基于Snakemake的RNA-seq數(shù)據(jù)自動(dòng)化分析流程RNApipe

武樂，李益楠，孔德信，周志鵬

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）是一項(xiàng)對(duì)特定組織或細(xì)胞中所有的RNA 進(jìn)行高通量測(cè)序的技術(shù)。近十年來，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展、測(cè)序成本的降低以及分析工具的快速開發(fā)，RNA-seq 已廣泛應(yīng)用于研究基因表達(dá)調(diào)控、可變剪切甚至RNA 結(jié)構(gòu)等方向，成為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中非常重要的技術(shù)[1］。RNAseq最常應(yīng)用于識(shí)別特定條件下差異表達(dá)的基因（dif?ferential gene expression，DGE）并 鑒 定 其 分 子 功能[2］。DGE 的分析流程主要包括5 個(gè)步驟：對(duì)高通量測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的原始讀段（reads）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和控制、將預(yù)處理后的reads比對(duì)到參考基因組、在基因組或轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行定量、鑒定樣本間差異表達(dá)的基因，以及表征差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能[3］。

目前，RNA-seq 的各個(gè)分析步驟都已有許多成熟的計(jì)算方法。然而，這種分段分析的方法通常會(huì)涉及到不同的操作系統(tǒng)和編程語言，這對(duì)于科研人員的編程能力提出較高的要求。之前已有多項(xiàng)研究將各個(gè)分析步驟集成到自動(dòng)化分析工作流程中，從而降低對(duì)用戶編程能力的要求并有效地提高其工作效率。然而，目前已開發(fā)的RNA-seq 自動(dòng)化分析工作流程中存在著一些不足之處。例如，VIPER[4］與hppRNA[5］等工具只支持少數(shù)幾個(gè)特定物種的數(shù)據(jù)分析，IRIS-EDA[6］與ideal[7］等工具僅適用于差異表達(dá)基因的下游分析和可視化，BioJupies[8］與RNA?Cocktail[9］等工具不支持原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理和質(zhì)量控制等步驟，而ARRMOR[10］與RASflow[11］等工具缺乏對(duì)差異基因的功能注釋。

本研究通過Conda 部署環(huán)境以確保整個(gè)工作流程中的軟件快速、平穩(wěn)地安裝，并通過Snakemake 工作流程管理系統(tǒng)集成各個(gè)分析步驟，最終構(gòu)建了1個(gè)流程更完整且更易使用的RNA-seq 自動(dòng)化分析工具——RNApipe，旨在為研究人員快速、簡(jiǎn)便地從大型RNA-seq 測(cè)序數(shù)據(jù)中獲取基本信息提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 Conda 環(huán)境與Snakemake 工作流程管理系統(tǒng)

對(duì)于編程經(jīng)驗(yàn)有限的用戶，安裝并維護(hù)RNAseq 數(shù)據(jù)分析中必需的工具及其依賴項(xiàng)通常具有挑戰(zhàn)性。Conda作為軟件包和環(huán)境管理系統(tǒng)，可以自動(dòng)安裝、運(yùn)行和更新軟件包及其依賴項(xiàng)，并且支持虛擬環(huán)境的創(chuàng)建、切換與移植，是確保軟件管理可持續(xù)和可重現(xiàn)的理想工具[12］。因此，RNApipe 使用Conda安裝和運(yùn)行軟件，并創(chuàng)建虛擬環(huán)境。這不僅能夠保證RNApipe 的順利安裝與平穩(wěn)運(yùn)行，還確保了獨(dú)立于操作系統(tǒng)和機(jī)器的數(shù)據(jù)可重復(fù)性分析。

為減少數(shù)據(jù)分析過程中手動(dòng)執(zhí)行的步驟，傳統(tǒng)的工作管道通常使用自定義的腳本將多個(gè)工具進(jìn)行鏈接，然而這種管道通常與本地計(jì)算基礎(chǔ)架構(gòu)高度相關(guān)，難以共享與維護(hù)，產(chǎn)生的結(jié)果也較難重復(fù)[13］。為此，RNApipe 使用Snakemake 工作流程管理系統(tǒng)將RNA-seq 各個(gè)分析步驟進(jìn)行組合。Snakemake[14］是一個(gè)基于python 的工作流程管理系統(tǒng)，它具有以下優(yōu)勢(shì)：通過集成Conda包管理器自動(dòng)安裝和配置軟件，以確保不同平臺(tái)的可移植性；通過支持高性能并行計(jì)算和云計(jì)算環(huán)境，以實(shí)現(xiàn)超越本地基礎(chǔ)架構(gòu)的可擴(kuò)展性；通過支持工作流間緩存，避免在管道之間重新運(yùn)行程序而浪費(fèi)時(shí)間和計(jì)算資源；并通過將各個(gè)步驟分解為模塊化規(guī)則（rules），從而降低了代碼的復(fù)雜性，使代碼易讀易維護(hù)易擴(kuò)展。最終，RNApipe 基于Snakemake 管理系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)通過1條命令執(zhí)行整個(gè)自動(dòng)化分析過程，極大地簡(jiǎn)化了程序的運(yùn)行方式（圖1）。

1.2 RNApipe工作流程框架

整個(gè)RNApipe工作流程（圖1）包括：（1）RNApipe啟動(dòng)時(shí)，首先使用fastp[15］（默認(rèn)）或Cutadapt[16］對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)并修剪接頭、去除低質(zhì)量堿基和reads；隨后使用FastQC[17］檢測(cè)reads 質(zhì)量，質(zhì)檢結(jié)果由MultiQC[18］匯總為一個(gè)可視化報(bào)告。（2）質(zhì)量達(dá)到用 戶 要 求 的reads 會(huì) 被HISAT2[19］（默 認(rèn)）或STAR[20］比 對(duì) 到 參 考 基 因 組，比 對(duì) 結(jié) 果 由Quali?map2[21］進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，比對(duì)文件以BAM 或Bigwig格式（可選）保存。（3）使用featureCounts[22］（默認(rèn)）或HTSeq-count[23］對(duì)BAM 文件進(jìn)行定量（count）。（4）其中表達(dá)矩陣（count）用于DESeq2[24］、edgeR[25］（可選）或limma[26］（可選）鑒定差異表達(dá)的基因。TPM 標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)矩陣用于樣本間基因的表達(dá)量分析。（5）使用KOBAS-i[27］對(duì)差異基因進(jìn)行GO 功能注釋與KEGG pathway 通路分析，對(duì)所有表達(dá)的基因做GSEA 基因集富集分析。以上每個(gè)步驟都可以輸出高質(zhì)量的可視化圖片或報(bào)告，并保留重要的輸出文件和表格數(shù)據(jù)。

圖1 RNApipe數(shù)據(jù)分析流程圖Fig.1 The workflow chart of RNApipe analysis

1.3 RNApipe使用方法

RNApipe 的源代碼已經(jīng)上傳至Github 供用戶下載 和 使 用：https：//github.com/ywu019/RNApipe.git。以下簡(jiǎn)單介紹RNApipe 的安裝和使用方法，具體使用方法可見Github 中的說明文檔（Documenta?tion.pdf）。

1）下載RNApipe 工具與安裝環(huán)境。首先通過Python3.7 在Linux 系統(tǒng)中安裝miniConda3 環(huán)境，隨后通過以下3 條命令完成RNApipe 工具的安裝與環(huán)境 的 創(chuàng) 建：①從 GitHub 下 載 RNApipe：it clonehttps：//github.com/ywu019/RNApipe.git；②創(chuàng)建環(huán)境：conda env create -n RNApipe -f envs/envs.yaml；③激活環(huán)境：conda activate RNApipe。

2）用戶指定輸入文件。在運(yùn)行RNApipe 前需要指定：基因組文件（.fa）、注釋文件（.gtf）與壓縮的測(cè)序文件（.fastq.gz）（圖1A）。其中基因組文件和注釋文件建議從NCBI下載，測(cè)序文件支持單端和雙端測(cè)序，其命名應(yīng)符合“條件_重復(fù)”（或“條件_重復(fù)_雙端”）的形式，例如root_1_R1.fastq.gz。

隨后修改configs/目錄下的樣本表（samples.tsv）和配置文件（config.yaml）。用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件指定樣本表中的條件列“condition”與重復(fù)列“repli?cate”的信息，并修改配置文件中的基本設(shè)置，配置文件主要包含以下變量：

PROJECT：#項(xiàng)目名稱；

READPATH：#測(cè)序文件fastq.gz的路徑；

END：#測(cè)序數(shù)據(jù)類型是SE（single-end）還是PE（paired-end）；

OUTPUTPATH：#輸出文件的路徑；

GENOME：#基因組文件路徑；

ANNOTATION：#注釋文件路徑；

CONTROL：#對(duì)照組名稱，與samples.tsv 中condition一致；

TREAT：#處理組名稱；

SPEICES_ABBREVIATION：物種簡(jiǎn)稱，在speices_abbreviations中查詢；

TRIM：fastp #[fastp，cutadapt］選擇工具執(zhí)行數(shù)據(jù)預(yù)處理；

ADAPTER：AGATCGGAAGAGC # 接 頭序列；

ALIGN：hisat2#[hisat2，STAR］#比對(duì)軟件；

BIGWIG：["no"］#[yes，no］#是否將bam 格式的文件轉(zhuǎn)化為bigwig格式；

DEA：DESeq2 #[DESeq2，edgeR，limma］#差異基因分析軟件；

QUANTIFY：featureCounts #[featureCounts，htseq］#定量軟件；

THREAD："10"#線程數(shù)目；

TIME："5"#程序延遲時(shí)間。

3）運(yùn)行工作流程。準(zhǔn)備好所有的輸入文件后，用戶只需要通過一條命令（python main.py）即可在本地或集群環(huán)境中運(yùn)行RNApipe 整個(gè)工作流程。運(yùn)行結(jié)果保存在用戶指定的輸出目錄中，logs/目錄下生成各個(gè)分析步驟的日志文件，其中記錄了程序的運(yùn)行時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)輸出和標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤等信息。

2 結(jié)果與分析

為了讓用戶了解RNApipe 的工作原理和基本功能，本研究利用RNApipe 對(duì)來自4 日齡野生型擬南芥根部（root）和芽部（shoot）的單端RNA-seq 完整數(shù)據(jù)集（PRJNA321304；GEO：GSE81332）進(jìn)行自動(dòng)化分析，其中根部設(shè)為對(duì)照組，芽部設(shè)為試驗(yàn)組。

2.1 RNApipe概要

圖2A 展示了用戶從Github 下載的RNApipe 所包含的完整數(shù)據(jù)集。example_data/目錄代表1 個(gè)真實(shí)的測(cè)試數(shù)據(jù)子集（GSE81332），便于用戶在運(yùn)行實(shí)際項(xiàng)目前對(duì)系統(tǒng)和軟件進(jìn)行測(cè)試。Documentation.pdf 文檔對(duì)RNApipe 的安裝、使用方法以及注意事項(xiàng)進(jìn)行了詳細(xì)的介紹。

用戶在運(yùn)行項(xiàng)目時(shí)應(yīng)在project/目錄中設(shè)置類似于example_data/的項(xiàng)目結(jié)構(gòu)，并將測(cè)序數(shù)據(jù)、參考基因組和注釋文件分別置于相應(yīng)的子目錄中（圖2A），再根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件修改config.yaml文件（圖2B）和sam?ple.tsv文件（圖2C）。當(dāng)輸入文件設(shè)置完畢，只需要1條簡(jiǎn)單的命令（圖1 命令），RNApipe 將根據(jù)config.yaml 文件中的設(shè)置，通過Snakemake 對(duì)main.py 中的規(guī)則自動(dòng)執(zhí)行整個(gè)分析過程。輸出結(jié)果存于trim/、align/、quantify/、DEA/、annotation/、visualize/等目錄，分別對(duì)應(yīng)質(zhì)控、比對(duì)、定量、差異分析、功能注釋和圖形可視化結(jié)果（圖1C）。其余文件則不需要修改，除非用戶需要自定義工作流程。

圖2 RNApipe的文件與目錄結(jié)構(gòu)Fig.2 The file and directory structures of RNApipe

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量可視化

為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，RNApipe 分別對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)和比對(duì)文件進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并將每個(gè)樣本文件生成的質(zhì)控報(bào)告（html）進(jìn)行匯總（圖3）。通過質(zhì)控報(bào)告檢查當(dāng)前reads 是否仍需要修剪，當(dāng)數(shù)據(jù)質(zhì)量較低時(shí)，例如：堿基質(zhì)量差、GC 含量不穩(wěn)定、存在接頭等，則建議繼續(xù)修剪以提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。如圖3A 所示，6 個(gè)樣本在質(zhì)控后的堿基質(zhì)量均在Q30以上，表明堿基質(zhì)量較好，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。圖3B展示了6個(gè)樣本的詳細(xì)比對(duì)情況。

圖3 數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)報(bào)告Fig.3 Report on data quality inspection

2.3 基因表達(dá)量可視化

在完成質(zhì)量控制和比對(duì)后，RNApipe 將表達(dá)矩陣（count）進(jìn)行TPM 標(biāo)準(zhǔn)化，以消除測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)表達(dá)量的影響。設(shè)置閾值（TPM<1）過濾低表達(dá)的基因，得到的表達(dá)量矩陣用于可視化圖表展示（圖4）。

RNApipe 使用cor 函數(shù)與ggplot2 包（v3.3.3）將所有樣本基因表達(dá)譜的成對(duì)相關(guān)性可視化為熱圖，相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值越接近1，表明樣本之間的相關(guān)性越高，這有助于用戶進(jìn)一步識(shí)別相關(guān)性較低的離群值樣本。結(jié)果顯示擬南芥根部或芽部中各個(gè)生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)性較高，而樣本間的相關(guān)性較差（圖4A）。此外，RNApipe 使用FactoMineR（v2.4）和fac?toExtra（v1.0.7）包進(jìn)行主成分分析（PCA），通過將數(shù)據(jù)降為二維，再進(jìn)行K-means 聚類和計(jì)算歐式距離，距離值越小則表示數(shù)據(jù)的相似度越高，用戶可以據(jù)此分離和排除離群值。PCA 結(jié)果同樣顯示組內(nèi)的生物學(xué)重復(fù)聚類良好，而樣本間差異較大（圖4B）。RNApipe還支持使用pheatmap包（v1.0.12）展示樣本中所有表達(dá)基因的聚類圖譜，橫軸頂部的線圖表示樣本的聚類，左側(cè)線圖則表示基因的聚類。此外，RNApipe 使用stat_ecdf 和geom_boxplot 函數(shù)分別繪制累積分布曲線圖（圖4C）與箱線圖（圖4D）以評(píng)估2 組樣本中基因的整體表達(dá)水平。同樣地，這2 種分析方法也都表明擬南芥根部的整體基因表達(dá)水平顯著高于芽部。與圖4A、B 一致，聚類圖譜的結(jié)果同樣表明組內(nèi)重復(fù)的相關(guān)性較高，而組間差異較大（圖4E）。同時(shí)，該結(jié)果還表明擬南芥根部的基因總體表達(dá)量高于芽部（圖4E）。

圖4 樣本間基因表達(dá)量的可視化Fig.4 Visualization of gene expression levels among samples

2.4 差異基因的鑒定

RNA-seq 下游分析的第一步是鑒定樣本間差異表達(dá)的基因。RNApipe 集成了當(dāng)下主流的差異表達(dá)工具：DESeq2、edgeR、limma。這些工具具有不同的模型和優(yōu)勢(shì)（見Documentation.pdf），用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求在config.yaml 中選擇其中任一工具進(jìn)行分析。RNApipe 默認(rèn)使用DESeq2 軟件在基因水平上執(zhí)行差異基因的鑒定，DESeq2 使用基因表達(dá)的原始豐度而不是標(biāo)準(zhǔn)化豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)[28］。DESeq2分析的結(jié)果包括：對(duì)數(shù)變化（logFC）、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）以及調(diào)整后的P值。圖5 展示了擬南芥芽部相較于根部顯著差異基因（|logFC|≥1 且Padj<0.05）的數(shù)目，以及前30 個(gè)變化最大的顯著差異基因的表達(dá)量熱圖。除了可視化圖片，輸出結(jié)果還包括基因表達(dá)矩陣和顯著差異基因列表，以便科研人員進(jìn)一步分析和后續(xù)驗(yàn)證。

圖5 樣本間差異表達(dá)基因的可視化Fig.5 Visualization of differentially expressed genes among samples

2.5 功能注釋

差異基因的功能注釋對(duì)于了解特定條件所影響的生物學(xué)過程至關(guān)重要?；虮倔w論（GO）分析[29］與京都基因和基因組百科全書（KEGG）途徑分析[30］是對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類的重要工具。RNApipe通過KOBAS-i 數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因的生物學(xué)功能和參與的通路進(jìn)行注釋（圖6）。GO 分析從分子功能（MF）、生物過程（BP）和細(xì)胞成分（CC）3 個(gè)方面展示，擬南芥根部與芽部間差異基因的GO 分類注釋，表明差異基因主要與氧化還原和脅迫相應(yīng)等過程相關(guān)，并顯著富集于葉綠體、質(zhì)體等部位（圖6A）。KEGG 通路分析是探索差異基因的功能和相關(guān)通路的另一個(gè)重要工具。KEGG 氣泡圖展示了根部與芽部間差異基因顯著富集的前30 條KEGG 通路，氣泡的大小代表富集到該通路中基因數(shù)目的多少，氣泡的顏色從紅到藍(lán)代表富集程度越來越顯著。結(jié)果表明差異基因主要富集在代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路（圖6B）。

圖6 樣本間基因功能注釋的可視化Fig.6 Visualization of gene functional annotations among samples

GO 和KEGG 富集分析往往側(cè)重于識(shí)別兩組間差異表達(dá)顯著的基因，這可能導(dǎo)致遺漏部分差異表達(dá)不顯著卻有重要功能和意義的基因，另外，GO 和KEGG 分析無法判斷差異基因的變化方向是上調(diào)還是下調(diào)。基因集富集分析（GSEA）不需要指定明確的差異閾值，算法會(huì)根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)的整體趨勢(shì)對(duì)基因的表達(dá)差異進(jìn)行排序，隨后檢驗(yàn)數(shù)據(jù)庫中預(yù)先設(shè)定的基因集富集在該排序列表的頂端或底端，因此，GSEA 檢測(cè)到的是基因集而不是單個(gè)基因的表達(dá)變化。GSEA 圖展示了脂質(zhì)和脂蛋白通路中的基因集的表達(dá)在擬南芥的芽中呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，而卟啉與葉綠素代謝通路中的基因集的表達(dá)在根中呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)（圖6C）。

2.6 RNApipe與其他自動(dòng)化分析工具的比較

與現(xiàn)有的自動(dòng)化分析工具對(duì)比（表1），RNApipe通過Conda 虛擬環(huán)境保證了所有軟件的自動(dòng)安裝與運(yùn)行，通過Snakemake 工作流程管理系統(tǒng)整合各個(gè)分析步驟，保證了數(shù)據(jù)的可重復(fù)性與功能的可擴(kuò)展性，并通過用戶指定輸入文件，保證了RNApipe 適用于所有有參物種的分析。先前的工作流程大多到鑒定差異基因就截止，然而差異基因的功能注釋對(duì)于生物學(xué)問題的研究更具有指導(dǎo)意義，因此RNApipe通過KOBAS-i數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋。該數(shù)據(jù)庫目前整合了最新的KEGG 數(shù)據(jù)庫，支持5 944 個(gè)物種的KEGG 注釋和71 個(gè)物種的GO 注釋信息。另外，RNApipe 在各個(gè)分析步驟中集成了多款當(dāng)下主流的軟件，并在log 日志文件中記錄同類型軟件的運(yùn)行情況。通過比較運(yùn)行時(shí)間和所耗硬件資源，我們篩選出一套最優(yōu)軟件組合作為RNApipe 的默認(rèn)流程（FastQC-fastp-HISAT2-featureCounts-DESeq2-KO?BAS-i）。同時(shí)，用戶也可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過修改config.yaml 中的參數(shù)選擇非默認(rèn)軟件進(jìn)行分析。RNApipe 另一重要的特點(diǎn)是在每一分析階段都提供詳細(xì)的高質(zhì)量圖表供用戶直接使用。

表1 RNApipe與其他自動(dòng)化分析工具的比較Table 1 Comparison of RNApipe with other automated analysis tools

3 討 論

利用RNA-seq 數(shù)據(jù)鑒定差異表達(dá)基因?yàn)檠芯恐匾目茖W(xué)問題提供了思路，若將整個(gè)過程的分析步驟整合為一個(gè)自動(dòng)化、模塊化的流程，將極大地方便科研工作者的使用。為此，本研究開發(fā)了一個(gè)適用于任何有參物種的、流程更加完整的RNA-seq自動(dòng)化分析工作流程：RNApipe。RNApipe工作流程旨在分析來自任何有參物種的RNA-seq數(shù)據(jù)。目前，RNApipe已在以下5個(gè)模式物種的完整數(shù)據(jù)集中完成測(cè)試與評(píng)估：人（PRJNA390636；GEO：GSE100075）、小 鼠（PRJNA630257；GEO：GSE149838）、擬南芥（PRJ?NA321304；GEO：GSE81332）、粗糙脈孢菌（PRJ?NA392079；GEO：GSE100539） 、酵 母（PRJ?NA318684；GEO：GSE80357）。分 析 結(jié) 果 表 明，RNApipe 運(yùn)行穩(wěn)定，功能注釋結(jié)果符合已發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)。實(shí)際數(shù)據(jù)集的可視化結(jié)果存放于https：//github.com/ywu019/RNApipe_pj.git.，與現(xiàn)有的自動(dòng)化分析工具對(duì)比，RNApipe 具有安裝容易、使用方便、易于擴(kuò)展、功能豐富等特點(diǎn)。RNApipe 將幫助科研工作者以一種簡(jiǎn)單、高效且可重復(fù)的方式從RNAseq數(shù)據(jù)中獲取有價(jià)值的信息。

RNApipe 目前主要適用于對(duì)二代Illumina 測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的短讀長(zhǎng)（short-read）數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析。在RNApipe 的基礎(chǔ)上，用戶可以通過修改rules命令來擴(kuò)展其他功能，例如可變剪切與單核苷酸變異的檢測(cè)等。另外，由于常規(guī)RNA-seq 是對(duì)所有細(xì)胞的RNA 進(jìn)行測(cè)序的技術(shù)，因此無法辨別細(xì)胞的類型和空間信息。近年來興起的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（scRNA-seq）常應(yīng)用于研究不同組織或器官中（例如正常和癌癥）差異基因的表達(dá)，為研究單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜提供了機(jī)會(huì)?？臻g轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)通過將成像技術(shù)與scRNA-seq 相結(jié)合，可以繪制出轉(zhuǎn)錄本在組織中表達(dá)的位置，進(jìn)一步提高組織分辨率。scRNA-seq 技術(shù)與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的普及同時(shí)伴隨著研究人員在數(shù)據(jù)分析方面面臨的挑戰(zhàn)，RNApipe 的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)則可以為scRNA-seq 自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析工具的構(gòu)建提供參考。