LC/Q-TOF鑒定蠔油中非揮發(fā)性特征物質(zhì)的研究

TIN Hoe-seng

(華南師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣州 510631)

牡蠣又名蠔、蠣黃、海蠣子，屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、異柱目(Anisomyaria)、牡蠣科(Ostreinae)，是世界上重大的養(yǎng)殖貝類(lèi)，同時(shí)也是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量很大的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，尤其在廣東、廣西、福建、浙江、臺(tái)灣等沿海地區(qū)資源非常豐富[1]?！?020中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)顯示[2]，2019年中國(guó)牡蠣海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到522.56萬(wàn)噸，相比2018年的513.98萬(wàn)噸增長(zhǎng)1.7%。中國(guó)牡蠣的主要產(chǎn)地集中在福建和廣東等地，福建牡蠣養(yǎng)殖歷史悠久，迄今已成為中國(guó)較大的牡蠣養(yǎng)殖區(qū)。2019年福建省牡蠣海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到201萬(wàn)噸，位居全國(guó)前列，其次是廣東省114萬(wàn)噸。牡蠣不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)(包括8種人體必需氨基酸)、糖原、維生素及鋅、硒、鐵、銅、碘等微量元素，而且具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種保健功能[3-4]。此外，牡蠣肉細(xì)嫩、味鮮美，具有良好的食品加工價(jià)值，其中蠔油是牡蠣精深加工的主要產(chǎn)品之一。

蠔油是一種利用牡蠣蒸煮后的汁液(即蠔汁)進(jìn)行濃縮或直接酶解牡蠣肉，再加入糖、食鹽、淀粉或改性淀粉等原料，輔以其他配料和食品添加劑制成的調(diào)味品[5]。其成品鮮亮有光澤、蠔香濃郁、滋味鮮美、入口滑潤(rùn)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受廣東、福建、港澳臺(tái)及東南亞地區(qū)消費(fèi)者的喜愛(ài)，在內(nèi)陸地區(qū)的市場(chǎng)銷(xiāo)售份額也逐漸擴(kuò)大[6-7]。

蠔油等水產(chǎn)調(diào)味品的滋味主要包括鮮、甜、咸、苦、酸等。其中鮮味也是水產(chǎn)品的特征風(fēng)味之一，主要的鮮味物質(zhì)有鮮味氨基酸(如谷氨酸)[8]、呈味核苷酸(如IMP和GMP等)、呈味肽、乳酸、琥珀酸等[9-10]。還有許多協(xié)同增鮮物，如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸及一些無(wú)機(jī)物等。呈味肽一般是指對(duì)食品風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)的寡肽類(lèi)物質(zhì)，是從食物中提取或由氨基酸合成，包括特征滋味肽和風(fēng)味前體肽[11]。呈味肽具有多種滋味特征，其呈味效果往往不是單一的某種滋味，而是各種滋味的綜合效應(yīng)，從而賦予食品鮮美濃郁、圓潤(rùn)香滑、回味悠長(zhǎng)的味感，能夠通過(guò)協(xié)同作用呈現(xiàn)出一定的鮮味特征[12]，為食品增添風(fēng)味，同時(shí)還能提供肽及氨基酸類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分[13]，是蠔油極為關(guān)鍵的風(fēng)味物質(zhì)。

許凌志[14]利用模糊技術(shù)評(píng)價(jià)發(fā)酵蠔油，但該研究只納入了脂肪、蛋白質(zhì)及氨基酸總量為關(guān)鍵指標(biāo)組分，不足以精準(zhǔn)衡量其中的關(guān)鍵物質(zhì)。王豐[15]針對(duì)不同加工工藝對(duì)濃縮蠔汁風(fēng)味的影響進(jìn)行研究，并利用氨基酸分布及感官鑒評(píng)對(duì)不同加工工藝的蠔汁進(jìn)行評(píng)價(jià)，并未對(duì)除了氨基酸之外的組分進(jìn)行研究。然而，目前針對(duì)牡蠣或蠔油中非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究較少，尤其是蠔油呈味肽信息更是稀缺[16-17]。

本研究選擇不同品牌的蠔油，研究非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的差異性，采用溶劑溶解-離心分離的方法進(jìn)行前處理，樣品上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾后直接使用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，在較寬的質(zhì)量范圍內(nèi)，對(duì)蠔油中的非揮發(fā)性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離和鑒別；通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件篩選可能的備選物，再通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜的目標(biāo)物碎片掃描，結(jié)合譜庫(kù)檢索，推測(cè)出目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)。該研究結(jié)果以期能夠?yàn)橄栍彤a(chǎn)品風(fēng)味質(zhì)量的精準(zhǔn)控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蠔油：購(gòu)于線(xiàn)下超市以及線(xiàn)上電商；色譜純甲醇、色譜純乙腈、分析純甲酸：美國(guó)賽默飛世爾公司。

Agilent 6545B LC/Q-TOF MS四極桿飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)、離子源類(lèi)型ESI； Eppendorf 5804R低溫高速冷凍離心機(jī)；Milli-Q Synergy Water Purification System超純水機(jī)。

1.2 方法

稱(chēng)取5.0 g蠔油待測(cè)樣品于離心管中，然后向離心管中加入5.0 mL甲醇(色譜純)溶液，采用渦旋混合器充分混合均勻，靜置10 min后，以10000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm的有機(jī)相濾膜，最后將上清液直接進(jìn)行進(jìn)樣分析。

液相色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)。

流動(dòng)相：含0.1%甲酸的高純水(溶劑A)、乙腈(溶劑B)。流速為0.30 mL/min，進(jìn)樣體積為5.0 μL，洗脫方式見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相洗脫方式Table 1 Mobile phase elution method

柱溫箱溫度30 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度25 ℃，正離子模式掃描。干燥氣溫度為325 ℃，干燥氣流速為10 L/min，鞘氣(N2)溫度為350 ℃，鞘氣流速為11 L/min，霧化氣壓力為10 psi，毛細(xì)管電壓為4000 V。采樣模式全掃描，質(zhì)荷比范圍50～1500 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用MassHunter Profinder軟件處理LC/MS一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)：通常使用批量遞歸特征提取的方式提取化合物，選擇Batch Recursive Feature Extraction (small molecules/peptides)，依次設(shè)定保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)范圍(250～1000 Da)、基線(xiàn)特征、加和離子類(lèi)型和模式、同位素類(lèi)型、化合物電荷數(shù)量等諸多參數(shù)，運(yùn)行批處理后，得到提取出的化合物列表(未對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定)，且包含化合物對(duì)應(yīng)的色譜圖和質(zhì)譜圖。最后將生成的化合物列表導(dǎo)出為cef文件，供MPP軟件進(jìn)一步分析。

使用Mass Profiler Professional軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：將ProFinder軟件導(dǎo)出的cef數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入MPP軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、排序，完成數(shù)據(jù)分組和過(guò)濾，對(duì)化合物響應(yīng)值進(jìn)行歸一化處理，選擇合適的響應(yīng)基線(xiàn)，完成數(shù)據(jù)導(dǎo)入。之后軟件將自動(dòng)創(chuàng)建一個(gè)顯著性分析的工作流程，用于創(chuàng)建在組間有顯著性差異的化合物。按顯著性分析的步驟流程，能夠在不同來(lái)源、品牌的蠔油的眾多揮發(fā)性化合物中，找出在組間響應(yīng)值有顯著性變化的化合物，并導(dǎo)出差異化合物列表。

二級(jí)質(zhì)譜掃描：一級(jí)質(zhì)譜掃描得到的共有的特征化合物并未進(jìn)行譜庫(kù)檢索定性，需要進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描。針對(duì)在蠔汁/蠔油中存在組間顯著性差異的共有化合物，將其保留時(shí)間、母離子質(zhì)荷比、碰撞能量等參數(shù)導(dǎo)入液質(zhì)Targeted MS/MS掃描方法中，對(duì)樣品進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，采集的結(jié)果與代謝庫(kù)和多肽庫(kù)等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)這些共有化合物進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

將4種蠔油中的非揮發(fā)性化合物數(shù)據(jù)導(dǎo)入MPP軟件，經(jīng)顯著性分析，4種蠔油中的共有特征化合物共計(jì)67種，占總數(shù)的23.1%，具體見(jiàn)圖1。

圖1 4種蠔油共有的特征化合物Fig.1 Common characteristic compounds in the four kinds of oyster sauce

對(duì)于通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜篩選出的特征化合物，采用UHPLC再次對(duì)樣品進(jìn)行分離，電噴霧解離后，在碰撞室內(nèi)被轟擊后，斷裂成碎片離子，根據(jù)碎片離子質(zhì)荷比的不同進(jìn)一步分離，被檢測(cè)器接收，最終形成MS/MS圖譜。多肽斷裂過(guò)程中，主要形成衛(wèi)星離子、序列離子和中間碎片離子，其中a，b和c為多肽N末端離子，x，y和z為多肽C端離子，而同一系列內(nèi)相鄰的離子碎片之間質(zhì)荷比的差值可以體現(xiàn)它們之間相差的氨基酸信息。由于多肽鏈中的酰胺鍵更易于斷裂，使得b和y離子在二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)的幾率較大，因此可將二級(jí)質(zhì)譜中的b和y離子碎片解出多肽鏈的氨基酸序列。

選擇共有化合物中響應(yīng)值較高的若干化合物，對(duì)其二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行解析，見(jiàn)圖2。由圖2可知，保留時(shí)間在17.4 min左右的化合物被鑒定為Glu-Cys。其基峰離子為加和物[M+NH4]+=268.097 Da，其分子離子峰M+=250.087 Da。其碎片離子中強(qiáng)度最高的為130.065 Da，推測(cè)是Glu殘基；二者之差為120.097 Da，推測(cè)為Cys殘基。

依照上述類(lèi)似的解析方法，對(duì)較高響應(yīng)值的共有化合物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的解析，見(jiàn)圖3。由圖3可知，保留時(shí)間在1.85 min左右的化合物被鑒定推測(cè)為T(mén)hr-Phe-Lys-Leu；保留時(shí)間在5.47 min左右的化合物被鑒定推測(cè)為Gly-Pro-Pro-Val；保留時(shí)間在14.57 min左右的化合物被鑒定推測(cè)為Arg-Ser-Thr-Thr；保留時(shí)間在32.19 min左右的化合物被鑒定推測(cè)為Cys-Trp-Ser。

圖2 UHPLC-ESI-Q-TOF MS/MS鑒定蠔油中多肽的氨基酸序列(1)Fig.2 Amino acid sequence of the polypeptides in oyster sauce determined by UHPLC-ESI-Q-TOF MS/MS (1)

(a) Thr-Phe-Lys-Leu

(b) Gly-Pro-Pro-Val

(c) Arg- Ser-Thr-Thr

(d) Cys-Trp-Ser

4種蠔油中的非揮發(fā)性化合物數(shù)據(jù)經(jīng)解析鑒定后，得到26種多肽類(lèi)化合物(見(jiàn)表2)，其摩爾分子質(zhì)量介于250～670 Da之間，具有2～5個(gè)碳原子的支鏈，在4種蠔油中相對(duì)含量有所差異。其中，Asp-Leu-Arg(Cpd11)，Thr-Phe-Lys-Leu(Cpd04)及Asp-Glu-Ile-Leu (Cpd42) 在蠔油1中的相對(duì)豐度達(dá)到了16.81%、10.78%、10.59%。在蠔油2中發(fā)現(xiàn)，Ile-Glu-Asp-Phe(Cpd41)及 Ser-Ile-Asn-Val(Cpd10)的相對(duì)豐度分別達(dá)到了19.64%及18.56%。寡肽Ile-Glu-Asp-Phe(Cpd41)及Asp-Glu-Ile-Leu (Cpd42)在蠔油3中也達(dá)到了19.99%及17.25%的水平。蠔油4中Thr-Phe-Lys-Leu(Cpd04)及Val-Pro-Gln-Val(Cpd32)分別達(dá)到了15.80%及13.04%的水平。這些寡肽主要來(lái)自于酶作用下的蛋白質(zhì)酶解以及蒸煮過(guò)程中水解所形成的寡肽[18]。

將所有多肽數(shù)據(jù)導(dǎo)入MPP軟件，經(jīng)顯著性分析，4種蠔油可以聚為兩類(lèi)，蠔油1、蠔油2和蠔油3明顯較為接近，而蠔油4與前三者存在一定的差異(見(jiàn)圖4)，進(jìn)一步說(shuō)明4種蠔油在加工工藝上有一定的差異。王豐討論了4種加工工藝(原汁蠔油加工、復(fù)合蠔汁加工、酶法釀造蠔汁加工和復(fù)合蠔汁加工工藝改進(jìn))對(duì)濃縮蠔汁風(fēng)味的影響，并得出不同加工工藝對(duì)蠔汁品質(zhì)的影響相當(dāng)顯著，與本文得到的聚類(lèi)結(jié)果相符。

研究表明，肽鏈長(zhǎng)度在一定程度上影響著肽分子的呈味性能。呈味肽氨基酸骨架結(jié)構(gòu)式氨基酸數(shù)量在3～9 u之間，取值在4～6 u之間鮮味最強(qiáng)[19]。在鮮味肽的呈味規(guī)律機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，不論是來(lái)自于谷元粉[20]、大豆[21]或者豆醬[22]，其分子量均集中在100～5000 u之間，集中在<1000 u范圍內(nèi)，與本研究中所鑒定的肽分子質(zhì)量一致。此外，鮮味肽的氨基酸組成直接影響著其呈味效果。據(jù)報(bào)道，鮮味肽序列中通常含有Glu和Asn酸性基團(tuán)的1種或2種[23]，或是含有一定的親水性氨基酸殘基Tyr、Gly、Thr、Phe、Asp等[24]，且在堿性氨基酸和酸性氨基酸共同存在的情況下鮮味肽方可呈現(xiàn)出鮮味,與本文相符。

表2 4種蠔油中多肽特征化合物相對(duì)豐度Table 2 Relative abundance of polypeptide characteristic compounds in the four kinds of oyster sauce

續(xù) 表

圖4 4種蠔油中多肽特征化合物聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.4 Dendogram of polypeptide characteristic compounds in four kinds of oyster sauce

3 結(jié)論

應(yīng)用MassHunter Profinder軟件處理LC/MS一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合Mass Profiler Professional軟件進(jìn)行顯著性分析，在不同的蠔汁和蠔油中成功找出組間響應(yīng)值有顯著性變化的化合物。利用二級(jí)質(zhì)譜掃描，結(jié)果與代謝庫(kù)和多肽庫(kù)等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)這些化合物進(jìn)行定性分析，蠔油中的非揮發(fā)性化合物數(shù)據(jù)經(jīng)解析鑒定后得到26種多肽類(lèi)化合物。結(jié)果表明，研究建立的方法體系將多肽數(shù)據(jù)經(jīng)顯著性差異分析能夠?qū)⑾栍瓦M(jìn)行聚類(lèi)，明確蠔油中特征物質(zhì)的差異性，可為蠔油風(fēng)味質(zhì)量控制研究提供一定的參考。