乳品中常見過敏原特征多肽的篩查及制備應(yīng)用*

雷 雯， 徐增益， 陳燕秋

(上海化工研究院有限公司/上海市穩(wěn)定同位素檢測及應(yīng)用研發(fā)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺 上海 200062)

乳和乳制品是人體重要的蛋白質(zhì)來源，是營養(yǎng)健康的重要保證，其中乳蛋白是最有營養(yǎng)價值的部分，包括乳清等物質(zhì)[1-4]。β-乳球蛋白是乳清中的主要蛋白質(zhì)，基本存在于所有牛類的乳汁中，也是市售乳品中的一種物質(zhì)，其在牛奶中含量較高，占奶類中所有蛋白質(zhì)的7%～12%[5-7]。但β-乳球蛋白又是乳品中主要的過敏原，其次為α-乳球蛋白[8]。β-乳球蛋白在牛科動物中屬于免疫球蛋白，在大量動物體試驗中發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白的水解物質(zhì)或某些片段能夠起到降膽固醇和抗氧化的作用。不過，該物質(zhì)對于嬰幼兒卻是“威脅”。經(jīng)統(tǒng)計，β-乳球蛋白極易導(dǎo)致嬰幼兒出現(xiàn)過敏癥狀，因為嬰幼兒消化系統(tǒng)發(fā)育不完全，β-乳球蛋白一進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)就會被判定為病原，從而誘發(fā)免疫反應(yīng)。此外，影響牛乳及乳蛋白的因素有很多，產(chǎn)地、土壤元素含量等都能對飼草造成影響，進(jìn)而對牛乳及乳蛋白造成差異[9-10]，因此開展有關(guān)β-乳球蛋白檢測方法的研究是行業(yè)的迫切需要[11-14]，更是對嬰幼兒健康的保證。

目前，針對食品過敏還未研究出特效療法，乳品過敏患者只能謹(jǐn)慎防止攝入含有過敏原的食品。國外針對乳品過敏原β-乳球蛋白的準(zhǔn)確定量已有了一定的研究[13,15-16]，但國內(nèi)還鮮有報道。本文主要對過敏原β-乳球蛋白的特征肽段進(jìn)行初步篩查，篩選出較為穩(wěn)定的IDALNENK作為特征多肽，并制備出內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)，可應(yīng)用在市場上常見乳品中β-乳球蛋白的檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-2020型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司；Milli-Q型純水機(jī)，德國Merck公司；1 000 μL移液槍、XP205型分析天平，瑞士梅特勒公司；TGL-16aR型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；冰箱、熱鼓風(fēng)恒溫儀，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

胰蛋白酶和β-乳球蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%)標(biāo)準(zhǔn)品，美國SIGMA公司；碳酸氫銨、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、甲酸(色譜級)、乙腈(色譜級)，國藥集團(tuán)上海有限公司。

β-乳球蛋白特征肽段IDALNENK和內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)均由上海化工研究院有限公司合成；純牛奶購自超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

β-乳球蛋白特征多肽標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1 mmol/L)：稱取β-乳球蛋白特征肽段IDALNENK固體適量，用50 mmol/L NH4HCO3溶液溶解。梯度稀釋配制成濃度為1、5、10、20、50、80、100 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)對照溶液。

精密稱取內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK適量，用水配制成2 mmol/L儲備溶液在-80 ℃凍存。臨用前配制成0.1 mmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品溶液的制備

精密量取牛奶1 mL，用50 mmol/L NH4HCO3稀釋至100 mL。取200 μL的樣品(稀釋后的乳制品、系列標(biāo)準(zhǔn)對照溶液)，加入0.1 mmol/L內(nèi)標(biāo)物溶液20 μL混勻。隨后加入50 mmol/L二硫蘇糖醇溶液200 μL，在熱鼓風(fēng)恒溫儀中于70 ℃反應(yīng)60 min，取出后冷卻至室溫，加入100 mmo/L碘乙酰胺溶液200 μL，置于暗處在30 ℃反應(yīng)30 min。再加入1 g/L胰蛋白酶溶液200 μL，在37 ℃反應(yīng)20 h，最后加入10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液200 μL，室溫靜置60 min終止反應(yīng)。離心取上清液凍干，加入0.1%甲酸溶液200 μL復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后，移至液相瓶中待測。

1.4 內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的制備

采用固相合成法(見圖1)制備內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)，然后對其進(jìn)行純化，計算并分析該內(nèi)標(biāo)物的同位素豐度、化學(xué)純度。

圖1 特征多肽的固相合成路線

1.5 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱：Shimadzu C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相A：0.1%甲酸溶液。流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。流量：1.0 mL/min。柱溫：35 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫：初始B相為10%，保持3 min；在8.0 min內(nèi)線性升至30%；然后0.5 min內(nèi)B相線性升至90%，保持2.0 min；之后在0.5 min內(nèi)，B相降至10%的初始梯度條件，平衡2.0 min后開始下一個進(jìn)樣程序，總洗脫時間16 min。

電噴霧正離子模式：ESI+。質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描，特征多肽IDALNENK的質(zhì)荷比(m/z)為459/803，內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK的m/z為462.5/810。毛細(xì)管電壓：3.5 kV。鞘氣流量：13 mL/min。離子傳輸管溫度：275 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 特征多肽的篩查

通過蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫UniProt可獲得β-乳球蛋白(ID：P02754)的氨基酸序列，導(dǎo)入酶解模擬軟件Skyline模擬β-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解。由于β-乳球蛋白受熱或者烘烤時易發(fā)生成環(huán)、交聯(lián)或者氧化等反應(yīng)，選擇的特征多肽若不夠穩(wěn)定，將會影響定性和定量結(jié)果。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，酶解成為該領(lǐng)域較為成熟的技術(shù)，酶解技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析軟件在蛋白質(zhì)組學(xué)中有著舉足輕重的地位。因此，在選取特征多肽時，存在漏切位點、有NXS/T的糖基化基序、易成環(huán)、易氧化、存在修飾的多肽一般不作為特征多肽的備選，從而確保特征多肽的穩(wěn)定性。經(jīng)此特定條件篩選的4條多肽見表1。

表1 β-乳球蛋白篩選后的理論酶解多肽

2.2 特征多肽的選擇

為便于乳品定量檢測并降低檢測成本，確定1條穩(wěn)定性強(qiáng)和抗干擾性能優(yōu)越的多肽作為β-乳球蛋白的特征多肽，對表1篩選出的4條多肽進(jìn)行了試驗探索。對同一個β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的酶解溶液(進(jìn)完樣儲存于4 ℃的冰箱中)，每隔6 h進(jìn)樣測定，試驗結(jié)果表明：LIVTQTMK、IDALNENK、VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK這4條多肽在0～24 h偏移較小(見圖2)；而在24～48 h，多肽LIVTQTMK含量明顯大幅下降，相比于其他3條多肽的穩(wěn)定性較差。

為考察4條多肽的抗干擾性能，取21份β-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液分成7組，每組3份平行樣，分別酶解4、6、8、12、16、20、24 h，按照1.3對樣品酶解后進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。

由圖3可知：在酶解時間超過10 h后，多肽IDALNENK的含量已趨于穩(wěn)定；隨著酶解時間的延長，酶的自切產(chǎn)物不斷增多，導(dǎo)致VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK在質(zhì)譜中的響應(yīng)不斷升高，表明酶的自切產(chǎn)物對這2條多肽有增益效果，呈現(xiàn)出增長趨勢；而對于LIVTQTMK來說，酶的自切產(chǎn)物對其具有抑制作用，導(dǎo)致其含量呈現(xiàn)降低趨勢。因此，多肽IDALNENK的抗干擾性能強(qiáng)于其他3條多肽。

結(jié)合多肽穩(wěn)定性和抗干擾性的比較，選擇穩(wěn)定性和抗干擾性都較為優(yōu)越的多肽IDALNENK作為特征肽段。

2.3 IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)同位素豐度及化學(xué)純度分析

化學(xué)純度和同位素豐度是衡量同位素內(nèi)標(biāo)的關(guān)鍵，一般化學(xué)純度≥98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、同位素豐度≥98%是優(yōu)異的同位素內(nèi)標(biāo)，可應(yīng)用于復(fù)雜樣本的定量中。

2.3.1 同位素豐度分析

將合成的IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)稀釋后，進(jìn)行同位素豐度6次平行測定，通過特征離子質(zhì)量簇，計算得出IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的平均同位素豐度為99.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.11%，同位素豐度指標(biāo)超過98%。

2.3.2 化學(xué)純度分析

內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)市面上并無標(biāo)準(zhǔn)品，合成過程中引入的雜質(zhì)均為肽段，因此采用高效液相色譜法檢測后的面積歸一化來進(jìn)行化學(xué)純度的衡量。內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的高效液相色譜圖見圖4。

圖4 內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的高效液相色譜圖

由圖4可知，除了2號主峰外，還有2個小雜峰，具體占比見表2。

表2 IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)化學(xué)純度檢測的原始數(shù)據(jù)

純化后的內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)經(jīng)面積歸一化所得純度為99.11%，純度較高。從儲備液中平行取出6份樣品進(jìn)行化學(xué)純度檢測，平均化學(xué)純度達(dá)到98%以上，純度較高。

根據(jù)化學(xué)純度和同位素豐度的檢測結(jié)果可知，化學(xué)純度和同位素豐度指標(biāo)均可滿足對內(nèi)標(biāo)物的要求。

2.4 應(yīng)用

在市場上購買3種不同廠商生產(chǎn)的奶品，各取6份樣品，按1.3的方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)樣分析，內(nèi)標(biāo)法計算結(jié)果，β-乳球蛋白的測定結(jié)果見表3。

表3 內(nèi)標(biāo)法測定3種奶品中β-乳球蛋白含量

通過建立的同位素稀釋質(zhì)譜法測定3種奶品中β-乳球蛋白的含量，測定值的RSD<6%。不同廠家生產(chǎn)的乳品中β-乳球蛋白的含量差異不大。

3 結(jié)語

本文采用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，結(jié)合具體試驗篩選出乳品主要過敏原β-乳球蛋白的特征多肽IDALNENK，該肽段穩(wěn)定性好，抗干擾性能強(qiáng)。對制備的內(nèi)標(biāo)物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)進(jìn)行化學(xué)純度和同位素豐度的檢測，同位素豐度>98%，化學(xué)純度>98%，滿足同位素稀釋質(zhì)譜法準(zhǔn)確定量的要求。將該內(nèi)標(biāo)物應(yīng)用于奶品中β-乳球蛋白的測定，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確。