釀酒酵母發(fā)酵制備蒜氨酸的工藝研究

戴慧敏，王立三，涂媛，蔡俊*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；2.勸農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)公司，湖北 恩施 444324)

蒜氨酸，化學(xué)名為S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜，是一種存在于百合科蔥屬植物鱗莖中的較穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)類(lèi)含硫氨基酸。高純度的蒜氨酸是無(wú)臭無(wú)味的白色晶體，易溶于水但不溶于乙醇[1-3]?，F(xiàn)代科學(xué)表明，蒜氨酸有降低膽固醇、預(yù)防肥胖、抗腫瘤和抗癌等功能[4-8]，與肌苷酸或葡萄糖反應(yīng)后的分離物具有烤肉味和蒜香味[9]，可以被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品的生產(chǎn)。此外，蒜氨酸對(duì)多種微生物尤其是食品腐敗菌的生長(zhǎng)有極強(qiáng)的抑制作用，并且對(duì)人體無(wú)毒害[10-13]，是國(guó)內(nèi)外均認(rèn)可的食品添加劑[14]。因此，蒜氨酸既可作為良好的食品防腐劑來(lái)延長(zhǎng)果蔬的保鮮期[15-16]，也可以被開(kāi)發(fā)成一種高效的藥物制劑，具有很好的應(yīng)用前景。

目前蒜氨酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法[17-19]、組織培養(yǎng)法[20-21]和從植物中提取?；瘜W(xué)合成法得率高，但是由于原料中的烯丙基溴具有強(qiáng)毒性，對(duì)人體和環(huán)境會(huì)造成較大的危害，反應(yīng)收率低，后處理麻煩，并且化學(xué)合成會(huì)產(chǎn)生兩種立體異構(gòu)體L-(+)蒜氨酸和L-(-)蒜氨酸，而天然蒜氨酸僅以L-(+)形式存在，因此限制了它的應(yīng)用范圍。從植物中提取包括水提醇沉法和有機(jī)溶劑提取法，水提醇沉法的工藝不夠成熟，而有機(jī)溶劑存在潛在的毒性，并且蒜酶的存在會(huì)導(dǎo)致蒜氨酸的分解，給蒜氨酸的提取造成了一定的難度，進(jìn)一步增加了成本[22-24]，因此開(kāi)發(fā)綠色安全的生物法生產(chǎn)蒜氨酸勢(shì)在必行。

植物體內(nèi)的蒜氨酸是在半胱氨酸合成酶的作用下，由絲氨酸與乙酰輔酶A結(jié)合生成 O-乙酰絲氨酸后，與烯丙基硫醇結(jié)合生成 S-烯丙基-L-半胱氨酸，再氧化 S-烯丙基-L-半胱氨酸形成[25]。在微生物體內(nèi)，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)和O-乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶(OASS)共同組成酶復(fù)合體，即半胱氨酸合成酶。微生物也能利用半胱氨酸合成酶將環(huán)境中的無(wú)機(jī)硫還原成S2-，進(jìn)入到半胱氨酸的合成中。而OASS能利用半胱氨酸生物合成體系，以親核試劑和硫醇代替各種S2-合成非蛋白質(zhì)氨基酸[26-27]。目前已有研究報(bào)道了利用大腸桿菌中重組表達(dá)的OASS合成藥物中間體S-苯基-L-半胱氨酸及L-α-丙氨酸[28]，為利用OASS在微生物體內(nèi)合成蒜氨酸提供了參考。

本研究以烯丙基硫醇為底物，從實(shí)驗(yàn)室保藏的19種酵母菌株中，篩選出一株S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量較高的釀酒酵母CCCG，研究了溫度、初始pH、接種量、裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速、烯丙基硫醇添加量等發(fā)酵條件對(duì)釀酒酵母產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸含量的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，經(jīng)釀酒酵母的發(fā)酵及H2O2的氧化得到蒜氨酸的最佳發(fā)酵條件，為生物法合成蒜氨酸提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)室保藏釀酒酵母菌株：CGY2、CGY、CCCG、CLS、CCY、CHY、CBY、CGWY、CEPY、CKY、CMY、CRY、BDYD、JYYJS、JYYR、JYFI、GAQ1、GAQ2、

GAQ4。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)：美國(guó)Fisher Scientific公司；蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：上海源葉生物科技有限公司；S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、烯丙基硫醇(分析純)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.0，在115 ℃下滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.0，在115 ℃下滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，(NH4)2SO48 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO40.15 g/L，pH 6.0，在115 ℃下滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LD-20AD高效液相色譜系統(tǒng)(配有SPD-20A紫外檢測(cè)器) 日本島津公司；質(zhì)譜引導(dǎo)的高通量自動(dòng)純化系統(tǒng)(配有電噴霧離子源(ESI)) 沃特世科技(上海)有限公司；WH-2微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

分別將活化的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為180 r/min，在30 ℃培養(yǎng)12 h后，加入烯丙基硫醇，繼續(xù)培養(yǎng)19 h。由于S-烯丙基-L-半胱氨酸經(jīng)過(guò)H2O2的氧化后即為蒜氨酸，因此先篩選出能產(chǎn)生S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株。培養(yǎng)結(jié)束取樣處理后，利用HPLC測(cè)定其中S-烯丙基-L-半胱氨酸的含量，而后在經(jīng)過(guò)處理的樣品中加入30% H2O2，持續(xù)攪拌24 h后測(cè)定其中蒜氨酸的含量[29-30]，篩選出S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸產(chǎn)量較高的菌株，并利用質(zhì)譜法進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選的菌株具有產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的能力。

1.3.2 樣品處理

水分含量測(cè)定：菌懸液經(jīng)8000 r/min離心去上清液，無(wú)菌水清洗菌體3次，稱(chēng)取濕菌體重量M1，置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)取干菌體重量M2。

(1)

式中：M1為濕菌體的重量，g/L；M2為干菌體的重量，g/L。

破壁提取胞內(nèi)S-烯丙基-L-半胱氨酸：菌懸液經(jīng)8000 r/min離心去上清液，無(wú)菌水洗滌3次，稱(chēng)取菌體濕重，重懸濕菌體定容至恒定體積。定容后取適量菌懸液稀釋?zhuān)谘蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取3次平行計(jì)數(shù)結(jié)果。采用超聲破壁法，設(shè)定功率為300 W，于冰浴條件下超聲破碎30 min(設(shè)定工作1 s，間隔1 s)[31- 32]，取適量破壁后的菌懸液稀釋?zhuān)谘蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取3次平行計(jì)數(shù)結(jié)果。

(2)

式中：N1為破壁前細(xì)胞數(shù)；N2為破壁后細(xì)胞數(shù)。

胞內(nèi)S-烯丙基-L-半胱氨酸含量測(cè)定：破壁后的菌懸液經(jīng)8000 r/min離心取上清液，將上清液用微濾膜(0.22 μm)過(guò)膜后利用高效液相色譜法計(jì)算得到提取液中S-烯丙基-L-半胱氨酸的濃度，最后計(jì)算得到每克干細(xì)胞中S-烯丙基-L-半胱氨酸的含量。

S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量(mg/g)=

(3)

1.3.3 S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的定量和定性分析

1.3.3.1 S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的定量分析

色譜條件：色譜柱Inertsil ODS SP C18(4.6 mm×150 mm， 5 μm)；流動(dòng)相甲醇∶甲酸水溶液為5∶95(體積比)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別配制濃度為200，400，600，800，1000 μg/mL的S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以不同的S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以HPLC法測(cè)定的峰面積數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪圖得到S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的定性分析

質(zhì)譜條件：離子方式：電噴霧正離子化(ESI+)；毛細(xì)管電壓3.5 kV；錐孔電壓25 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃；質(zhì)量掃描范圍100～200 m/z；選擇性離子檢測(cè)(SIM)162 m/z和 178 m/z。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件

通過(guò)單因素試驗(yàn)改變發(fā)酵條件，分別考察烯丙基硫醇添加量、初始pH、溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1，按照每個(gè)因素分別進(jìn)行試驗(yàn)研究。

表1 單因素不同水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Single factor test design at different levels

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用七因素三水平，通過(guò)正交試驗(yàn)L18(37)選取最優(yōu)發(fā)酵條件，因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法測(cè)定S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

按照1.3.3.1中的方法，在200 μg/mL～1 mg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系，S-烯丙基-L-半胱氨酸的回歸方程為：Y=5496.3X-44949(R2=0.9997)，蒜氨酸的回歸方程為：Y=7232.5X+39674(R2=0.9998)。

2.2 高產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株的篩選

通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定15種酵母細(xì)胞合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量，結(jié)果表明有10種酵母菌株具有利用烯丙基硫醇合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的能力，在產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株中，有兩株酵母干重產(chǎn)量超過(guò)50 mg/g DCW，分別為酵母CCCG和酵母BDYD，干重產(chǎn)量分別為(52.35±0.86) mg/g DCW和(50.16±1.00) mg/g DCW；通過(guò)對(duì)兩種菌株重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酵母CCCG合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的干重產(chǎn)量明顯高于酵母BDYD，因此選擇釀酒酵母CCCG作為發(fā)酵制備蒜氨酸的菌株。

圖1 不同酵母菌株S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量Fig.1 S-allyl-L-cysteine yield of different Saccharomyces cerevisiae strains

2.3 S-烯丙基-L-半胱氨酸及蒜氨酸的定性分析

對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品、酵母CCCG的細(xì)胞破碎液、蒜氨酸標(biāo)品及酵母CCCG的細(xì)胞破碎液經(jīng)雙氧水處理后的樣品分別進(jìn)行ESI-MS分析，進(jìn)一步驗(yàn)證S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的生成，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 S-烯丙基-L-半胱氨酸電噴霧電離源-質(zhì)譜圖Fig.2 ESI-MS of S-allyl-L-cysteine

由圖2中a和b可知，S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品和酵母CCCG的細(xì)胞破碎液的準(zhǔn)分子離子流圖均在3.42 min左右出峰。由圖2中c可知，酵母CCCG的細(xì)胞破碎液在3.42 min處出現(xiàn)m/z=162.25，為S-烯丙基-L-半胱氨酸的準(zhǔn)分子離子[M+H]+，因此確定酵母CCCG具有合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的能力。

圖3 蒜氨酸電噴霧電離源-質(zhì)譜圖Fig.3 ESI-MS of alliin

由圖3中a和b可知，蒜氨酸標(biāo)品和酵母CCCG的細(xì)胞破碎液經(jīng)H2O2處理后的準(zhǔn)分子離子流圖均在2.88 min左右出峰。由圖3中c可知，酵母CCCG的細(xì)胞破碎液經(jīng)H2O2處理后的樣品在2.887 min處出現(xiàn)m/z=178.00，為蒜氨酸的準(zhǔn)分子離子[M+H]+，確定了產(chǎn)物蒜氨酸的生成。

2.4 發(fā)酵條件對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響

不同發(fā)酵條件對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖4 。

圖4 不同發(fā)酵條件對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different fermentation conditions on dry weight yield of S-allyl-L-cysteine

由圖4中a可知，溫度在20～30 ℃時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加，在30 ℃時(shí)達(dá)到最大，為(57.7±1.65) mg/g DCW，但發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降，可能是由于溫度過(guò)高，發(fā)酵過(guò)程中添加的一部分烯丙基硫醇未反應(yīng)就已經(jīng)分解，從而降低了S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量。

由圖4中b可知，當(dāng)pH在4～6之間時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)pH為6時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大，約為(58±1.44) mg/g DCW，pH繼續(xù)升高，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降，可能是由于pH過(guò)高影響了酵母的生長(zhǎng)，從而影響了S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量。

由圖4中c可知，當(dāng)接種量在6%～10%之間時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量為10%時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大，為(56.2±0.89) mg/g DCW，當(dāng)接種量繼續(xù)增大時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量減少，可能是因?yàn)榻臃N量較少時(shí)，菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期會(huì)延長(zhǎng)，導(dǎo)致處于生長(zhǎng)繁殖期的菌體的發(fā)酵能力較差，S-烯丙基-L-半胱氨酸的合成不夠，接種量較大時(shí)，發(fā)酵時(shí)間縮短，降低了S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量，因此選取接種量10%為最佳。

由圖4中d可知，搖瓶轉(zhuǎn)速在140～180 r/min時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降，故確定最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min。

由圖4中e可知，裝液量在25～50 mL之間時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)裝液量在50 mL時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量最大，為(60.2±0.9) mg/g DCW，裝液量繼續(xù)增加，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降，因此確定最佳裝液量為50 mL。

2.5 烯丙基硫醇添加量對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響

由圖5可知，當(dāng)烯丙基硫醇添加量在0.5～1.5 mL之間時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量隨著烯丙基硫醇添加量的增加而增加，當(dāng)烯丙基硫醇添加量為1.5 mL時(shí)，S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大，為(53.6±1.43) mg/g DCW，可能是由于烯丙基硫醇添加量過(guò)大時(shí)，會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降，因此確定最佳的烯丙基硫醇添加量為1.5 mL。

圖5 烯丙基硫醇添加量對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of allyl mercaptan addition amount on dry weight yield of S-allyl-L-cysteine

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表3。

表3 L18(37)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 L18(37) orthogonal test design and results

續(xù) 表

由表3可知，6個(gè)因素的影響程度由高到低為溫度>烯丙基硫醇添加量>搖瓶轉(zhuǎn)速>裝液量>接種量>初始pH，最優(yōu)水平組合為A2F2C2E2D3B1，正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis results of orthogonal test

由表4可知，溫度和烯丙基硫醇添加量均為顯著因素，其中溫度的顯著性大于烯丙基硫醇添加量的顯著性，正交試驗(yàn)R2=0.938，說(shuō)明試驗(yàn)中有93.8%的數(shù)據(jù)可信。

2.7 正交驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品、經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證最優(yōu)組合得到的酵母細(xì)胞CCCG的細(xì)胞破碎液、蒜氨酸標(biāo)品及細(xì)胞破碎液經(jīng)雙氧水處理后的樣品分別進(jìn)行HPLC分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 S-烯丙基-L-半胱氨酸高效液相色譜圖Fig.6 HPLC of S-allyl-L-cysteine

由圖6可知，S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品的出峰時(shí)間為11.148 min，細(xì)胞破碎液在11.20 min出峰，與標(biāo)品出峰時(shí)間相近，證明有產(chǎn)物S-烯丙基-L-半胱氨酸的生成。

圖7 蒜氨酸高效液相色譜圖Fig.7 HPLC of alliin

由圖7可知，蒜氨酸標(biāo)品的出峰時(shí)間為5.336 min，細(xì)胞破碎液在5.36 min出峰，與標(biāo)品出峰時(shí)間相近，證明有產(chǎn)物蒜氨酸的生成。

經(jīng)方差分析得到的最優(yōu)組合為A2B1C2D3E2F2，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證最優(yōu)組合的S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量為(136.01±0.88) mg/g DCW，正交試驗(yàn)中最佳組合A2B1C2D3E3F2的試驗(yàn)結(jié)果為(128.29±0.67) mg/g DCW，經(jīng)H2O2氧化后得蒜氨酸的干重產(chǎn)量為(68.281±0.93) mg/g DCW。綜合k值和正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果可知，利用釀酒酵母產(chǎn)蒜氨酸的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B1C2D3E2F2，即培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始pH為5，搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，接種量為10%，裝液量為50 mL/250 mL,烯丙基硫醇添加量為1.5 mL。

3 結(jié)論

蒜氨酸作為一種天然活性物質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定、生物活性高且安全無(wú)毒，其受熱分解能產(chǎn)生多種具有特殊風(fēng)味和生物活性的含硫化合物[33]。酵母作為國(guó)際上公認(rèn)的安全的食品級(jí)微生物，其抽提物也是一種純天然和營(yíng)養(yǎng)的食品輔料[34-35]。因此，利用釀酒酵母發(fā)酵制備蒜氨酸在天然植物防腐保鮮劑、食品調(diào)味劑、保健品等方面具有極大的應(yīng)用潛力。

本研究以烯丙基硫醇為底物，從19種酵母中篩選出能產(chǎn)生S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株，并通過(guò)H2O2的氧化作用，產(chǎn)生蒜氨酸，通過(guò)ESI-MS和HPLC法驗(yàn)證了產(chǎn)物的生成。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間19 h，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量10%，初始pH 5，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量50 mL/250 mL，烯丙基硫醇添加量1.5 mL，在此條件下，經(jīng)H2O2的氧化作用，蒜氨酸的干重產(chǎn)量為(68.281±0.93) mg/g DCW，比優(yōu)化前提高了1.96倍。本研究利用蒜氨酸在植物體內(nèi)的生物合成途徑，以烯丙基硫醇為底物，作用于釀酒酵母CCCG的相關(guān)代謝途徑中，實(shí)現(xiàn)了蒜氨酸的生物合成，為生物法合成蒜氨酸的研究提供了數(shù)據(jù)參考。后續(xù)研究將從代謝途徑的調(diào)控入手，通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵提高底物的利用率以及由底物烯丙基硫醇直接發(fā)酵合成蒜氨酸；尋找替代外加H2O2氧化的方法，以期提高S-烯丙基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蒜氨酸的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)一步優(yōu)化生物法合成蒜氨酸的工藝。