葉片的衰老[11-12]。在離體保存過程中，葉片的生理活性指標(biāo)也會(huì)發(fā)生變化[13]。隨著時(shí)間的增加，植物離體葉片細(xì)胞活性下降，葉片變黃，葉綠素和蛋白質(zhì)含量降低[14-15]。當(dāng)植物的葉片施用細(xì)胞分裂素后，可增強(qiáng)其超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，減少葉片中H2O2的積累，延緩衰老葉片中葉綠素的降解，顯著提高可溶性蛋白含量[10,16]。

筆者以B391 為試驗(yàn)材料，從不同濃度苯并咪唑與6-BA 和KT 配比的培養(yǎng)基中，篩選出了25 ℃條件下甜瓜離體葉片最適的持綠培養(yǎng)基，以期為后續(xù)開展甜瓜抗病性研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2021 年4－12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所智能溫室和人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所甜瓜遺傳育種課題組提供的高代自交系厚皮材料B391 為試驗(yàn)材料。

挑選籽粒飽滿勻稱的種子浸種催芽，待種子發(fā)芽后播種于裝有基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)進(jìn)行育苗，苗期進(jìn)行一致的水肥管理及病蟲害防治。待幼苗長(zhǎng)至4～5葉期時(shí)，取長(zhǎng)勢(shì)一致、無病蟲害及損傷的第3 片真葉，帶回實(shí)驗(yàn)室，用流動(dòng)的水沖洗2 h，待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料處理

參照前人研究[5，11，16]試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)苯并咪唑質(zhì)量濃度水平：100、75、50、25 mg·L-1；3 個(gè)6-BA 質(zhì)量濃度水平：75、50、25 mg·L-1；3 個(gè)KT 質(zhì)量濃度水平：30、20、10 mg·L-1。將苯并咪唑分別與6-BA 和KT 進(jìn)行配比，如表1 所示，共設(shè)置24 個(gè)處理，以無菌水為對(duì)照（CK）。各處理溶液pH 值7.0 左右，滅菌（121 ℃，20 min）后備用。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的處理組合

在超凈工作臺(tái)上，吸取溶液4 mL 加入底部墊有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，做好標(biāo)記，待用。將1.1中沖洗過的葉片，放入盛有酒精（50%）的燒杯中浸泡10 s 消毒，再用無菌水清洗兩遍后（注意動(dòng)作輕緩，不要對(duì)葉片造成損傷），放置在無菌紙上擦干葉片表面的水分。用已滅菌的剪刀，在葉柄基部2～3 cm 處斜剪，再用無菌脫脂棉包裹，放入上述培養(yǎng)皿中，最后用封口膜封口，隨后置于人工氣候箱（溫度25 ℃，光照/黑暗為16 h/8 h，濕度80%）中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

篩選甜瓜離體葉片最適持綠培養(yǎng)基甜瓜離體葉片時(shí)，在處理后的0、5、10、15、20 d，每個(gè)處理分別取6 個(gè)甜瓜離體葉片，采用SPAD-502 葉綠素含量測(cè)定儀分別測(cè)定甜瓜葉片5 個(gè)點(diǎn)的SPAD 值（圖1），取其平均值。使用最適的持綠培養(yǎng)基培養(yǎng)甜瓜離體葉片，以無菌水為對(duì)照，處理后0、3、6、9、12、15、18 d，處理和對(duì)照分別取9 個(gè)甜瓜離體葉片測(cè)量葉片SPAD 值，取其平均值。3 個(gè)葉片混合后進(jìn)行以下各個(gè)指標(biāo)的測(cè)定，3 次重復(fù)，取其平均值。采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定葉片蛋白質(zhì)含量，采用95%乙醇浸泡比色法測(cè)定總?cè)~綠素含量、葉綠素a含量、葉綠素b 含量，采用氮藍(lán)四唑方法測(cè)定SOD活性[17]。使用Abbkine 公司生產(chǎn)的Chekine 試劑盒測(cè)定葉片的POD、CAT 活性和H2O2含量，使用酶標(biāo)免疫分析儀（SpectraMax i3x）進(jìn)行讀數(shù)。

圖1 葉片SPAD 值的測(cè)量位置

1.4 數(shù)據(jù)處理

收集數(shù)據(jù)后，使用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖，使用GraphPad Prism 9.0.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 持綠培養(yǎng)基的篩選

結(jié)合葉片表型的觀察以及各時(shí)期SPAD 值的比較，由圖2 和表2 可知，甜瓜離體葉片在苯并咪唑與KT 培養(yǎng)基培養(yǎng)第20 天，處理13～24 的葉片都出現(xiàn)明顯發(fā)黃現(xiàn)象，且其SPAD 值都低于CK，表明苯并咪唑與KT 配比培養(yǎng)基不能使葉片持綠。在苯并咪唑和6-BA 培養(yǎng)基培養(yǎng)第20 天，處理1 和10的葉片SPAD 值低于CK，處理1 葉片發(fā)黃嚴(yán)重并伴隨著多處黃色斑塊，處理10 葉片出現(xiàn)多處黃色點(diǎn)狀斑塊，處理5 葉片整體黃化且葉脈明顯變黃，其余處理SPAD 值高于CK，表明苯并咪唑和6-BA配比培養(yǎng)基對(duì)葉片保持持綠有促進(jìn)作用。其中處理6 的SPAD 值（24.55）最高，高于其他處理和對(duì)照，比CK 高36.16%，除了葉脈基部變黃，大部分葉片仍能保持綠色。最終，篩選出處理6 的培養(yǎng)基為甜瓜離體葉片最適的持綠培養(yǎng)基。

圖2 不同處理各時(shí)期的離體葉片表型

表2 不同處理各時(shí)期的離體葉片SPAD 值統(tǒng)計(jì)

2.2 持綠培養(yǎng)基對(duì)甜瓜離體葉片葉綠素含量、SPAD值和蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3 可以看出，隨著處理后時(shí)間的增加，甜瓜離體葉片的SPAD 值及總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、蛋白質(zhì)含量都逐漸降低。甜瓜離體葉片在經(jīng)過最適持綠培養(yǎng)基處理后，在各個(gè)時(shí)期的所有測(cè)定值均高于或等于CK。在各個(gè)時(shí)期，處理組葉片的SPAD 值均顯著或極顯著高于CK。在第18 天時(shí)，對(duì)照葉片的SPAD 值降低了90.85%，處理葉片的SPAD 值降低了74.26%。在處理后第6 天，處理組葉片蛋白質(zhì)含量比CK 高65.37%，兩者存在極顯著差異。由此可知，最適持綠培養(yǎng)基能夠延緩甜瓜離體葉片中葉綠素和蛋白質(zhì)的降解，從而使甜瓜離體葉片能夠較長(zhǎng)時(shí)間地保持活性，達(dá)到持綠的效果。

圖3 持綠培養(yǎng)基處理的離體葉片葉綠素含量（A、B 和C）、SPAD 值（D）和蛋白質(zhì)含量（E）

2.3 持綠培養(yǎng)基對(duì)甜瓜離體葉片抗氧化酶活性和H2O2含量的影響

由圖4 可以看出，隨著處理時(shí)間的增加，甜瓜離體葉片的H2O2含量和POD 活性逐漸增加；SOD和CAT 活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，并在處理后第3 天達(dá)到最大值。與CK 相比，處理組葉片在各個(gè)時(shí)期的POD、SOD、CAT 活性均高于對(duì)照組，H2O2含量均低于CK。其中，在處理后的各個(gè)時(shí)期，處理組甜瓜離體葉片SOD 和POD 活性均顯著或極顯著高于CK。以上結(jié)果表明，最適持綠培養(yǎng)基能夠有效增強(qiáng)甜瓜離體葉片防御酶的活性，從而增強(qiáng)了甜瓜葉片清除H2O2的能力，達(dá)到葉片持綠的效果。

圖4 持綠培養(yǎng)基處理的離體葉片抗氧化酶活性（A、B 和C）和H2O2 含量（D）

3 討論與結(jié)論

葉片在離體情況下，會(huì)快速發(fā)生黃化，伴隨著體內(nèi)一系列生理生化變化[13]。研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中含有一定濃度的苯并咪唑時(shí)，離體葉片能較長(zhǎng)時(shí)間保持綠色[5]。外源施用6-BA 和KT，同樣有延緩葉片衰老的作用[18-19]。筆者從24 個(gè)不同濃度苯并咪唑與6-BA、KT 配比的培養(yǎng)基中，篩選出最適的持綠培養(yǎng)離體葉片的培養(yǎng)基為75 mg·L-1苯并咪唑＋25 mg·L-16-BA。與對(duì)照（無菌水）對(duì)比，最適的持綠培養(yǎng)基能夠有效增加葉片持綠時(shí)間，與前人研究結(jié)果一致。

葉片在黃化過程中，葉片內(nèi)積累大量的活性氧，對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通常伴隨著葉綠素和蛋白質(zhì)降解，從而使葉片光合速率降低[14]。葉片內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)（POD、SOD、CAT）會(huì)及時(shí)清除體內(nèi)多余的自由基，能有效阻止體內(nèi)超氧陰離子自由基、H2O2、羥基自由基等的累積，防止膜脂的過氧化作用，延緩植物衰老，使植物維持正常的生長(zhǎng)和發(fā)育[20]。葉綠素含量的多少能夠直接影響植物的光合效率，較高的光合速率能夠使葉片保持較高的活性[21]。在葉片黃化過程中，葉片內(nèi)蛋白質(zhì)迅速降解，核酸合成減弱，進(jìn)而加速葉片黃化，蛋白質(zhì)含量也是評(píng)價(jià)葉片活性的重要指標(biāo)[15]。噴施6-BA 能顯著延緩植物葉片的葉綠素含量下降，顯著提高葉片的可溶性蛋白含量，提高其SOD、POD和CAT 活性，減慢H2O2的上升速率，延緩葉片的衰老[10，22]。在筆者的試驗(yàn)中，甜瓜葉片在黃化進(jìn)程中，葉片SPAD 值和總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b 及蛋白質(zhì)含量都逐漸降低，與前人研究結(jié)果一致。在甜瓜葉片黃化進(jìn)程中，葉片SOD、CAT 活性先升高后降低，POD 活性逐漸升高，其變化與辣椒[13]葉片在衰老過程中的變化一致。

前人研究表明，用含有30 mg?L-1苯并咪唑的甘露醇培養(yǎng)基培養(yǎng)離體的甜瓜子葉，用來分離純化、保存甜瓜白粉病菌[23]。用含有50 mg?L-1苯并咪唑的0.5%瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)甜瓜離體葉片，用來接種白粉病菌，20 d 后葉片基本綠色，且葉片出現(xiàn)白粉病斑，用顯微鏡觀察，白粉病菌沒有受到污染，且孢子活性較強(qiáng)，適合接種[4]。由此看來，培養(yǎng)甜瓜離體葉片來保存病菌切實(shí)可行。

筆者從24 個(gè)處理中，篩選出處理75 mg·L-1苯并咪唑＋25 mg·L-16-BA 為甜離體葉片最適持綠培養(yǎng)基。與對(duì)照（無菌水）相比，該培養(yǎng)基能夠通過增強(qiáng)葉片保護(hù)酶（POD、SOD、CAT）活性，加強(qiáng)活性氧清除能力，減緩葉綠素和蛋白質(zhì)的降解，使得甜瓜葉片在離體條件下能夠保持較長(zhǎng)時(shí)間的活性，該處理能有效延緩葉片黃化，增加葉片在離體環(huán)境下的持綠時(shí)間，可用于提高病菌離體接種的準(zhǔn)確性以及延長(zhǎng)病菌的離體保存時(shí)間，這對(duì)探索甜瓜專性寄生菌理想的保存方法以及快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)地評(píng)價(jià)種質(zhì)資源抗性具有重要意義，也可以為進(jìn)一步的甜瓜抗性遺傳規(guī)律及基因定位的研究奠定基礎(chǔ)。