侵染湖北圓葉牽牛的甘薯曲葉病毒分子鑒定及遺傳進(jìn)化分析

羅婉笛 ，王鵬，莫翠萍，蔡健和，章松柏，李戰(zhàn)彪

（1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控湖北省工程技術(shù)研究中心，湖北 荊州 434025；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007）

【研究意義】雙生病毒（Geminiviridae）是一類單鏈環(huán)狀DNA 病毒，病毒粒體為雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)，包裹1 條或2 條單鏈環(huán)狀基因組DNA，長(zhǎng)度為2.5～3.0 kb［1］。雙生病毒主要侵染雙子葉植物，可危害棉花、甘薯、番茄、煙草等多種經(jīng)濟(jì)作物［2］。雜草是其重要的中間寄主，在雙生病毒的重組及進(jìn)化過程中起著重要作用，同時(shí)，雜草寄主也為雙生病毒的蔓延擴(kuò)散提供重要中間過渡［3-4］。因此，監(jiān)測(cè)雜草上的雙生病毒對(duì)作物雙生病毒的防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雙生病毒根據(jù)其基因組特征、寄主范圍及傳播媒介等特征被劃分為14 個(gè)屬：分別為菜豆金色黃花葉病毒屬（Begomovirus）、玉米線條病毒屬（Mastrevirus）、曲項(xiàng)病毒屬（Curtovirus)、番茄偽曲項(xiàng)病毒屬（Topocuvirus)、甜菜曲項(xiàng)病毒 屬（Becurtovirus）、蕪菁曲項(xiàng)病毒屬（Turncurtovirus）、畫眉草病毒屬（Eragrovirus）、葡萄紅斑病毒屬（Grablovirus）、大戟小刺潛伏病毒屬（Capulavirus）和5 個(gè)新屬：Citlodavirus、Maldovirus、Mulcrilevirus、Opunvirus和Topilevirus，其中，菜豆金色黃花葉病毒屬（Begomovirus）是最具經(jīng)濟(jì)重要性的一個(gè)病毒屬，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)該屬病毒至少有445種［5-6］。甘薯雙生病毒（sweepoviruses）是侵染甘薯的菜豆金色黃花葉病毒屬的總稱，已報(bào)道有14 種可侵染甘薯，而侵染我國甘薯的至少有10種［7］，甘薯曲葉病毒（Sweet Potato Leaf Curl Virus，SPLCV）是其中一個(gè)重要種［8］。由SPLCV 引起的甘薯曲葉病是限制世界甘薯生產(chǎn)的主要病毒病害之一，該病20 世紀(jì)80 年代在中國臺(tái)灣、日本等地區(qū)和國家甘薯上發(fā)現(xiàn)，目前已遍及美洲、非洲、歐洲和亞洲［9］。在我國，SPLCV 已在遼寧［10］、廣東［11］、福建［12］、江蘇［13］、云南［14］和湖南［15］等地甘薯或牽?；ㄉ系玫借b定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甘薯是湖北重要的糧食作物，病毒病的肆虐嚴(yán)重危害甘薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。據(jù)報(bào)道，侵染湖北甘薯的雙生病毒主要有甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet Potato Feathery Mottle Virus，SPFMV）、甘薯褪綠矮化病毒（Sweet Potato Chlorotic Stunt Virus，SPCSV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）和佐治亞甘薯曲葉病毒（SPLCGV）等4種［16］，但這些病毒在湖北的發(fā)生流行規(guī)律仍不清楚。2021年9 月，課題組在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，湖北荊州的圓葉牽牛表現(xiàn)黃脈、葉片卷曲等疑似雙生病毒的典型癥狀，而明確其病原將為該病的防治提供理論支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過分子生物學(xué)手段，對(duì)疑似雙生病毒侵染的圓葉牽牛進(jìn)行檢測(cè)、鑒定，明確引發(fā)該類癥狀的病毒病原，并利用分段克隆、序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析等方法獲得相關(guān)病毒病原的全基因組序列和遺傳進(jìn)化規(guī)律，研究結(jié)果將為雙生病毒的綜合防控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021 年9 月從湖北省荊州市市郊田間采集表現(xiàn)黃脈、葉片卷曲等疑似雙生病毒典型癥狀的圓葉牽牛植株葉片，葉片樣品經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 植物葉片總DNA 的提取

采用CTAB法［17］提取圓葉牽牛總DNA：取100 mg 葉片樣品于液氮中研磨成粉末，加入65 ℃預(yù)熱的CTAB 緩沖液，然后分別加入氯仿-異戊醇（24 ∶1）、異丙醇進(jìn)行抽提，沉淀用75%無水乙醇洗滌2 次，最后將DNA 沉淀溶解于50 μL的ddH2O 中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 檢測(cè)

利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的通用引物PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′，PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′［18］，以圓葉牽牛葉片總DNA 為模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系為24 μL：0.5 μL DNA模板，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，12 μL 2×HiFiTaqPCR StarMiX，ddH2O 補(bǔ)足至24 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)36 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

菌落PCR 反應(yīng)體系為12 μL：上游和下游引物M13-47F/M13-47R（10 μmol/L）各0.5 μL，6 μL 2×HiFiTaqPCR StarMiX，ddH2O 5 μL，滅菌槍頭挑取單菌落作為模板溶解于PCR 反應(yīng)體系中。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)36 次；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 圓葉牽牛中菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的全基因組序列克隆

參考NCBI 已經(jīng)登錄的甘薯曲葉病毒（SPLCV）全基因序列（登錄號(hào)KY783941），設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增SPLCV 基因序列的特異PCR 引物SPLCV-1F：5′-TTCGCGGAGATTTCATCCCTATG-3′，SPLCV-R：5′-GCAACAGTGCTTGGTATAACGTC-3′；SPLCV-2F：5′-TACAGTTGGATTGCCAGTCCTTC-3′，SPLCV-2R：5′-GTGGGTTCTGCAAAGGATCCCAC-3′。反應(yīng)體系為24 μL：0.5 μL DNA 模板，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，12 μL Taq 酶（2×HiFiTaqPCR StarMiX），ddH2O 補(bǔ)足至24 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行切膠純化。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA 凝膠回收試劑盒（OMEGA）回收，回收純化后的PCR 產(chǎn)物連接至pMD19-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取菌落，經(jīng)菌落PCR 鑒定后，選取陽性克隆送武漢華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。菌落PCR 反應(yīng)體系為12 μL：上游和下游引物M13-47F、M13-47R（10 μmol/L）各1.0 μL，6 μL 2×HiFiTaqPCR StarMiX，ddH2O 4 μL，滅菌槍頭挑取單菌落作為模板溶解于PCR 反應(yīng)體系中。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，循環(huán)36 次；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

測(cè)序所得的序列采用DNASTAR Lasergene 7.1 軟件進(jìn)行拼接，利用DNAMAN 和DNASTAR Lasergene 7.1 預(yù)測(cè)病毒基因組序列的開放閱讀框（ORF），利用SDT 軟件對(duì)序列的核苷酸相似性進(jìn)行分析，利用MEGA 7.0 最大似然法（Maximum Likelihood Estimation,MLE）構(gòu)建進(jìn)化樹，步值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病株癥狀

2021 年9 月在湖北省荊州市市郊田間發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為黃脈、葉片卷曲等疑似雙生病毒典型癥狀的圓葉牽牛植株，其發(fā)病癥狀見圖1。

圖1 SPLCV 侵染的圓葉牽牛癥狀Fig.1 Symptoms of Ipomoea purpurea (L.) infected by SPLCV

2.2 圓葉牽牛中菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的PCR 檢測(cè)結(jié)果

利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒通用引物（PA、PB）對(duì)圓葉牽牛葉片總DNA 進(jìn)行擴(kuò)增［19］，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，從染病的圓葉牽?？侱NA 中擴(kuò)增出一條363 bp 的目的DNA 片段，健康圓葉牽牛總DNA未見特異擴(kuò)增。將目的PCR條帶回收、克隆并進(jìn)行序列測(cè)定［20］，所得序列在NCBI 上使用BLASTn 工具進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得序列與GenBank 上已報(bào)道的甘薯曲葉病毒各分離物的相似性在94%～97%之間，其中與甘薯曲葉病毒湖南分離物（GenBank 登錄號(hào)：KY783941）的部分核苷酸序列相似性最高，達(dá)到97.52%。表明檢測(cè)陽性的圓葉牽牛葉片樣品受到了雙生病毒的侵染，其病原可能是甘薯曲葉病毒（SPLCV）。

圖2 SPLCV 侵染的圓葉牽牛葉片樣品PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR detection results of Ipomoea purpurea (L.)leaf samples infected by SPLCV

2.3 湖北圓葉牽牛SPLCV 基因組全序列克隆及分析

為了獲得圓葉牽牛中菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的全長(zhǎng)基因組，以圓葉牽牛葉片總DNA 為模板，利用特異性引物SPLCV-1F/SPLCV-1R、SPLCV-2F/SPLCV-2R 分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析［21］，結(jié)果（圖3）顯示，從圓葉牽牛葉片總DNA 中獲得兩條大小分別為1 613 bp 和1 260 bp的PCR 產(chǎn)物條帶，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD19-T 載體上，挑選陽性克隆子進(jìn)行序列測(cè)定，所得序列經(jīng)拼接后共獲得2 827 bp的有效序列，使用DNAMAN 對(duì)所得序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所得序列含有AV1、AV2、AC1、AC2、AC3 和AC4 等6 個(gè)開放閱讀框，其中病毒鏈編碼AV2（125～469 nt）和AV1（294～1058 nt）兩個(gè)ORF，互補(bǔ)鏈編碼AC1（1580～2674 nt）、AC2（1225～1671 nt）、AC3（1074～1508 nt）和AC4（2260～2517 nt）4 個(gè)ORF。

圖3 SPLCV 基因序列PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR detection electropherogram results of SPLCV gene sequence

將本研究所得序列與GenBank 中已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的序列與GenBank 中SPLCV 各分離物的核苷酸相似性均在91%以上，其中與SPLCV 湖南分離物（GenBank登錄號(hào)：KY783941）、韓國分離物（GenBank 登錄號(hào)：HM754637）和韓國另一分離物（GenBank登錄號(hào)：HM754641）的核苷酸序列相似性分別為97.52%、96.01% 和95.66%。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)對(duì)菜豆金色黃花葉病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)［22］，病毒DNA-A 的核苷酸相似性＞ 91%則認(rèn)為是同種病毒，因此，侵染湖北圓葉牽牛的雙生病毒為SPLCV，命名為SPLCV-HB（GenBank 登錄號(hào)：OM287440）。選取SPLCV 不同分離物進(jìn)一步利用SDT 軟件進(jìn)行核苷酸相似性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，本研究所獲得的SPLCV-HB 分離物的核苷酸序列與用于分析的各SPLCV 分離物的核苷酸相似性大部分在94%～99%之間，但與SPLCV -spain 分離的核苷酸相似性僅為91%，從圖4 可以看出，所選取的SPLCV 的分離物與SPLCV-spain 分離物均具有較低的核苷酸相似性。

圖4 SPLCV 湖北分離物與其他SPLCV 分離物相似性比對(duì)結(jié)果Fig.4 Similarity comparison of SPLCV Hubei isolate and other SPLCV isolates

2.4 SPLCV-HB 分離物的進(jìn)化樹分析

為分析SPLCV-HB 分離物與已報(bào)道的SPLCV各分離物的親緣關(guān)系，利用MEGA 7.0 將本研究獲得的SPLCV-HB 序列與20 個(gè)SPLCV 分離物序列采用最大似然法（MLE）對(duì)SPLCV 構(gòu)建進(jìn)化樹。從進(jìn)化樹圖（圖5）可以看出，一共分為兩個(gè)大支，本研究得到的SPLCV-HB 分離物（GenBank 登錄號(hào)：OM287440）與國內(nèi)和國外部分地區(qū)處于同一分支，其中與SPLCV湖南分離物（GenBank登錄號(hào)：KY783941）聚在同一個(gè)小分支，表明與湖南分離物有較近親緣關(guān)系，與之聚集在同一分支的還有SPLCV 韓國各分離物和江蘇分離物，這些分離物均來自東亞地區(qū)，而另一大的分支里有SPLCV 西班牙分離物、SPLCV 巴西分離物以及SPLCV 秘魯分離物等，也有SPLCV 美國分離物與SPLCV 韓國分離物，但絕大多數(shù)分離物來自南美地區(qū)。

圖5 基于SPLCV 湖北分離物與其他20 個(gè)分離物的全基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SPLCV Hubei isolate and other 20 isolates based on complete gene sequence

3 討論

本研究對(duì)湖北省荊州市市郊表現(xiàn)典型黃脈癥狀的圓葉牽牛進(jìn)行鑒定后證實(shí)，圓葉牽牛植株受到雙生病毒的侵染，進(jìn)一步利用分子克隆獲得侵染圓葉牽牛的雙生病毒的全基因組序列，該序列具備菜豆金色黃花葉病毒屬的典型特征，且與GenBank 已登錄的SPLCV 各分離物的核苷酸相似性均在91%以上，其中與SPLCV-HuNan（GenBank 登錄號(hào)：KY783941）的相似性最高，達(dá)97.52%，根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)對(duì)菜豆金色黃花葉病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)［22］，確定侵染湖北圓葉牽牛的雙生病毒為SPLCV，本研究是SPLCV 侵染湖北牽牛花的首次報(bào)道。

通過進(jìn)化樹進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SPLCV-HB 分離物與國外和國內(nèi)的部分地區(qū)處于同一分支，其中與SPLCV 湖南分離物處于同一個(gè)小分支，說明它們之間有較近的親緣關(guān)系，另外本研究分離物與SPLCV 韓國各分離物和江蘇分離物處于一個(gè)分支，分析發(fā)現(xiàn)與本研究分離物（GenBank 登錄號(hào)：OM287440）聚集在一個(gè)分支的SPLCV 各分離物大多來自東亞地區(qū)，而沒有與本研究聚集在一起的另一分支則大多來自南美地區(qū)，這些結(jié)果表明SPLCV 的分布具有地域差異性。

SPLCV 是限制世界甘薯生產(chǎn)的主要病毒病害之一，該病早在20 世紀(jì)80 年代就在中國臺(tái)灣、日本等地區(qū)和國家甘薯上發(fā)生，目前已遍及美洲(美國、秘魯、巴西和阿根廷）、非洲（肯尼亞）、歐洲（西班牙和意大利）和亞洲（日本、韓國、中國和印度）［23-25］。在我國，SPLCV 已在遼寧、廣東和福建的甘薯、江蘇的圓葉矮牽牛、云南的銳葉牽牛和湖南的牽?；ǖ戎参锷戏蛛x鑒定到SPLCV［26］?？梢奡PLCV 地理分布和寄主范圍在不斷擴(kuò)展。2013 年，Zhang 等從湖北圓葉牽牛上分離鑒定到佐治亞甘薯曲葉病毒（SPLCGV）［27］，該病毒分離物（GenBank 登錄號(hào)：KF769447）與河北分離物（GenBank 登錄號(hào)：JX448368）的序列相似性較高。而本研究又從圓葉牽牛中分離得到SPLCV，該結(jié)果證實(shí)，牽?；赡苁嵌喾N甘薯病毒的中間寄主，應(yīng)該引起重視，采取有效的防治措施防范甘薯病毒通過圓葉牽牛進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延。

4 結(jié)論

本研究利用雙生病毒簡(jiǎn)并引物證實(shí)湖北荊州表現(xiàn)黃脈癥狀的圓葉牽牛受到雙生病毒侵染，通過分段克隆獲得病毒分離物的全基因序列，在GenBank 中進(jìn)行Blast 分析證實(shí)該病毒分離物為甘薯曲葉病毒的一個(gè)分離物，命名為SPLCV-HB；遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，甘薯曲葉病毒湖北分離物與甘薯曲葉病毒湖南分離物處于同一分支，說明兩者具有較近的親緣關(guān)系。甘薯曲葉病毒主要通過煙粉虱和種苗帶毒進(jìn)行傳播與擴(kuò)散，而本研究的病毒分離物可能來自于湖南。本研究是甘薯曲葉病毒在湖北的首次報(bào)道，今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該類病毒監(jiān)測(cè)。