稻田不同輪作休耕模式下土壤反硝化功能基因群落結構

李娜，徐慧芳，黃國勤

江西農業(yè)大學生態(tài)科學研究中心，南昌 330045

水稻是世界三大糧食作物之一。2019 年，我國水稻收獲面積為6 092.19 萬hm2，居世界首位，約占全球水稻收獲面積的1/3（http：//www.fao.org/home/en/）。稻田土壤長期處于淹水厭氧狀態(tài)，反硝化作用強烈，導致稻田氮素氣態(tài)損失嚴重，氮肥利用率低下，約為30%~40%[1］。反硝化產物氧化亞氮（N2O）是一類重要的溫室氣體[2］。因此，稻田反硝化作用過程成為人們關注的熱點問題。

水稻田屬于典型的人工濕地生態(tài)系統(tǒng)[3］，土壤生境長期處于淹水厭氧條件下，其中N2O 的產生和稻田的氮素轉化受到反硝化作用影響。稻田氮素的積累、遷移和流失等循環(huán)轉化過程會導致施入稻田中氮肥的流失、氮肥利用率下降，直接或間接地影響稻田生態(tài)系統(tǒng)健康和土壤可持續(xù)發(fā)展等問題。近年來，國內外針對稻田反硝化過程的研究主要在稻田的不同施肥配比[4］、稻田水分調控[5］、稻田根際土壤[6］、反硝化抑制劑[7］、稻蝦共作[8］、秸稈還田[9］及種植綠肥作物[10］等方面，但對不同輪作休耕模式下稻田的特殊生境研究較少。稻田長期大量化肥的投入及土壤高強度連作種植，在短期內會增加糧食的產量，但從長期來看，會產生很多對生態(tài)環(huán)境的不利影響[11］。連作和單一作物種植導致根系分泌的有機酸和酚酸積累、土壤養(yǎng)分枯竭、病原微生物滋生和生物多樣性降低等[12］，最終影響作物生產及土壤環(huán)境的可持續(xù)性發(fā)展。與連作或單一種植模式相比，輪作休耕是改善土壤環(huán)境質量和提高作物生產力的替代模式，在增加作物多樣性的同時儲蓄了土壤養(yǎng)分[13］。因此，輪作休耕農業(yè)管理制度在世界許多國家越來越受歡迎，輪作休耕對稻田土壤反硝化過程的影響值得探索。

本試驗通過研究不同輪作休耕模式下土壤理化性質、土壤反硝化潛勢及土壤反硝化功能基因nirS和nirK 群落結構的變化，分析土壤反硝化功能微生物種群的豐度和群落組成，并明確其變化的重要影響因子及關鍵菌屬，旨在為提高農田生態(tài)系統(tǒng)氮素利用效率提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

于2020 年10 月至2021 年11 月在 江西省鷹潭市余江區(qū)農業(yè)科學研究所試驗田（28°14′8″N，116°51′22″E）進行，該試驗地屬亞熱帶氣候，周年總太陽輻射量為4 542.7 kJ/m2，周年平均日照時長1 852.4 h；周年平均氣溫17.7 ℃，極端最高溫40.5 ℃，極端最低溫5.1 ℃；周年平均降雨量1 796.8 mm；試驗地為泥沙淤土，土質肥沃，偏微酸性。種植前的土壤理化性質為pH 4.28；堿解氮159.6 mg/kg，有效磷31.98 mg/kg，速效鉀26.67 mg/kg，全氮1.86%，有機質36.19 g/kg，NH4+-N 3.73 mg/kg，NO3?-N 8.79 mg/kg，容重2.23 mg/kg，含水率22.56%。

1.2 試驗設計

本研究5 種種植模式，A（CK）為傳統(tǒng)輪作模式，B、C、D為3個多種作物輪作模式，E處理為休耕模式（表1）。每個處理3 次重復，每個小區(qū)面積為66.7 m2，隨機區(qū)組排列，小區(qū)周邊設置同步種植同種品種的水稻保護區(qū)。小區(qū)間的田埂、保護行和環(huán)溝的寬度分別為0.5、1.0 和0.5 m。試驗作物品種：紫云英（余江大葉籽），油菜（華贛油1號），早稻（中早33），晚稻（黃華占），春大豆（滬鮮豆6 號），秋大豆（奎鮮二號），玉米（贛1號），甘蔗（贛紫皮果蔗），甘薯（贛南瓜紅薯）。紫云英播種量約為22.5 kg/hm2，播種時間2020 年10 月，2021 年4 月紫云英在盛花期直接翻壓還田；油菜種植密度約為11.1 萬株/hm2，移栽時間在2020年12月，收獲時間2021年5月；早稻播種量約為45 kg/hm2，移栽時間在2021 年4 月，收獲時間在2021 年7 月；晚稻播種量約為42 kg/hm2，移栽時間在2021年7月，收獲時間在2021年11月；大豆種植密度約為6.7萬株/hm2，春大豆移栽時間在2021 年4 月，收獲期在6 月，秋大豆移栽時間在2021 年6 月，收獲時間在2021 年11 月；玉米播種量為6.7 萬株/hm2，播種時期在2021 年7 月，收獲時間2021 年10 月；甘蔗種植密度約為8 230 株/hm2，移栽時間在2021 年5月，收獲時間在2021 年12 月；甘薯種植密度約為5.6萬株/hm2，移栽時間在2021 年7月，收獲時間在2021年10 月。作物施肥量采用當?shù)亓晳T施肥量，土壤取樣時間為試驗收獲后進行取樣。

表1 試驗設計Table 1 Test design

1.3 土壤理化性質分析

用5點取樣法分別取每小區(qū)0~20 cm耕層土，混合土樣，帶回實驗室自然風干后分析土壤理化性質。用pH 計測定土壤pH，采用重鉻酸鉀法-濃硫酸外加熱法測定有機質，NH4OAc 浸提-火焰光度法測定土壤速效鉀含量，NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤有效磷含量，半微量凱氏法測定土壤全氮，KCl 浸提-靛酚藍比色法測定銨態(tài)氮，紫外分光光度法測定硝態(tài)氮，堿解擴散法測定土壤堿解氮，環(huán)刀法測定土壤容重和土壤含水率。

1.4 土壤反硝化潛勢測定

采用乙炔抑制法測定土壤反硝化潛勢，參照Pell等[14］的方法進行。

1.5 土壤反硝化功能基因測定

從每個小區(qū)隨機挑選5株作物，用無菌勺子刮取其根系表面土壤，裝入50 mL 無菌離心管中，加入液氮，用干冰將土壤樣品運到實驗室于?80 ℃冰箱儲存。再將取好的土樣委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司擴增測序。根據biowest agArose（biowest，E.S.）說明書進行土壤微生物群落總DNA 抽提。nirS基因采用的引物為：cd3aF_R3cdR（5' -GTSAAC?GTSAAGGARACSGG - 3'、5'- AGTTCTGS?GTRGGCTTSAG-3'），nirK基因引物為：F1aCu_R3 Cu（5' - TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA -3'、5' - TCTGGACCTGGTGAGTTTCC - 3'）[15］。擴增條件（PCR 儀：ABI GeneAmp? 9700 型）為：95 ℃預變性3 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共27個循環(huán)；然后在72 ℃延伸10 min；最后于4 ℃保存。PCR 反應體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart Fast?PfuDNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O 補足至20 μL，每個樣本3 個重復。利用Illumina 公司的Illumina Miseq PE300 平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）進行測序。

1.6 數(shù)據分析

根據條形碼的精確匹配，對不同樣品進行nirS、nirK基因配對端讀碼解復，與條形碼序列出現(xiàn)1個或多個錯配，或至少出現(xiàn)2個與引物序列錯配的讀數(shù)被丟棄[16］。然后利用FLASH（fast length adjusting of short reads）將得到的讀數(shù)進行合并，合并后的讀數(shù)至少有10 bp 的重疊區(qū)域[17］。刪除長度超出預期200~500 bp 的序列或含有任何模糊堿基的序列，獲得的干凈讀取數(shù)分別為：421 362和232 177。經過篩選和嵌合體去除后，使用UCLUST 以97%的序列同源性進行de novo操作分類單元（OTU）的篩選[18］。最后，分別獲得nirS和nirK基因OTUs 1 642和1 653。

采用Microsoft Excel 2019 處理數(shù)據；采用SPSS軟件（version18.0，Chicago，Illinois，USA）對土壤理化性質進行方差分析（ANOVA），Duncan’s 法進行多重比較（α=0.05）。采用QIIME（Version 1.9.0）軟件估算nirS、nirK基因的α-多樣性，采用未加權的UniFrac 距離來計算多樣性[19］。采用非度量多維度尺度分析（NMDS）可視化樣本間群落結構的差異[20］。相似性分析（ANOSIM）被用來評估群落結構的相似性和差異性[21］。用群落barplot分析圖來表示不同樣品間nirS、nirK基因的組成[22］。利用Canoco 5.0（Microcoputer Power，Ithaca，NY，USA），采用基于Bray-Curtis 距離的冗余分析（RDA）來解釋環(huán)境因子對反硝化群落的影響。

2 結果與分析

2.1 不同輪作休耕模式下土壤理化性質

如表2 所示，土壤pH、堿解氮、速效磷、速效鉀、NO3?-N 均為A（CK）處理最低（P<0.05），且均為B、C 處理的養(yǎng)分指數(shù)較高。而全氮、有機質、NH4+-N 含量中，A（CK）、B 和E 處理顯著高于其他處理（P<0.05）。土壤化學性質均為B、C 處理更有利于土壤肥力的增加，利于土壤氮含量的積累。在土壤物理性質中，A（CK）處理的土壤容重顯著高于其他處理（P<0.05），分別高出0.81%、0.76%、0.86%、0.90%。E 處理的土壤含水率顯著高于其他處理，其次是A 處理，E 處理顯著高出了32.14%、101.86%、83.58%、780.87%。E 處理能有效降低土壤容重，改善土壤團粒結構，且保水性較好。結果表明，不同輪作休耕模式均能改善土壤肥力和土壤結構，并抑制了土壤氮含量的流失，其中B（紫云英-早稻-玉米||甘薯）、C（油菜-甘蔗||春大豆）和E（休耕）處理效果較好。

表2 不同輪作休耕模式下土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties

2.2 不同輪作休耕模式下土壤反硝化潛勢

由圖1 可見，各處理的土壤反硝化潛勢中A（CK）處理最高，其次是E 處理，C 處理最低。各處理 分 別 低 于A（CK）處 理82.49%、93.23%、89.43%、70.08%。通過Pearson 相關性分析（表3），可知土壤反硝化潛勢與pH 呈極顯負相關（r2=?0.935，P<0.01），而與AP、AK 和NO3?-N呈現(xiàn)顯著負相關，相關系數(shù)分別為r2=?0.992、r2=?0.938 和r2=?0.944（P<0.05）。上述結果表明，除傳統(tǒng)輪作模式A（CK，紫云英-早稻-晚稻）以外，其他輪作休耕模式均減少了氮素的氣態(tài)損失，pH、AP、AK、NO3?-N與土壤反硝化潛勢呈顯著性相關。

表3 土壤反硝化潛勢與理化性質相關性分析Table 3 Correlation analysis between soil denitrification potential and physical chemical properties

圖1 不同輪作休耕模式對土壤反硝化潛勢的影響Fig.1 Effects of different crop rotation-fallow patterns on denitrification potential

2.3 不同輪作休耕模式下土壤nirS 和nirK 基因型微生物的多樣性

由表4可知，土壤反硝化功能基因的α-多樣性指數(shù)受輪作休耕模式影響存在顯著差異（P<0.05）。nirS基因除Simpson 指數(shù)是B 處理最高（0.110 2）以外，其他指數(shù)均為E 處理最高，分別高出A（CK）處理11.73%、64.50%、43.52%。nirK基因α-多樣性指數(shù)各處理間無顯著性差異。

表4 土壤反硝化功能基因α-多樣性Table 4 Study on soil denitrification function gene α-diversity

由圖2 可以看出，在β-多樣性指數(shù)方面，nirS基因除B、C 和D 處理有部分重疊以外，其他處理間無重疊，通過ANOSIM 相似性檢驗β-多樣性指數(shù)，P值為0.013，表明各處理間有顯著差異（P<0.05）。nirK基因中除A（CK）和E處理沒有與其他處理間有重疊以外，各處理均有重疊，進一步進行ANOSIM相似性檢驗，P值為0.015，表明各處理間有顯著性差異（P<0.05）。

圖2 土壤反硝化功能基因nirS（A）和nirK（B）的β-多樣性指數(shù)Fig.2 Study on β-diversity of soil denitrification function gene nirS（A）and nirK（B）

結果表明，不同輪作休耕模式的反硝化功能基因的多樣性指數(shù)有顯著性差異（P<0.05），且nirS基因的多樣性指數(shù)及群落結構受影響程度大于nirK基因，E處理（休耕）更有利于土壤nirS基因α-多樣性指數(shù)的提高，B、C、D 處理的nirS和nirK基因群落結構相似。

2.4 稻田不同輪作休耕模式下土壤nirS 和nirK 基因菌屬相對豐度

屬水平下，各處理的反硝化功能基因的相對豐度具有顯著性差異（P<0.05）。由圖3 可見，不同輪作休耕模式的土壤反硝化基因菌屬具有一致性，但不同處理下菌屬相對豐度不同。nirS基因的優(yōu)勢菌屬 有unclassified_k_norank_d、unclassified_p_Proteo?ba、紅桿菌屬Rhodanobacter。其中B 處理（72.27%）在unclassified_K_norank_d 菌屬相對豐度最高，C（20.21%）和E 處理（21.76%）在unlasified_p_Proteo?ba相對豐度高于其他處理，而D 處理（12.70%）在紅桿菌屬Rhodanobacter豐度最高。nirK基因優(yōu)勢菌屬有unclassified_k_norank_d_Bacteria、norank_d_Bacte?ria、大豆根瘤菌Bradythizobium、unclassified_p_Pro?teobacteria、亞硝化螺菌屬Nitrosospira。D（24.26%，14.70%）和E 處理（18.48%，14.97%）中norank_d__Bacteria和大豆根瘤菌Bradythizobium的相對豐度高于其他處理，B 處理（15.46%，12.12%）的unclassi?fied_p_Proteobacteria和亞硝化螺菌屬Nitrosospira相對豐度高于其他處理。A 處理（55.97%）僅有un?classified_k_norank_d_Bacteria的相對豐度高于其他處理。綜上，不同輪作方式下nirS、nirK 基因在屬水平的相對豐度存在差異（P<0.05），其中B、D、E處理的菌屬相對豐度高于其他處理。

圖3 nirS基因（A）和nirK基因（B）群落組成相對豐度Fig.3 nirS gene（A）and nirK gene（B）community composition abundance

2.5 nirS 和nirK 反硝化功能基因的優(yōu)勢菌屬與土壤反硝化潛勢的相關性

由表5 可知，通過Pearson 相關性分析發(fā)現(xiàn)，nirS基因的優(yōu)勢菌屬與土壤反硝化潛勢無顯著相關性（P>0.05）。nirK基因的大豆根瘤菌Bradythizobi?um和unclassified_p_Proteobacteria是影響土壤反硝化潛勢的關鍵菌屬（P<0.05），其中大豆根瘤菌Bra?dythizobium與土壤反硝化潛勢呈現(xiàn)負相關性（r2=?0.85，P<0.05），unclassified_p_Proteobacteria與土壤反硝化潛勢呈現(xiàn)正相關性，（r2=0.88，P<0.05）。

表5 土壤反硝化潛勢與優(yōu)勢菌屬相關性分析Table 5 Correlation analysis of soil denitrification poten?tial and dominant bacterial genus

2.6 nirS 和nirK 反硝化功能基因細菌群落結構與土壤理化性質的相關性

基于RDA 分析，采用Bray-Curtis 距離冗余度分析對群落組成排序的環(huán)境變量進行分析（圖4），結果顯示，反硝化功能基因的群落結構與土壤理化性質之間有顯著相關性（P<0.05），SWC 是影響nirS、nirK基因群落結構的重要影響因子，相較于其他土壤理化性質，SWC 的貢獻度較高，顯著性影響較大。不同輪作休耕模式下，SWC 是土壤反硝化功能基因群落結構的重要關鍵因子，水田轉旱作的種植模式改變了稻田土壤的含水率，從而影響了土壤反硝化功能基因群落結構。

圖4 土壤反硝化基因nirS（A）、nirK（B）群落與土壤環(huán)境因子的相關性Fig.4 Correlation analysis of soil denitrification gene nirS（A），nirK（B）communities with soil environmental factors

3 討 論

本研究探討了不同輪作休耕模式下土壤反硝化潛勢和反硝化功能微生物（nirS/nirK）群落的多樣性和組成，結果表明，不同輪作休耕處理改變了土壤肥力及土壤結構，土壤反硝化潛勢及反硝化功能基因群落結構均受到顯著性影響。傳統(tǒng)輪作模式A（CK）（紫云英-早稻-晚稻）對土壤綜合肥力及土壤結構的改善較為緩慢，土壤反硝化潛勢也較大，使得土壤氮素氣態(tài)損失嚴重。稻田適當采用水旱輪作和休耕模式可以通過不同作物相互作用及土壤生境的改變，增加nirK和nirS功能基因的物種多樣性及菌屬的相對豐度，不僅有利于土壤環(huán)境質量的提高，還促進了稻田土壤氮素循環(huán)的可持續(xù)發(fā)展。

3.1 稻田不同種植模式下土壤反硝化潛勢及土壤理化性質相關性

5 種稻田輪作模式下土壤反硝化潛勢存在顯著差異，pH、AP、AK 和NO3?-N 是影響土壤反硝化潛勢的關鍵因子。含水量較高的A（CK）（紫云英-早稻-晚稻）處理反硝化潛勢較強，可能由于長期淹水條件導致土壤容易酸化，土壤結構不良，加快了土壤氮的流失。研究表明，稻田土壤淹水上層（氧化層）中的氮在硝化細菌的作用下轉化為硝態(tài)氮，而NO3?-N不能被土壤膠粒所吸附，隨水滲漏于下邊的土壤層，逐漸在反硝化細菌作用下還原成水稻難以吸收利用的氣體逸失于大氣中，土壤反硝化潛勢增強[23］。其他輪作休耕模式的反硝化潛勢較低，原因可能是土壤環(huán)境由厭氧變成好氧，改善了土壤結構，有利于土壤養(yǎng)分的吸收，有效阻止土壤次生潛育化和酸化。Shcherbak 等[24］研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH 增加有效抑制了N2O 的排放，降低了反硝化潛勢。陳盟[25］研究表明，當土壤含水量稍高時，形成低氧或厭氧條件，土壤中N2O 的排放主要是受土壤的反硝化過程所主導。C處理（油菜-甘蔗||春大豆）的N2O 釋放量和反硝化潛勢最低，原因可能是大豆作為養(yǎng)地作物有效減少了甘蔗施肥量，從而減少蔗田土壤N2O 的釋放量和反硝化潛勢。這與龍鵬宇等[26］的研究結果相似，他們認為合理的滴灌施肥措施能有效提高甘蔗產量且減少土壤N2O 的排放。邢肖毅等[27］也發(fā)現(xiàn)pH 是影響土壤反硝化作用的最重要因素，認為較低的pH 會限制土壤反硝化微生物的生長。綜上，稻田長期淹水下NO3?-N 不容易被土壤膠粒所吸附，并還原成水稻難以吸收的氣體，導致N2O 大量排放、土壤結構遭到破壞、土壤養(yǎng)分降低、土壤酸化，加快了土壤反硝化的作用。

3.2 不同稻田種植模式下土壤nirS 和nirK 基因群落結構

本試驗中稻田不同輪作休耕模式對nirS 基因群落結構的影響大于nirK 基因，可能是試驗年限較短，nirK 基因不敏感，不容易受短時間環(huán)境的改變所影響。朱杰等[8］發(fā)現(xiàn)由于稻蝦種植年限較短，nirK 基因微生物多樣性指數(shù)無顯著性差異。盡管nirK 和nirS 行使的功能相同，但nirK 的豐度與磷或鉀的供應量有關，而nirS 的豐度由氮的供應量決定[28］。謝婉玉等[29］研究表明秸稈還田處理提供了提供氮底物，對nirS 基因豐度有顯著影響，對nirK 基因豐度沒有顯著影響。本研究除E 處理（休耕）外均種植豆科作物，豆科作物可固氮，所以nirS 基因的物種多樣性出現(xiàn)顯著性差異。試驗中E 處理更有利于土壤nirS基因α-多樣性指數(shù)的提高，其原因可能是休耕處理的土壤容重較低，保水性較好，土壤養(yǎng)分不易流失。在本研究中，種植豆科綠肥作物及施肥處理nirS、nirK 功能基因豐度均有顯著性差異。本研究中unla?sified_p_Proteoba 是nirS 和nirK 型反硝化細菌的共同優(yōu)勢菌屬，這與Snaidr 等[30］對土壤反硝化微生物的研究結果吻合。nirS、nirK 功能基因中的各菌屬豐度均為B 處理（紫云英-早稻-玉米||甘薯）較高，主要是unclassified_k_norank_d、unclassified_p_Proteobac?teria、亞硝化螺菌屬Nitrosospira 菌屬的豐度較高，可能由于該處理作物類型多且采用了水旱輪作模式，使得根系分泌物及作物的凋落物增加，相應增加了細菌相對豐度。D處理（紫云英-春大豆-秋大豆）和E處理（休耕）紅桿菌屬Rhodanobacter 和大豆根瘤菌Bradythizobium 相對豐度較高，且只有D處理中有博斯氏菌屬（Bosea），可能由于該模式有養(yǎng)地作用（種植豆科作物和休耕），所以增加了有益菌屬的豐度。衷煒華等[31］研究也表明，紅桿菌喜光合好氧細菌，所以，紅桿菌屬Rhodanobacter 在旱地種植模式中相對豐度較高。

通過Pearson 相關性分析發(fā)現(xiàn)，大豆根瘤菌Bra?dythizobium 和unclassified_p_Proteobacteria 是 影 響土壤反硝化潛勢的關鍵菌屬（P<0.05），其中大豆根瘤菌Bradythizobium 與土壤反硝化潛勢呈現(xiàn)負相關，unclassified_p_Proteobacteria 與土壤反硝化潛勢呈正相關，原因可能是大豆根瘤菌Bradythizobium能夠固氮，可以減少土壤中的氮素損失。程玉柱等[32］研究表明禾本科作物可以利用豆科作物所固定的氮素，促進對氮素的吸收。unclassified_p_Proteo?bacteria 屬于變形菌綱，有研究表明反硝化菌主要為原核生物，大量存在于在α-，β-和y-變形菌綱中[23］。冗余度分析表明，影響土壤反硝化功能基因群落結構的重要關鍵因子是土壤含水率，水田轉旱作或者休耕的種植模式改變了稻田土壤生境，土壤水分減少，對土壤反硝化功能基因群落結產生了影響，周維[33］研究也證實土壤水分對反硝化微生物群落組成的影響最大且最敏感。