低蛋白飼料添加蛋氨酸和賴氨酸對大口黑鱸生長性能和抗氧化能力的影響

桂聰，鄧琦琦，楊慧君，莫愛杰，沈志剛，袁勇超，2

1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070；2.長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心/湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，武漢 430070

近年來，氮排放引發(fā)的水環(huán)境污染隨水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模和集約化程度的不斷擴大而日趨嚴重。水產(chǎn)養(yǎng)殖對象對飼料蛋白質(zhì)的高效利用是充分發(fā)揮生長性能并降低氮排放的關(guān)鍵。降低日糧中蛋白水平不僅可以降低成本，還可以提高飼料中蛋白質(zhì)利用效率以及降低氨氮排放[1］，但是隨著飼料中蛋白質(zhì)含量的降低，會引起氨基酸比例失調(diào)等情況，從而影響?zhàn)B殖對象正常生長[2］。因此，在不影響?zhàn)B殖魚類正常生長的基礎(chǔ)上，降低飼料蛋白水平、提高蛋白質(zhì)的利用、減少氨氮排放等問題已成為熱門話題。功能性氨基酸對改善低蛋白日糧的適口性和提高低蛋白日糧的采食量以及耐受性尤為重要。在降低飼料蛋白水平或魚粉替代的基礎(chǔ)上添加功能性氨基酸如限制性氨基酸[3］賴氨酸和蛋氨酸能維持魚類的生長性能[4］、提高魚類對低蛋白日糧蛋白質(zhì)的利用效率[5］。如在低蛋白飼料中補充必需氨基酸不僅能促進大口黑鱸（Micropterus salmoides）[1］和 虹 鱒（Oncorhynchus mykiss）[6］的生長，而且對草魚（Ctenopharyngodon idella）幼魚飼料系數(shù)、攝食率、體成分沒有顯著性影響[7］。

大口黑鱸（Micropterus salmoides）屬于典型的肉食性魚類，對飼料中蛋白水平要求較高，其蛋白最適需求量的問題仍存在爭議，提高飼料中蛋白水平能有效促進大口黑鱸生長，但會出現(xiàn)蛋白質(zhì)利用效率下降的現(xiàn)象[8］，容易造成浪費、增加成本。而低蛋白飼料會造成大口黑鱸的生長性能顯著性降低以及免疫力下降[9］。因此，本試驗研究低蛋白飼料中添加必需氨基酸對大口黑鱸幼魚生長、生產(chǎn)性能及其抗氧化能力的影響，旨在為大口黑鱸優(yōu)質(zhì)配合飼料的研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配制

飼料原料由武漢澳華科技有限公司提供，試驗飼料配方如表1所示。其中維生素預混料組成成分：維生素A 16 000 IU/kg；維生素D38 000 IU/kg；其他成分（mg/kg）：維生素B117.60；維生素B248.00；維生素B630.00；維生素B120.25；維生素E 156；維生素C 800；維生素K314.70；煙酸胺79.00；泛酸鈣73.50；葉酸6.50；生物素0.64。礦物質(zhì)預混料組 成 成 分（mg/kg）：鎂（MgSO4·H2O）52.50；鋅（ZnSO4·5H2O）34.40；銅（CuSO4·5H2O）2.10；錳（MnSO4·75H2O）6.10；碘（Ca（IO3）2）1.60；鐵（FeSO4·7H2O）21.10；硒（Na2SeO3）0.19；鈷（CoCl2·5H2O）0.24。設(shè)置46%（對照）、41%（LP1）和36%（LP2）3 個飼料蛋白質(zhì)梯度。在41%和36%蛋白飼料的基礎(chǔ)上補充相應(yīng)的晶體賴氨酸與蛋氨酸，使賴氨酸與蛋氨酸的含量與對照組中含量保持一致，分別記作LP1+AA 和LP2+AA 組。依據(jù)飼料配方表準確稱取各組飼料原料過0.425 mm孔徑篩網(wǎng)后充分混勻，加入蒸餾水約300 g/kg，通過球團機（霍巴特混合機，型號A200），將其壓制成3 mm 直徑的顆粒飼料，45 ℃烘干，封于自封袋并于?20 ℃冰箱中保存。

表1 各組飼料配方及營養(yǎng)成分（風干質(zhì)量）Table 1 Feed formula and nutrients in different group（air dry basis）

1.2 養(yǎng)殖試驗

規(guī)格相近、健康無病的大口黑鱸500尾選購自湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司，于華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地塑料養(yǎng)殖桶（直徑120 cm，高130 cm）中進行養(yǎng)殖，試驗過程中養(yǎng)殖桶是靜水模式，每次喂食前使用虹吸管清理糞便、殘餌等污染物，換水40%~50%，維持良好的養(yǎng)殖水質(zhì)。暫養(yǎng)2 周后，從中隨機選取450 尾初始體質(zhì)量（31.52±0.62）g 的試驗魚，每個養(yǎng)殖桶放30 尾，每組飼料設(shè)置3 個重復。于每天08：00 和18：00 投喂幼魚體質(zhì)量3%~6%的試驗飼料。試驗過程保持曝氣，水溫維持在25~28 ℃，氨氮為（0.25±0.12）mg/L，pH 為7.2±0.2，飼養(yǎng)試驗為期8周。

1.3 樣品采集及分析

養(yǎng)殖周期結(jié)束后停喂24 h，取出所有試驗魚，使用MS-222 溶液麻醉，記錄大口黑鱸的終末體質(zhì)量、存活數(shù)量以及體長等數(shù)據(jù)。每個試驗組隨機選取3尾作為全魚樣品放入?80 ℃冰箱冷凍保存，每個養(yǎng)殖桶挑選3 尾試驗魚無菌操作下尾靜脈采血后分離內(nèi)臟和肝臟并稱質(zhì)量計算形體學指標，其余試驗魚采取肝臟、肌肉組織及血樣，血樣經(jīng)過離心，分離出血清，放入?80 ℃冰箱保存用于常規(guī)營養(yǎng)成分、抗氧化酶及轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測。

1.4 測定指標與計算方法

1）測定指標。試驗結(jié)束對大口黑鱸增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、飼料系數(shù)（FCR）、存活率（SR）、臟體比（VSI）、肝體比（HIS）、肥滿度（CF）、蛋白質(zhì)保留率（PR）、攝食量（FI）等指標進行測定，具體的計算公式參考陳乃松等[1］的方法。

2）測定方法。全魚和肌肉中的水分測定采用105 ℃烘干法；樣品中粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法；粗脂肪測定方式使用索氏抽提法，粗灰分測定采用馬弗爐550 ℃高溫灼燒法；飼料總能量的測定采用氧彈法；飼料中賴氨酸和蛋氨酸的含量用氨基酸自動分析儀（Hitachi，Model 835-50，Hitachi，Tokyo，Ja?pan）分析。使用南京建成生物工程研究所的檢測試劑盒對血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性（C010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性（C009-2-1）、超氧化物歧化酶（SOD）活性（A001-3）、過氧化氫酶（CAT）活性（A007-1-1）、總抗氧化能力（T-AOC）（A015-2-1）、丙二醛（MDA）含量（A003-1）、活性氧（ROS）水平（E004-1）進行測定。樣品的前期處理以及測定方法參照試劑盒說明書，大口黑鱸肝臟和血清轉(zhuǎn)氨酶和抗氧化指標測定之前選取一定量的肝臟組織，加入預冷生理鹽水以體積1∶9 制成勻漿，在4 ℃下3 000 r/min離心機進行離心10 min，取離心后上層清液，按一定比例稀釋后用于后續(xù)轉(zhuǎn)氨酶和抗氧化指標活性分析。

1.5 試驗數(shù)據(jù)處理

按照指標的公式對所得的數(shù)據(jù)進行運算整理，使用SPSS Statistics 25 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），差異顯著性分析用Duncan’s法進行多重比較，顯著性水平α=0.05，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低蛋白飼料添加賴氨酸與蛋氨酸對大口黑鱸生長性能的影響

由表2 可知，LP1+AA 組大口黑鱸的FBW、WGR、SGR、FCR 和PR 與對照組之間不存在顯著差異（P>0.05）；其他各組的FBW、WGR 和SGR 與對照組相比均顯著性降低，F(xiàn)CR和PR顯著性升高（P<0.05）。添加賴氨酸與蛋氨酸的LP1+AA 和LP2+AA 組較未添加氨基酸的LP1 和LP2 組的FBW、WGR、SGR 有一定的升高，F(xiàn)CR 和PR 相對降低，低蛋白飼料組大口黑鱸的FI 均低于對照組，添加賴氨酸與蛋氨酸的試驗組與未添加的處理組相比有所升高，但均無顯著性差異（P>0.05）。各組大口黑鱸的SR均為100%（P>0.05）。

表2 低蛋白飼料中添加賴氨酸與蛋氨酸后大口黑鱸生長性能的變化（n=3）Table 2 Changes of growth performance of largemouth bass supplemented with lysine and methionine in low protein diet（n=3）

2.2 低蛋白飼料添加賴氨酸與蛋氨酸對大口黑鱸體組成和形體學指標的影響

由表3 可知，與對照組相比，大口黑鱸肌肉中粗蛋白含量除LP1+AA 組沒有顯著性差異外（P>0.05），其余各組均顯著性降低（P<0.05）；降低飼料蛋白水平全魚中粗蛋白顯著性低于對照組（P>0.05）。添加賴氨酸與蛋氨酸的LP1+AA 和LP2+AA 組與對應(yīng)的LP1 和LP2 組相比肌肉中粗蛋白的含量沒有顯著性變化（P>0.05），但全魚中粗蛋白含量升高，LP2+AA 組顯著性高于LP2 組（P<0.05），大口黑鱸肌肉和全魚其他營養(yǎng)成分均未出現(xiàn)顯著影響（P>0.05）。

表3 低蛋白飼料中添加賴氨酸與蛋氨酸后大口黑鱸肌肉與全魚營養(yǎng)成分的變化Table 3 Changes of muscle and whole fish nutrient composition of largemouth bass supplemented with lysine and methionine in low protein diet %

由表4可得，降低飼料蛋白顯著降低了大口黑鱸幼魚的肝體比（HSI）（P<0.05），但41%低蛋白水平添加賴氨酸與蛋氨酸后大口黑鱸形體學指標與對照組相比沒有顯著性差異（P>0.05）。肥滿度（CF）和臟體比（VSI）均無顯著性差異。

表4 低蛋白飼料中添加賴氨酸與蛋氨酸后大口黑鱸形體學指標的變化Table 4 Changes of physique indices of largemouth bass supplemented with lysine and methionine in low protein diet

2.3 低蛋白飼料添加賴氨酸與蛋氨酸對大口黑鱸轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

由圖1 可知，大口黑鱸肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）的活性差異不顯著（P>0.05）；對照組血清中GPT 的活性顯著低于LP2組（P<0.05），與其他試驗組無顯著性差異。

圖1 低蛋白飼料中添加賴氨酸與蛋氨酸大口黑鱸幼魚轉(zhuǎn)氨酶活性的變化Fig.1 Changes of transaminase activity of largemouth bass fed low protein diet supplemented with lysine and methionine

2.4 低蛋白飼料添加賴氨酸與蛋氨酸對大口黑鱸幼魚肝臟抗氧化能力的影響

由表5 可知，與對照相比，LP1+AA 肝臟中活性氧（ROS）與對照組的比值、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量均無顯著性差異（P>0.05）；LP2 和LP2+AA 組ROS 均顯著性升高（P<0.05）；降低日糧中蛋白水平后肝臟中T-AOC顯著性降低（P<0.05）；LP2 組肝臟中MDA含量和CAT 的活性相比于對照組差異顯著（P<0.05），其他各組間差異均不顯著；肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）的活性在各組間均無顯著性差異（P>0.05）。

表5 低蛋白飼料添加賴氨酸與蛋氨酸后大口黑鱸肝臟抗氧化能力的變化Table 5 Changes of liver antioxidant capacity of largemouth bass supplemented with lysine and methionine in low protein diet

2.5 低蛋白飼料添加賴氨酸與蛋氨酸對大口黑鱸血清抗氧化能力的影響

由表6 可知，飼料蛋白水平由46%降至36%時，大口黑鱸血清中ROS 的含量發(fā)生顯著性變化（P<0.05），但降低至41%時卻無顯著性差異（P>0.05）。飼料蛋白水平由46%降低至41%或36%時血清中CAT 的活性顯著性降低（P<0.05），但補充必需氨基酸得到明顯改善與對照組之間無顯著性差異（P>0.05）。與46%蛋白水平相比，其他各組血清中T-AOC、MDA 和SOD 均無顯著性差異。

表6 低蛋白飼料中添加賴氨酸與蛋氨酸大口黑鱸血清抗氧化能力的變化Table 6 Changes of serum antioxidant capacity of largemouth bass supplemented with lysine and methionine in low protein diet

3 討 論

本研究結(jié)果顯示降低飼料中蛋白質(zhì)含量會導致大口黑鱸幼魚生長性能和飼料利用效率顯著下降，這與降低飼料蛋白質(zhì)水平對寶石鱸（Scortum bar?coo）[10］的生長也造成類似的影響相一致。但在低蛋白飼料中補充賴氨酸與蛋氨酸可以改善大口黑鱸幼魚的生長性能，這與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[11］和軍曹魚（Rachycentron canadum）[12］的相關(guān)研究結(jié)果基本一致。有關(guān)研究顯示，降低飼料中蛋白質(zhì)水平再添加適宜的賴氨酸和蛋氨酸等限制性氨基酸，能夠維持部分魚類正常生長[11，13］，但是當飼料中蛋白水平降低一定量后，即使補充賴氨酸和蛋氨酸等限制性氨基酸，魚類的生長性能也會因為其他氨基酸的缺乏而難以得到維持。如陳乃松等[1］的研究中，當飼料中蛋白水平降低至35%時補充必需氨基酸后大口黑鱸生長性能仍顯著低于45%蛋白水平組；Yamamoto 等[14］將虹鱒（Oncorhynchus mykiss）飼料蛋白水平由45%降低至30.6%時，晶體氨基酸添加量需達到需求量的1.2 倍才能維持虹鱒正常生長，并且能提高機體對飼料中蛋白質(zhì)的利用效率。此外，劉夢梅[7］通過分析草魚（Ctenopharyngodon idellus）生長性能，發(fā)現(xiàn)飼料粗蛋白含量為29%的試驗組在未添加氨基酸的情況下，優(yōu)于粗蛋白含量為31%的飼料組及其添加賴氨酸與蛋氨酸的飼料組。這種現(xiàn)象表明飼料中超過草魚機體需求量的蛋白質(zhì)和氨基酸會增加試驗魚的代謝負荷，從而使試驗魚的生長性能下降。

本研究結(jié)果顯示，飼料蛋白質(zhì)含量的降低會導致全魚粗蛋白含量下降，通過補充賴氨酸和蛋氨酸后有一定的改善作用。而程小飛等[15］有關(guān)湘華鯪（Sinilabeo decorustungting）研究結(jié)果顯示，飼料中蛋白水平的變化不會引起魚體粗蛋白含量的顯著變化，但會對肌肉粗蛋白的含量造成顯著性影響。在本研究中降低飼料蛋白水平對大口黑鱸幼魚肌肉和魚體的粗脂肪、粗灰分和水分等營養(yǎng)成分未造成顯著影響，而劉夢梅[7］以草魚為研究對象的相關(guān)試驗也出現(xiàn)類似的結(jié)果。本研究中低蛋白組大口黑鱸HSI顯著低于對照組，但41%蛋白水平組添加氨基酸后與對照組相比沒有顯著性差異。分析試驗結(jié)果可知補充賴氨酸與蛋氨酸能夠有效改善試驗魚魚體蛋白質(zhì)的含量和魚體形體學指標，這在有關(guān)虹鱒[11，13］和草魚[7］的試驗中也出現(xiàn)類似的結(jié)果。

轉(zhuǎn)氨酶是機體氨基酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，正常生理狀態(tài)下血清中的含量相對較低，但在肝、腎、心肌等組織中的含量會相對較高[16］。當肝臟受到外界刺激受損時，轉(zhuǎn)氨酶含量會超過正常范圍，轉(zhuǎn)氨酶會從組織進入到血清，從而導致血清中轉(zhuǎn)氨酶含量上升[17］。本研究中降低飼料蛋白含量對大口黑鱸肝臟造成一定程度的損傷，但平衡氨基酸后血清GPT降低，與對照組無顯著性差異，這一結(jié)果表明降低飼料蛋白含量基礎(chǔ)上添加蛋氨酸與賴氨酸在一定程度上可以減緩肝臟受損程度。郭凱等[18］降低荷斯坦公牛飼料中蛋白水平也出現(xiàn)血清中GPT含量升高的類似情況。當養(yǎng)殖對象肝臟出現(xiàn)損傷或者機體蛋白質(zhì)代謝能力提高時都會引起血清中GPT 和GOT 活性上升[19］。隨著飼料中蛋白質(zhì)水平的升高，出現(xiàn)血清GPT 活性升高的現(xiàn)象，說明飼料中蛋白質(zhì)水平過高時，會引起機體代謝負荷變大從而造成肝臟損傷。本試驗在降低飼料粗蛋白含量的同時補充氨基酸，可以使大口黑鱸血清GPT含量下降。在以紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）[20］為研究對象的試驗中，向飼料中添加蛋氨酸與賴氨酸，紅鰭東方鲀血清中GPT的活性發(fā)生類似的下降情況。

T-AOC 的變化側(cè)面反映機體受到外界刺激時，對自由基進行代謝以及代償能力的高低。當機體脂質(zhì)過氧化損傷時提高SOD 和T-AOC 的活性做出應(yīng)激反應(yīng)[21］。MDA 含量在當機體發(fā)生脂質(zhì)過氧化后會發(fā)生明顯變化，含量變化越顯著說明脂質(zhì)氧化程度越深[22］。本研究中，低蛋白飼料組血清CAT 活性和肝臟T-AOC 與對照組相比都降低，MDA 在血清和肝臟中的含量均上升；補充賴氨酸與蛋氨酸的飼料組出現(xiàn)肝臟中T-AOC 升高，血清CAT 活性升高，肝臟和血清MDA 含量均降低等現(xiàn)象。降低鳙（Aris?tichthys nobilis）[23］日糧中蛋白含量也出現(xiàn)了機體抗氧化性能下降的情況。本研究中添加氨基酸能改善低蛋白飼料對大口黑鱸幼魚抗氧化性能的影響、減緩大口黑鱸機體脂質(zhì)氧化過程的損傷，但是當飼料蛋白水平降低10%并添加氨基酸與對照組相比，肝臟中T-AOC 和ROS 仍然存在顯著差異，血清中ROS 水平顯著升高。研究結(jié)果表明，飼料蛋白含量從46%降低至41%并補充適量的必需氨基酸對大口黑鱸生長性能等沒有顯著性影響；但飼料粗蛋白含量降低至36%并補充賴氨酸和蛋氨酸，不能有效緩解飼料粗蛋白水平過低對生長性能造成的負面影響。