基于近紅外建立凍藏鮰魚片動(dòng)力學(xué)貨架期模型

周俊鵬，闕 鳳，石鋼鵬，石 柳，汪 蘭，吳文錦，李 新，丁安子，王 軍，熊光權(quán)

(1 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068;2 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064)

斑點(diǎn)叉尾鮰(IetalurusPunetaus)，屬鯰形目，鮰科，是一種原產(chǎn)于美洲的淡水魚，目前已在我國20多個(gè)省市養(yǎng)殖，成為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚種之一[1]。因其高蛋白、高水分含量、多種氨基酸等特點(diǎn)[2]，斑點(diǎn)叉尾鮰魚肉在貯藏過程中易腐敗變質(zhì)[3]，不僅會造成商品價(jià)值降低，而且易引發(fā)食品安全問題。因此，形成快速準(zhǔn)確的鮰魚肉制品貨架期評價(jià)方法十分必要。目前，魚肉新鮮度常采用化學(xué)評價(jià)方法進(jìn)行評價(jià)，如揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、K值、硫代巴比妥酸(TBA)、三甲胺(TMA)和生物胺等化學(xué)指標(biāo)[4]。李輝[5]采用pH、TVBN和K值評價(jià)了牙鲆貯藏過程中新鮮度的變化；Ocao-Higuera等[6]以TVB-N、TMA等研究了冰藏條件下射線魚的新鮮度；De Abreu等[7]通過TBA值研究大西洋比目魚在冷凍條件下脂肪氧化與水解情況，將TBA值列為新鮮度評價(jià)有效指標(biāo)之一。近年來，近紅外光譜技術(shù)作為一種簡便、快捷、綠色、高效的新型檢測分析技術(shù)，在淡水魚品質(zhì)評價(jià)等方面受到廣泛應(yīng)用[7-10]，如Tito等[9]利用紅外光譜對大西洋三文魚的微生物數(shù)量進(jìn)行預(yù)測；Ding等[10]使用近紅外反射光譜技術(shù)結(jié)合支持向量回歸方法建立鰱魚K值的快速測定模型。在檢測新鮮度指標(biāo)的基礎(chǔ)上，淡水魚常采用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力方法進(jìn)行貨架期的預(yù)測。如Hong等[11]通過測定TVB-N、菌落總數(shù)和K值的變化實(shí)現(xiàn)鳙魚貨架期的預(yù)測；姜元欣等[12]采用TVB-N建立了凍藏羅非魚的貨架期預(yù)測模型，鞠健[13]通過測定脂肪的酸價(jià)、過氧化值和TBA建立冷藏鱸魚的貨架期預(yù)測模型。淡水魚因種類、養(yǎng)殖環(huán)境、加工貯藏環(huán)境等差異，其貨架期也存在差異。目前關(guān)于斑點(diǎn)叉尾鮰凍藏貨架期的預(yù)測模型還沒有相關(guān)研究與報(bào)道。

本研究以斑點(diǎn)叉尾鮰魚肉為研究對象，分別在-6℃、-10℃、-14℃、18℃冷凍貯藏鮰魚片119 d。在貯藏過程中使用近紅外快速測定鮰魚片的新鮮度指標(biāo)(TVB-N、TBA、TMA和K值)，運(yùn)用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力方法建立各指標(biāo)的貨架期預(yù)測模型。

1 材料

1.1 材料與試劑

鮮活的斑點(diǎn)叉尾鮰(約1～3 kg)購于湖北省武漢市白沙洲水產(chǎn)品批發(fā)市場。

高氯酸，上海靈峰化學(xué)試劑有限公司；苦味酸，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；腺嘌呤核糖三磷酸標(biāo)品，上海源葉生物科技有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇、石油醚(30～60℃)硫代巴比妥酸、冰醋酸、液體石蠟、甲苯、無水碳酸鉀、甲醛、無水硫酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-575WDBI 冰箱，青島海爾股份有限公司；高效液相色譜儀，島津(中國)有限公司；FoodScan 肉制品分析儀；FOSS HM 294 Homogeniser 230V，丹麥福斯。

2 方法

2.1 樣品處理

在10℃冷庫中將鮰魚敲擊致暈殺死，去除內(nèi)臟、表皮，流水清洗干凈后，取背部魚肉，然后用PE包裝袋分裝(每袋約400 g)，分別于-6℃、-10℃、-14℃、-18℃貯藏119 d。其間，每間隔7 d分別進(jìn)行近紅外掃描和理化分析測定TVB-N、K值、TBA和TMA。

2.2 近紅外新鮮度指標(biāo)測定

采用透射式FoodScan近紅外光譜掃描儀進(jìn)行光譜采集。首先將儀器開機(jī)30 min進(jìn)行自檢及預(yù)熱，將解凍后300 g樣品置于FOSS HM 294高速均質(zhì)器中絞碎(8000 r/min，5 min)，絞碎的樣品置于樣品盤(r×h=68×17 mm)，輕輕拍打除去樣品中氣泡并使樣品表面平整。樣品平衡至室溫(約25℃)，使用FoodScanTM透射近紅外光譜儀(2 nm分辨率，850～1050 nm)進(jìn)行凍藏鮰魚樣品新鮮度掃描，分別獲得鮰魚冷凍貯藏中TVB-N、TBA、TMA和K值的近紅外掃描值。

2.3 指標(biāo)測定

2.3.1TVB-N含量參考GB5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》方法并略作修改[13]。稱取約5.0 g，置于錐形瓶中，加50 mL水，不時(shí)振搖，浸漬30 min后過濾，濾液置冰箱備用；將盛有10 mL吸收液及5～6滴混合指示液(V(甲基紅)∶V(溴甲酚綠)=1∶5)的錐形瓶置于冷凝管下端，使之插入硼酸吸收液(20 g/L)液面下，準(zhǔn)確吸取5.0 mL上述試樣濾液于蒸餾器反應(yīng)室內(nèi)，加5 mL氧化鎂混懸液(10 g/L)，迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸汽，進(jìn)行蒸餾，蒸餾5 min即停止，吸收液用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.01 mol/L)標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至紫紅色，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)，計(jì)算試樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量

式中：X為試樣中的TVB-N值，mg·100 g-1,V1為測定用樣液消耗鹽酸溶液體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；14為與1.00 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，mg；m為試樣質(zhì)量，g。計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

2.3.2TBA值參考Tarladgis等[14]方法，10 g絞碎的魚肉于凱氏蒸餾瓶中，加入20 蒸餾水?dāng)嚢杌旌暇鶆颍偌尤? mL鹽酸溶液(m(HCl)∶m(H2O)= 1∶2)及2 mL液體石蠟，采用水蒸氣蒸餾，收集50 mL蒸餾液。5 mL蒸餾液與5 mL TBA醋酸溶液(0.2883 g硫代巴比妥酸溶解于100 mL 90%冰醋酸)于25 mL比色管中充分混合，100℃水浴加熱35 min后冷卻10 min，在535 nm處測定吸光度A，以蒸餾水取代蒸餾液為空白樣。

XTBA=A×7.8

式中：X為試樣中的TBA值，mg/kg；A為樣品溶液在535 nm吸光度值；7.8為換算系數(shù)。

2.3.3TMA的測定參考Yu等[14]方法略作修改，準(zhǔn)確吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL 100 μg/mL三甲胺氮標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的比色管中，分別加蒸餾水至5 mL(相當(dāng)于0、6、12、18、24、30 μg/mL三甲胺氮)，用蒸餾水做空白。向每支試管中依次加入10%甲醛溶液1 mL，無水甲苯10 mL及1+1碳酸鉀溶液3 mL，立即蓋塞，漩渦震蕩2 min后靜置20 min，待分層后吸去下面水層，加入0.5 g無水硫酸鈉進(jìn)行脫水，吸出5 mL萃取液于比色管中，再加入0.02%苦味酸5 mL顯色，并輕輕振動(dòng)使之混合，410 nm下讀取吸光值，作含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線；稱取絞碎魚肉約4.0 g加入20%三氯乙酸20 mL于具塞三角瓶，振搖后靜置30 min，待蛋白質(zhì)沉淀后過濾。取濾液5 mL于25 mL具塞比色管中，接下來的試驗(yàn)步驟同標(biāo)準(zhǔn)液的步驟一樣，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的三甲胺氮含量

式中：X為試樣中的TMA值，mg·100 g-1,c為樣品中三甲胺氮濃度，μg/mL；v為試樣處理總體積，20 mL；m為試樣質(zhì)量，g。

2.3.4K值的測定參考Shi等[15]方法，取2.00 g絞碎的魚肉，加10%(體積分?jǐn)?shù))高氯酸20 mL，漩渦震蕩1 min，漿液離心(10000 r/min，4℃，6 min)分離，上清液沉淀用5%高氯酸20 mL洗滌，離心，最后合并上清液；用10 mol/L和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.4，并用蒸餾水定容至50 mL。用0.22 μmL濾膜過濾，濾液貯存于-20℃冰箱待測。HPLC條件：色譜柱Agilent Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm)，采用0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)平衡洗脫；樣品進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長254 nm；ATP關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜的測定：ATP、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)、次黃嘌呤(Hx)以及它們的混合物在相同條件下測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)圖譜。以測得的HxR、Hx之和與腺苷三磷酸關(guān)聯(lián)化合物總量的百分比作為鮮度指標(biāo)(K值)：

2.4 模型的建立及驗(yàn)證

2.4.1化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型水產(chǎn)品在貯藏腐敗過程中微生物的生長及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的累計(jì)，一般遵循一級化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[16-17]，將不同貯藏溫度過程中新鮮度指標(biāo)數(shù)值與貯藏時(shí)間進(jìn)行非線性擬合，確定對應(yīng)不同貯藏溫度下各指標(biāo)的反應(yīng)速率常數(shù)K(表2)。

水產(chǎn)品在腐敗過程中，其微生物生長繁殖及化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，最主要的影響因素是溫度。通常情況下采用Arrhenius公式表示反應(yīng)速率常數(shù)K與溫度的變化關(guān)系：

其中：K0為頻率因子；Ea為活化能，J/mol；T為溫度，K；R為常數(shù)8.314 J/(mo1/K)。K0和Ea是與相關(guān)物質(zhì)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)。將不同貯藏溫度下各指標(biāo)反應(yīng)速率常數(shù)K，用lnK對熱力學(xué)溫度的倒數(shù)(1/T)進(jìn)行線性擬合，依據(jù)斜率-Ea/R和截距l(xiāng)nK0求出不同指標(biāo)的反應(yīng)活化能Ea和反應(yīng)速率常數(shù)K0，因此常采用不同貯藏溫度的樣品進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期建立。

依據(jù)一級化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和Arrhenius公式推導(dǎo)出貨架期的預(yù)測方程：

因此，貨架期預(yù)測模型

(1)

2.4.2化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型的驗(yàn)證穩(wěn)定性驗(yàn)證：將近紅外掃描值與模型預(yù)測值進(jìn)行對比，以相對誤差值來評價(jià)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型的穩(wěn)定性。準(zhǔn)確度驗(yàn)證：將理化檢測的實(shí)測值與模型預(yù)測值進(jìn)行對比，以相對誤差值來評價(jià)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型的準(zhǔn)確度。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0和WPS2019進(jìn)行相應(yīng)數(shù)據(jù)處理、圖表繪制及動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型的建立。

3 結(jié)果與分析

3.1 凍藏鮰魚片新鮮度變化

隨著貯藏時(shí)間的延長，淡水魚的新鮮度會逐漸降低直至腐敗變質(zhì)，因此常采用TVB-N、TBA、TMA和K值等化學(xué)指標(biāo)對淡水魚的新鮮度進(jìn)行評價(jià)[18-19]。如圖1-圖4所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，近紅外快速掃描與理化分析2種方式測定的凍藏鮰魚片TVB-N、TBA、TMA和K值均呈逐漸增加趨勢，且不同貯藏溫度的鮰魚片各新鮮度指標(biāo)的增加速率具有一定的差異性。在凍藏過程中鮰魚片TVB-N、TBA、TMA在貯藏前期呈緩慢增加的趨勢，后期則呈現(xiàn)迅速上升，而K值則在貯藏過程中較其他新鮮度指標(biāo)增長速率較快。在貯藏過程中，鮰魚片在腐敗微生物及相關(guān)蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)被分解成氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，且在貯藏過程中不斷積累，因此TVB-N值逐漸增加[20]；脂肪易被氧化成醛、酮類化合物等脂肪氧化物，其與TBA試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色化合物可反映脂肪的氧化程度，因此隨著脂肪氧化產(chǎn)物的累積，TBA值也呈現(xiàn)逐漸增加趨勢[21]。隨著貯藏時(shí)間延長，TMA含量貯藏增加，主要是因?yàn)轷t魚片的氧化三甲胺在腐敗微生物及酶的作用下分解成三甲胺、二甲胺和胺等物質(zhì)[22]。魚體在死亡后，魚肉的三磷酸腺苷(ATP)逐步降解為二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、肌苷酸、肌苷和次黃嘌呤等物質(zhì)，最終產(chǎn)物(HxR和Hx)在貯藏過程中逐漸積累，在這個(gè)過程中魚肉的新鮮度也相應(yīng)降低[6]。

圖1 不同貯藏溫度下鮰魚片的TVB-N變化

圖2 不同貯藏溫度下鮰魚片的TBA變化

圖3 不同貯藏溫度下鮰魚片的TMA變化

圖4 不同貯藏溫度下鮰魚片的K值變化

淡水魚的TVB-N、TBA、TMA和K值等4個(gè)指標(biāo)限定值分別是15 mg/100g[23]、0.5 mg MDA/kg[24]、0.15 mg/100g[25]和60%[26]。在不同貯藏溫度下經(jīng)不同新鮮度指標(biāo)對鮰魚片貨架期進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)基于不同指標(biāo)的貨架期間存在著一定的差異性，且不同方式測定的同一指標(biāo)的貨架期也略有差異；隨著貯藏溫度降低，凍藏鮰魚片的貨架期呈逐漸延長，且不同指標(biāo)在表征貨架期方面也存在著一定的差異性，具體結(jié)果如表1所示。例如，這表明不同指標(biāo)對鮰魚片貨架期的評定存在著一定的差異性，可能是因?yàn)樵谫A藏過程中不同指標(biāo)的化學(xué)反應(yīng)速率具有一定的差異性，這在林琳等[27]和鞠健[28]的研究中也得到了證實(shí)。不同的貯藏溫度下鮰魚片同種新鮮度指標(biāo)的數(shù)值增加速率也存在一定差異性，其從大到小依次是-6℃>-10℃>-14℃>-18℃，這是因?yàn)榈蜏啬軌蛴行б种屏烁瘮∥⑸锏纳L、相關(guān)蛋白酶的活性及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，使得不同貯藏溫度下鮰魚片同種新鮮度指標(biāo)的產(chǎn)物累積存在著一定差異性[29]。

表1 不同貯藏溫度下鮰魚片近紅外掃描值和實(shí)測值貨架期

3.2 貨架期預(yù)測模型的建立

利用SPSS 20.0對不同貯藏溫度下近紅外掃描新鮮度指標(biāo)數(shù)值與貯藏時(shí)間的進(jìn)行非線性擬合，其結(jié)果如表2所示。

表2 近紅外掃描各指標(biāo)非線性參數(shù)擬合

由表2可知，隨著貯藏溫度降低，各新鮮度指標(biāo)的化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)K逐漸減小，說明較低貯藏溫度能夠延緩鮰魚片生化反應(yīng)速率，且能有效降低鮰魚片品質(zhì)劣變速率[30-31]，同時(shí)這也使得前面不同貯藏溫度下同種新鮮度指標(biāo)的數(shù)值增加速率差異性的結(jié)論也得到了證實(shí)。此外，除近紅外掃描指標(biāo)TMA在259 K擬合精確度較低外，其他指標(biāo)擬合精度R2均大于0.90，表明一級化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程能較好描述凍藏鮰魚片的新鮮度變化，這為一級化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程和Arrhenius公式建立貨架期預(yù)測模型提供了可行性。

將表2各指標(biāo)不同貯藏溫度下lnK與貯藏溫度1/T作圖進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖5和表3所示。各新鮮度指標(biāo)其擬合精度R2范圍為0.9097～0.9633，這表明貯藏溫度與反應(yīng)速率常數(shù)K相關(guān)性高，模型預(yù)測效果好。且由表3也可知，鮰魚片不同新鮮度指標(biāo)反應(yīng)速率常數(shù)K和活化能Ea也均存在著差異性，這可能是因?yàn)轷t魚片在不同溫度冷凍貯藏過程中各種化學(xué)反應(yīng)速率存在差異性，其相應(yīng)產(chǎn)物的累積也有所不同，也進(jìn)一步證實(shí)了不同化學(xué)指標(biāo)在評價(jià)鮰魚片新鮮度方面存在著的差異性[30]。

表3 近紅外掃描各指標(biāo)的不同貯藏溫度與反應(yīng)速率常數(shù)K線性擬合結(jié)果

圖5 近紅外掃描各指標(biāo)的不同貯藏溫度與反應(yīng)速率常數(shù)K線性擬合

經(jīng)反應(yīng)速率常數(shù)lnK與貯藏溫度1/T進(jìn)行線性擬合后，鮰魚片TVB-N、TBA、TMA和K值的反應(yīng)速率常數(shù)K0分別為6427.2367、356.9158、21.5980、1.9736，活化能Ea分別為29700.10 J/mo1、21078.48 J/mo1、15268.66 J/mo1、10006.73 J/mo1，將反應(yīng)速率常數(shù)K和活化能Ea代入式(1)，可分別得到基于化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程建立的近紅外TVB-N、TBA、TMA和K值的貨架期預(yù)測模型計(jì)算公式：

式中：A0為相應(yīng)指標(biāo)的初始值；A為儲藏t天后對應(yīng)指標(biāo)值；R為常數(shù)8.314 J/(mo1·K)，T為貯藏溫度，K。

3.3 貨架期預(yù)測模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證基于近紅外測定數(shù)據(jù)建立的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型穩(wěn)定性，依據(jù)各指標(biāo)的限定值、初始值和貨架期預(yù)測模型公式計(jì)算出各新鮮度指標(biāo)貨架期的預(yù)測值，并且與近紅外貨架期掃描值(表1)進(jìn)行對比，穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果如表4所示，其中“-”表示在貯藏期結(jié)束時(shí)新鮮度指標(biāo)未達(dá)到其限值，而無法確定貨架期。結(jié)果表明貨架期掃描值與預(yù)測值相對誤差在-3.17%～5.71%，貨架期預(yù)測模型的穩(wěn)定性均在94%以上，即基于近紅外測定數(shù)據(jù)建立的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期模型穩(wěn)定性較好。

表4 不同貯藏溫度下化學(xué)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型的穩(wěn)定性驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證基于近紅外建立化學(xué)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型的準(zhǔn)確度，將各貨架期的預(yù)測值與理化檢測的實(shí)測值(表1)對比，準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果如表5所示。貨架期的實(shí)測值與預(yù)測值相對誤差在-5.45～-2.95%，貨架期預(yù)測模型的準(zhǔn)確度均在94%以上，即貨架期預(yù)測模型的準(zhǔn)確性高。

表5 不同貯藏溫度下化學(xué)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型的準(zhǔn)確度驗(yàn)證

綜合分析可知，基于近紅外測定的數(shù)據(jù)建立化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均在94%以上，說明本文基于近紅外光譜結(jié)合化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)建立了良好的定溫凍藏鮰魚片貨架期預(yù)測模型，這對定溫凍藏淡水魚的貨架期預(yù)測具有重要的意義。

4 結(jié)論

1)分別在-6℃、-10℃、-14℃和-18℃凍藏鮰魚片，隨著貯藏時(shí)間延長近紅外和理化分析測定的TVB-N、TBA、TMA和K值均呈現(xiàn)上升趨勢，表明凍藏鮰魚片的新鮮度逐漸下降。

2)隨著貯藏溫度升高，各指標(biāo)的反應(yīng)速率逐漸增加，符合一級化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，且各新鮮度指標(biāo)的反應(yīng)速率常數(shù)K均具有較高的相關(guān)性(R2>0.90)。

3)經(jīng)驗(yàn)證，各新鮮度指標(biāo)的貨架期預(yù)測模型期的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均在94%以上，表明基于近紅外快速測定的新鮮度數(shù)據(jù)建立的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)貨架期預(yù)測模型，能夠?qū)崿F(xiàn)對凍藏鮰魚片進(jìn)行可靠的預(yù)測。