大口黑鱸彈狀病毒的分離與鑒定

章文言，張玉軍，李陳，石和榮，劉學(xué)芹

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/湖北省水生動物病害防控工程技術(shù)研究中心，武漢 430070；2.東莞市銀華生物科技有限公司，東莞 523000

大口黑鱸（Micropterus salmoides），又名加州鱸，是北美洲重要的游釣性魚類，于1983 年被引進(jìn)中國廣東[1］。大口黑鱸作為一種優(yōu)質(zhì)的淡水魚，具有肉質(zhì)細(xì)膩、蛋白質(zhì)含量高、繁殖周期短、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)[2］，現(xiàn)已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一。根據(jù)《2021 中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，大口黑鱸的養(yǎng)殖產(chǎn)量在中國水產(chǎn)養(yǎng)殖市場中逐年攀升。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，大口黑鱸病毒病、細(xì)菌病、真菌病、寄生蟲病等一系列病害[3-5］日益嚴(yán)重，尤其病毒病因傳染快、病程短、死亡率高，防控難度大，且無有效的治療手段等[6］，嚴(yán)重危害大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來由彈狀病毒（micropterus salmoides rhabdovirus，MS?RV）引起的大口黑鱸死亡事件時有發(fā)生，其高傳染性可導(dǎo)致大量幼魚死亡[7］，死亡率最高可達(dá)90%[8］。

2021 年廣東省韶關(guān)市某大口黑鱸養(yǎng)殖場出現(xiàn)大口黑鱸幼魚大量死亡的現(xiàn)象?；疾〉拇罂诤邝|主要表現(xiàn)為體色發(fā)白、身體失衡、螺旋打轉(zhuǎn)、聚游水面。為了弄清病因，本研究對患病大口黑鱸進(jìn)行臨床觀察，從細(xì)菌學(xué)、寄生蟲學(xué)、病毒學(xué)三方面進(jìn)行了檢測，并通過分子生物學(xué)分析、透射電鏡觀察等方法，鑒定其病原為大口黑鱸彈狀病毒，命名為大口黑鱸彈狀病毒韶關(guān)株（MSRV-SG01）?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病料和試驗(yàn)動物

病魚來源于廣東韶關(guān)某大口黑鱸養(yǎng)殖場。試驗(yàn)用魚購自廣東佛山某大口黑鱸魚種繁育場，魚體質(zhì)量為（0.5±0.1）g，體長為（3±0.5）cm。試驗(yàn)開始前，隨機(jī)抽取3 尾魚進(jìn)行RT-PCR 檢測，確定無病毒攜帶后，暫養(yǎng)2 周，每天早晚各投喂1 次，利用加熱棒將水溫控制在26 ℃左右，使用增氧裝置將溶氧控制在5 mg/L左右。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

鯉上皮瘤細(xì)胞（epithelioma papillosum cyprini cells，EPC）、胖頭鱥肌肉細(xì)胞（fathead minnow mus?cle cells，F(xiàn)HM）、斑點(diǎn)叉尾鮰卵巢細(xì)胞系（channel catfish ovary cells，CCO）細(xì)胞來源于筆者所在實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫；石斑魚脾臟細(xì)胞（grouper spleen cells，GS）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)秦啟偉教授惠贈；總DNA 提取試劑盒、Trizol 和凝膠小量DNA 膠回收試劑盒購自Magen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ABclonal；M199細(xì)胞培養(yǎng)基購自Cytiva；胎牛血清、0.25%EDTANa2的胰酶購自Hyclone；PBS 緩 沖 液購 自Bio-Channel；2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR Mix、DNA Marker、核酸染料和瓊脂糖購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 細(xì)菌及寄生蟲檢測

取病魚體表黏液制備涂片和壓片，在光學(xué)顯微鏡下觀察有無寄生蟲感染。隨機(jī)取3 尾病魚用酒精棉擦拭魚體后，在無菌條件下整尾魚勻漿，PBS 稀釋后1 000 r/min 離心2 min 去沉淀，LB 平板上劃線培養(yǎng)24 h后，觀察菌落的生長狀況。

1.4 病毒檢測

隨機(jī)取4尾病魚用酒精棉球擦拭魚體后，在無菌條件下整尾魚勻漿，加入300 μL 無菌PBS 緩沖液稀釋后平均分成3 份，1 份凍存于?80 ℃用于后續(xù)病毒的分離鑒定，另外2 份用于魚類病毒檢測。將2 份中的1 份置于Trizol 中提取總RNA，另1 份用DNA試劑盒提取DNA，采用特異性引物進(jìn)行PCR 檢測（引物信息見表1），PCR 反應(yīng)體系為25 μL：模板3 μL；上下游引物各1 μL；2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR Mix 12.5 μL；ddH2O 7.5 μL。RT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃3 min；94 ℃25 s；55 ℃25 s；72 ℃15 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收送至公司測序，測序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行Blast 分析，進(jìn)一步確定分離到的病毒。引物合成及測序由武漢擎科有限公司完成。

表1 引物堿基序列Table 1 Nucleotide sequences of primers

1.5 病毒細(xì)胞培養(yǎng)

從?80 ℃冰箱取出病料勻漿液，無菌條件下取20 μL，用無菌PBS 緩沖液將勻漿液稀釋10 倍，然后取20 μL 稀釋后的勻漿液加到5 mL 無血清M199 培養(yǎng)液中，存于?80 ℃冰箱反復(fù)凍融3 次，充分裂解釋放病毒。4 ℃條件下將凍融后的勻漿液1 000 r/min離心10 min 去除組織碎片，再經(jīng)0.22 μm 微孔過濾器除菌后，分別接種于已長滿單層的EPC、FHM、CCO、GS 細(xì)胞，28 ℃孵育吸附1 h后更換成相應(yīng)的細(xì)胞維持培養(yǎng)基，并設(shè)置未接毒陰性對照，每天觀察細(xì)胞病理變化，并拍照記錄。待90%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時，收集上清及細(xì)胞，反復(fù)凍融3 次，1 000 r/min離心10 min，然后將病毒懸液繼續(xù)接種細(xì)胞，傳代3次。

1.6 病毒滴度測定及生長動力學(xué)曲線的繪制

以無血清M199 培養(yǎng)基10 倍梯度稀釋病毒（10?2~10?5），接種到鋪滿單層EPC 細(xì)胞的12 孔板中，每孔500 μL，在28 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，吸棄病毒液，每孔加入1 mL 含5% FBS 的DMEM-CMC 半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 h 后進(jìn)行固定、染色處理及空斑計(jì)數(shù)。取病毒懸液，用無血清M199 培養(yǎng)基稀釋后，分別以0.1 MOI（感染復(fù)數(shù)：multiplicity of infection，MOI）和0.01 MOI 的病毒液接種單層EPC 細(xì)胞密度90%的12 孔板，1 h 后換成5%FBS 的細(xì)胞維持培養(yǎng)基。分別在感染后的6、12、24、36、48 h 取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用空斑試驗(yàn)測定各時間點(diǎn)病毒滴度，并利用GraphPad Prism 8.0繪制病毒生長動力學(xué)曲線。

1.7 病毒電鏡樣品的制備

取1 瓶單層細(xì)胞密度90%的EPC 細(xì)胞，于無菌環(huán)境下加入5 mL 的病毒懸液，28 ℃吸附1 h，然后更換含5%FBS 的M199 維持培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)15 h 后吸棄維持液，將細(xì)胞用無菌PBS洗滌1次，棄之，再加入1 mL 胰酶消化30 s，用槍頭把細(xì)胞吹下來，轉(zhuǎn)移至2 mL無菌EP管中，1 000 r/min離心3 min（細(xì)胞團(tuán)綠豆大?。壣锨?，緩慢加入1 mL 常溫戊二醛（2.5%），將細(xì)胞團(tuán)輕輕挑起，懸浮于固定液中，先室溫避光固定30 min，再轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱保存，交于武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行包埋、制片、拍照。

1.8 人工感染試驗(yàn)

將試驗(yàn)魚隨機(jī)分為A、B、C 3 組，每組30 尾魚。A、B 組分別腹腔注射10 μL 的105PFU/mL、106PFU/mL 的病毒液，C 組注射等量無血清M199 培養(yǎng)基作為陰性對照，每天觀察魚體死亡情況并記錄。

1.9 組織病理學(xué)觀察

分別取攻毒魚的肝、脾、腸組織，4%多聚甲醛固定24 h，各組織分別經(jīng)70%、80%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋切片（5~7 μm）、H&E染色，最后在顯微鏡下觀察、拍照。

1.1 0 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用設(shè)計(jì)的覆蓋MSRV-G基因全長序列的保守性引物對MSRV-F/MSRV-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收送至武漢擎科有限公司測序，在NCBI 將測序結(jié)果進(jìn)行Blast 分析。在GenBank 中下載常見的幾種彈狀病毒G 蛋白氨基酸序列，利用MEGA7.0 軟件繪制該毒株與大口黑鱸彈狀病毒（MSRV-FJ985；GenBank：MT818233.1、MSRV-YH01；GenBank：mk397811.2）、鱖彈狀病毒（Sinipercachuatsirhabdovirus， SCRV； GenBank：NC_008514.1）、水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis Indiana virus，VSV；GenBank：MW373779）、梭子魚苗彈狀病毒（pike fry rhabdovirus，PFRV；GenBank：NC_025356.1）、鯉春病毒血癥病毒（spring viremia of carp virus，SVCV；GenBank：AJ318079.1）、牙鲆彈狀 病 毒（hirame rhabdovirus，HIRRV；GenBank：AF104985.2）、傳染性造血器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus， IHNV； GenBank：X89213.1）、烏鱧彈狀病毒（snakehead rhabdovirus，SHRV；GenBank：NC_000903.1）、病毒性出血性敗血 癥 病 毒（viral hemorrhagic septicemia，VHSV；GenBank：KP866927.1）的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病魚的臨床觀察

自然發(fā)病魚池的水溫為26 ℃，病魚全長0.8~1.0 cm，發(fā)病前期在水面聚集、停止攝食，發(fā)病后期身體失衡、螺旋打轉(zhuǎn)、并出現(xiàn)死亡。健康大口黑鱸幼魚背部為青灰色、腹部灰白色（圖1A），而發(fā)病大口黑鱸體色發(fā)白（圖1B）。

圖1 患病魚的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of diseased fish

2.2 病原檢測結(jié)果

取組織勻漿液劃線分離未見致病菌，體表黏液在顯微鏡下未觀察到寄生蟲。通過幾種特異性檢測引 物 對MSRV-F1/MSRV-R1、ISKNV-F/ISKNVR、LMBV-F/LMBV-R、NNV-F/NNV-R 對病料進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果如圖2所示，針對MSRV 的檢測引物擴(kuò)增出1條大小約為217 bp的特異性條帶，其他檢測引物均未擴(kuò)增出條帶。

圖2 不同魚類病毒的RT-PCR檢測的結(jié)果Fig.2 Results of RT-PCR detection of different fish viruses

2.3 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

將無菌處理后的病料懸液分別接種EPC、FHM、CCO、GS細(xì)胞，24 h后進(jìn)行拍照觀察。結(jié)果顯示EPC、FHM、CCO 均出現(xiàn)不同程度的病變（箭頭指示），主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、聚團(tuán)，病變嚴(yán)重部位大面積死亡并脫落，陰性對照組細(xì)胞表現(xiàn)正常。MSRV 對這3 種細(xì)胞的敏感度從高到低依次為：EPC>FHM>CCO，而接毒后的GS 細(xì)胞與陰性對照組相比無明顯差異，表明MSRV 對該細(xì)胞不敏感（圖3）。

圖3 病料接種不同細(xì)胞系24 h后的病變結(jié)果（40×）Fig.3 Lesion results after 24 hours of inoculation with different cell lines（40×）

2.4 病毒滴度及生長曲線測定結(jié)果

病毒在EPC 細(xì)胞上最敏感，后續(xù)將病毒在EPC 細(xì)胞上盲傳3 代，收取接毒24 h 的上清進(jìn)行病毒效價(jià)測定，空斑測定結(jié)果顯示，病毒效價(jià)為106.5PFU/mL。生長動力學(xué)曲線顯示該毒株在0.01 MOI 和0.1 MOI 感染劑量下的增殖曲線總體趨勢一致：6~24 h，病毒快速復(fù)制、增殖，進(jìn)入對數(shù)生長期；24~48 h，病毒增殖緩慢，進(jìn)入平臺期，滴度相差不大，在36 h的滴度相對最高（圖4）。

圖4 病毒在EPC細(xì)胞中的生長動力學(xué)曲線Fig.4 Growth kinetics of virus in EPC cells

2.5 病毒粒子形態(tài)

用2.5%戊二醛固定接毒15 h的EPC 細(xì)胞，然后在HITACHI HT7700 透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大量具有子彈狀特征的病毒粒子，病毒縱切面呈現(xiàn)圓形或橢圓形，長度為120~170 nm，直徑為50~65 nm（圖5）。

圖5 透射電鏡下觀察病變細(xì)胞中的病毒粒子的形態(tài)大小Fig.5 Observation of the shape and size of virus particles in diseased cells under a transmission electron microscope

2.6 回感試驗(yàn)結(jié)果

攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，A 組、B 組大口黑鱸均于接毒后的第2 天開始死亡。攻毒后第3 天，觀察到攻毒組大部分試驗(yàn)魚游動緩慢、浮游池邊，有個體出現(xiàn)身體失衡、打轉(zhuǎn)、身體彎曲的現(xiàn)象。肉眼觀察，對照組（C 組）試驗(yàn)魚體表完整，健康有光澤（圖6A），攻毒組試驗(yàn)魚表現(xiàn)為身體彎曲、體表出血（圖6B）、拖便（圖6C）、爛尾（圖6C、D）等臨床癥狀，解剖后可以看到病魚肝、脾器官腫大發(fā)紅（圖6D）。A 組在第5 天達(dá)到死亡高峰期，B 組的死亡高峰期為第2 天和第3 天。7 d 后，A、B 組試驗(yàn)魚全部死亡，死亡率100%，而注射M199 的對照組魚并未出現(xiàn)死亡（圖7）。

圖6 人工感染后大口黑鱸的臨床癥狀Fig.6 Clinical symptoms of Micropterus salmoides after artificial infection

圖7 攻毒模型生存曲線Fig.7 The survival curve of the challenge model

2.7 病理組織切片觀察

H&E 染色結(jié)果顯示，與對照組（圖8A）相比，病魚的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀壞死、細(xì)胞邊界模糊，連成一片、胞漿空泡化嚴(yán)重（圖8B，箭頭指示）。與對照組（圖8C）相比，病魚脾淋巴組織疏散，含鐵血黃素大量沉積（圖8D，箭頭指示）。與健康大口黑鱸的腸組織（圖8E）相比，患病大口黑鱸的腸組織（圖8F）沒有明顯的病理變化。

圖8 MSRV感染大口黑鱸的組織病理變化Fig.8 Histopathological changes of MSRV-infected Micropterus salmoides

2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

以接種病毒懸液24 h 的EPC 細(xì)胞為樣品，經(jīng)RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄后得到模板cDNA，采用特異性引物MSRV-F/MSRV-R 擴(kuò)增G 基因全長序列，得到1 條與預(yù)期結(jié)果一致的大約位于1 500 bp 的特異性條帶，測序結(jié)果顯示，G 基因ORF 為1 541 bp。通過Blast 比對MSRV-SG01 與其他彈狀病毒的同源性，發(fā) 現(xiàn)MSRV-SG01 與MSRV-FJ985、MSRVYH01 這2 株大口黑鱸彈狀病毒的核苷酸同源性分別為99.36%、98.19%，氨基酸同源性分別為99%、97%。利用MEGA7.0 聚類分析MSRV-SG01 G 蛋白氨基酸序列與MSRV-FJ985、MSRV-YH01、SCRV、VSV、PFRV、SVCV、HIRRV、IHNV、SHRV、VHSV 的G 蛋白氨基酸序列，結(jié)果顯示MS?RV-SG01 毒 株 與 MSRV-FJ985、MSRV-YH01、SCRV 聚為同一分支，并與MSRV-FJ985 毒株的親緣關(guān)系最近，但與諾拉彈狀病毒屬的VHSV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖9）。確定分離得到1 株大口黑鱸彈狀病毒，根據(jù)病料來源地，將該毒株命名為MSRV-SG01。

圖9 MSRV-SG01 G蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of MSRV-SG01 G protein amino acid sequence

3 討 論

彈狀病毒（rhabdovirus）是單股負(fù)鏈RNA 病毒，基因組大小為10.08~16.1 kb[9］，宿主廣泛，哺乳動物、鳥類、爬行動物、植物和魚類等均可被感染。作為全球野生及養(yǎng)殖魚類的重要病原體，彈狀病毒嚴(yán)重危害魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10］。MSRV 與大多數(shù)水生彈狀病毒不同，其具有年齡特異性，主要危害2~4 cm 的幼魚，在25~28 ℃水溫條件下，致死率較高[11-12］。MSRV 與大多數(shù)魚類彈狀病毒的基因組大小、蛋白結(jié)構(gòu)相似，全基因組長度為11 kb 左右，主要編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和聚合酶（L）5 種結(jié)構(gòu)蛋白[11，14］。

根據(jù)以往的研究報(bào)道，自然感染MSRV 的大口黑鱸體長為2.5~4.5 cm[11-12］，而本研究采集的患病大口黑鱸為全長0.8~1.0 cm 的幼魚，規(guī)格相對較小。由于患病大口黑鱸攜帶卵黃囊，并未從外界攝入營養(yǎng)，推測MSRV 極有可能是通過垂直傳播途徑由親魚傳播給苗種。在魚類養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水體污染而導(dǎo)致的病毒感染也有報(bào)道[14］，不排除幼魚也有可能通過受病毒污染的水體而被感染。

本研究發(fā)現(xiàn)MSRV-SG01 毒株對EPC、FHM、CCO 均敏感，都可以產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變現(xiàn)象，該毒株能在不同科的魚類細(xì)胞中復(fù)制，說明其具有較強(qiáng)的感染性[15］，這提示我們在MSRV 的防控中要注意病毒的種間傳播，避免造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。將接毒后病變的EPC 細(xì)胞制作成超薄切片，在透射電鏡下觀察到大量具有子彈狀特征的病毒粒子，長度為120~170 nm，直徑為50~65 nm，與SCRV（長76~18 nm，寬29~52 nm）相比要大一些[16］，但是比諾拉彈狀病毒屬的SHRV（180~200 nm，60~80 nm）要小一些[17］。已有研究表明，浸泡和腹腔注射2 種方式均能夠使大口黑鱸幼魚感染MSRV[7］。本試驗(yàn)采用腹腔注射的方式感染幼魚，7 d 內(nèi)死亡率達(dá)100%，顯示該毒株具有較強(qiáng)毒力，已有研究建立的大口黑鱸彈狀病毒攻毒模型死亡率為20%~80%，人工感染死亡率的差異性，可能主要與攻毒劑量有關(guān)[7，18-19］。人工感染大口黑鱸后，病魚2 d 內(nèi)出現(xiàn)死亡，呈出血、魚體彎曲，不規(guī)則狀游泳、爛尾、拖便等臨床癥狀，這符合大口黑鱸彈狀病毒感染病例[8］。組織病理切片結(jié)果顯示，患病大口黑鱸的肝組織大量壞死，肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，脾淋巴組織呈彌散性壞死，含鐵血黃素大量沉積，與病變癥狀一致，為本研究結(jié)果提供了更加有力的證據(jù)。

為進(jìn)一步確定MSRV-SG01 毒株的分類地位，本研究在GenBank 中下載了MSRV-FJ985、MSRV

YH01、SCRV、VSV、PFRV、SVCV、HIRRV、IH?NV、SHRV、VHSV 這幾種常見彈狀病毒的G 蛋白氨基酸序列。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，本試驗(yàn)分離得到 的MSRV-SG01 毒 株 與MSRV-FJ985、MSRVYH01、SCRV 聚為一類，且與已報(bào)道的MSRVFJ985 毒株、MSRV-YH01 毒株的核苷酸同源性分別高達(dá)99.36%、98.19%，氨基酸同源性分別高達(dá)99%、97%，同源性較高，但仍具有一定差異，這可能是MSRV-SG01 毒株在本研究建立的攻毒模型中導(dǎo)致較高死亡率的原因之一。

綜上，本研究從攜帶卵黃囊的大口黑鱸幼魚上分離出1 株MSRV-SG01 毒株，可為MSRV 的垂直傳播提供參考依據(jù)，建議從源頭防控水生動物疾病，以促進(jìn)大口黑鱸的健康養(yǎng)殖。