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    豆甾醇通過抑制鈣離子內(nèi)流抑制大鼠前列腺間質(zhì)細胞收縮*

    2022-12-02 09:12:38馬亞宣吳垚鋅邵瑞苗琳
    天津中醫(yī)藥 2022年11期

    馬亞宣 ,吳垚鋅 ,邵瑞 ,苗琳

    (1.天津中醫(yī)藥大學組分中藥國家重點實驗室,天津 301617;2.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院,天津 301617;3.方劑學教育部重點實驗室,天津 301617)

    良性前列腺增生(BPH)是老年男性常見的泌尿系統(tǒng)疾病。臨床上BPH患者表現(xiàn)為尿頻、尿急、尿不盡等下尿路癥狀[1](LUTS),嚴重影響老年男性的生活質(zhì)量。前列腺腺體由上皮與間質(zhì)兩部分組成,其中間質(zhì)又包括平滑肌細胞和成纖維細胞兩種主要的細胞類型[2]。在BPH發(fā)生發(fā)展的過程中,前列腺體積增大,間質(zhì)中的平滑肌細胞所占比例亦會增加[2],并且伴隨有平滑肌細胞的過度收縮現(xiàn)象[3]。VK Lin等[4]指出,具有收縮活性并能夠增殖的平滑肌細胞存在于增生進程的早期,在增生晚期大多數(shù)平滑肌細胞不再具有增殖活性。這些病理改變最終導(dǎo)致尿道梗阻和膀胱功能的代償性改變[5],引起LUTS。臨床上,多采用α受體阻滯劑聯(lián)合抗雄、抗雌藥物組合[6],一方面抑制前列腺體積增大,另一方面調(diào)節(jié)平滑肌細胞的過度收縮。

    平滑肌細胞多呈梭型,其肌漿中含有的肌動蛋白(Actin)和肌球蛋白(Myosin)是平滑肌收縮系統(tǒng)的重要組成部分。當平滑肌細胞收縮時,相鄰的Myosin以相反方向沿著Actin運動,通過相互作用而引起細胞收縮[7]。前列腺平滑肌的收縮主要是由細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體α-腎上腺素受體(α-Adrenoceptor)介導(dǎo),激活的 α-Adrenoceptor可以分別通過鈣離子(Ca2+)、蛋白激酶C(PKC)和Rho激酶介導(dǎo)的3條信號通路誘導(dǎo)前列腺平滑肌收縮[8]。其中,Ca2+信號通路在調(diào)控前列腺平滑肌收縮中發(fā)揮了重要的作用。細胞內(nèi)Ca2+水平的升高可以增強前列腺平滑肌細胞的興奮性和收縮力[9]。目前已知,細胞內(nèi)Ca2+的釋放和細胞外Ca2+的內(nèi)流均可使Ca2+濃度增加,前者主要是通過細胞內(nèi)的肌漿網(wǎng)釋放Ca2+參與肌肉收縮;后者則主要通過細胞膜上的Ca2+通道使Ca2+流入細胞內(nèi)[10]。因此,調(diào)節(jié)前列腺平滑肌細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流抑制前列腺平滑肌的過度收縮在BPH的治療中具有重要意義。

    豆甾醇又稱豆固醇,是一種植物甾醇,其廣泛存在于各類植物中,在植物油中含量最高,其次是大豆、谷物和堅果。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn),豆甾醇具有抗炎[11]、抗氧化[12]、抗癌[13]、降低膽固醇[14]等多種藥理學作用,是一類極具研發(fā)價值的藥用植物甾醇。結(jié)構(gòu)式見圖1。近年來,有臨床研究證實,植物甾醇有抑制前列腺肥大和改善膀胱收縮的效果,對尿頻、夜間尿頻、膀胱受迫、排尿障礙癥狀有明顯的改善效果[15]。但是,豆甾醇對前列腺增生和前列腺平滑肌收縮的影響尚未見報道。本文研究豆甾醇對大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞收縮功能的影響,并進一步研究該作用是否與鈣離子信號通路有關(guān),旨在闡明豆甾醇調(diào)控前列腺平滑肌舒縮作用的分子機制,為豆甾醇作為治療前列腺增生的候選藥物提供實驗依據(jù)。

    圖1 豆甾醇的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of stigmasterol

    1 實驗動物與材料

    1.1 動物 Wistar大鼠,雄性,體質(zhì)量180~200 g,購于北京維通利華實驗動物有限公司。許可證號:SCXK(京)2019-0010。

    1.2 藥物 豆甾醇(批號:83-48-7)購自成都埃法生物科技有限公司。

    1.3 主要儀器與試劑 細胞CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo scientific公司;離心機購自德國Eppendorf公司;超凈工作臺購自中國海爾股份有限公司;酶標儀購自北京海天友誠科技有限公司;實時定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司;Nikon倒置顯微鏡購自北京恒三江儀器銷售有限公司;臺式震蕩培養(yǎng)箱購自伊孚森(中國)生物技術(shù)有限公司;流式細胞儀FACS Calibur購自美國BD biosciences公司;熒光共聚焦顯微鏡購自美國BioTek公司。

    胎牛血清(FBS,貨號:F95551243)購自美國Invigentech公司;青鏈霉素混合液(PS,貨號:2033117)、0.25%的胰蛋白酶 (貨號:2133226)和DMEM培養(yǎng)液(貨號:2050238)購自以色列BI公司;鬼筆環(huán)肽(貨號:YP0059)購自蘇州宇恒生物科技有限公司;CCK-8檢測試劑盒(貨號:C6005)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號:CK12)購自日本Dojindo Lab公司;鼠尾膠原蛋白溶液(貨號:354236)購自美國Corning公司;RNA提取試劑盒(貨號:19211ES60)購自天津翌圣生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:AT341-02)購自北京全式金生物科技有限公司;實時熒光定量核酸擴增系統(tǒng)(qPCR)試劑盒(貨號:A6001)購自美國 Promega公司;轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β1)(貨號:96-100-21-10)購自派普泰克生物科技(蘇州)有限公司;α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(貨號:BM0002)購自博士德生物;GAPDH抗體(貨號:60004-1-Ig)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;極敏型ECL發(fā)光液(貨號:KF003)購自英國Affinity公司;氯化乙酰膽堿(貨號:A6625)購自美國Sigma公司;鈣熒光探針(貨號:F8840)購自北京Solarbio科技有限公司。

    2 實驗方法

    2.1 大鼠離體前列腺間質(zhì)細胞的制備與培養(yǎng) Wistar大鼠安樂死后,仰位固定,用眼科剪和眼科鑷逐層打開大鼠腹腔,分離并取出大鼠前列腺組織,放入預(yù)冷的含青鏈霉素的1×D-Hank’s溶液中;在超凈臺上,用無菌眼科剪和眼科鑷剝離前列腺周圍脂肪和結(jié)締組織,清洗3次后用手術(shù)剪剪碎前列腺組織;加入 5 mL 的 1×D-Hank’s溶液,1 000 r/min 常溫離心3 min(離心半徑8.6 cm,下同);沉淀加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶,于37℃搖床中消化60 min;再加入4 mL含15%FBS和1%PS的DMEM培養(yǎng)液終止消化,用70μm的篩網(wǎng)過濾混懸液3次,1000r/min常溫離心8 min;棄上清,沉淀用4 mL含15%FBS和1%PS的DMEM培養(yǎng)液重懸,加入鋪有鼠尾膠原(25 μg/mL)的 25 cm2培養(yǎng)瓶中,置 5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h。待細胞生長至80%融合時,傳代1次。

    2.2 大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞表型的鑒定 大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞生長至2~3代時,以每孔1×105個細胞鋪至24孔板,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次,4%多聚甲醛冰上固定細胞15 min,棄去多聚甲醛,PBS洗3次,室溫下用0.5%Triton X-100透化10 min,PBS洗3次后,用鬼筆環(huán)肽染液室溫孵育20 min。PBS 洗 3 次,加入 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液室溫孵育20 min,熒光顯微鏡觀察染色情況。

    2.3 細胞增殖和細胞毒性檢測 取對數(shù)生長期的大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞,以8×103/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。棄掉培養(yǎng)液,加入不同濃度的豆甾醇(0.1、0.5、1、5、10 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。檢測細胞增殖時,按照CCK-8試劑盒說明書加入CCK-8溶液10 μL/孔,孵育1 h后,用酶標儀在450 nm波長處測定各孔吸光度值。檢測細胞毒性時,按照LDH試劑盒說明書每孔加100 μL LDH工作液,避光孵育15 min,用酶標儀在490 nm波長處測定各孔吸光度值,確定豆甾醇的最大無毒作用劑量。

    2.4 膠原凝膠收縮實驗 取對數(shù)生長期的大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞,1×D-Hank’s洗兩遍,用0.25%的胰蛋白酶消化后,用含鼠尾膠原的不含/或含血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞,制備細胞終濃度為6×104個/mL、鼠尾膠原濃度為1 mg/mL的細胞-膠原混合物,24孔板中每孔加500 μL,室溫下放置20 min。待膠原凝固后,分別加入DMEM、含15%FBS的DMEM或用含15%FBS的DMEM配制的豆甾醇(終濃度為 0.1、1、10 μmol/L)。輕輕分離凝膠與孔板,確保凝膠能夠在孔板內(nèi)自由移動,在加藥0 h及24 h時觀察與拍照。

    2.5 RT-PCR檢測 取3~5代的大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞,以3×105/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁,加入1 μmol/L豆甾醇繼續(xù)孵育24 h后,按照RNA提取試劑盒說明書,提取細胞RNA;用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板;使用 SYBR-Green 擴增 cDNA,通過 2-ΔΔCt法計算目的基因α-SMA和Collagen I mRNA水平的表達情況,GAPDH為內(nèi)參基因,具體引物序列如下。α-SMA:5’-GGACGTACAACTGGTATTGTGC-3’,5’-TCGGC AGTAGTCACTAAGGA-3’;CollagenI:5’-GCTCCTCT TAGGGGCCACT-3’,5’-ATTGGGGACCCTTAGGCC AT-3’,GAPDH:5’-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3’,5’-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3’。

    2.6 蛋白免疫印跡法(WesternBlot)檢測 將3~5代的大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞以每孔3×105接種至6孔板,貼壁后分別加入10 ng/mL TGF-β1或TGF-β1+1 μmol/L豆甾醇,處理48 h后棄去上清,用PBS溶液洗2次,用0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞,加入含有PMSF及蛋白酶抑制劑的預(yù)冷的RIPA裂解液,裂解細胞,冰上靜置 30 min,13 000 r/min、4 ℃離心20 min,吸取蛋白上清液用BCA法測定濃度。用Western Blot法檢測細胞中α-SMA蛋白的表達。將15 μg/孔的蛋白上樣到10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳后轉(zhuǎn)至 0.22 μm 的 PVDF膜,用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h,加入α-SMA抗體(1∶1 000稀釋),4℃過夜,用 TBST洗一抗 30 min后,加入TBST稀釋的二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h,洗膜后用化學發(fā)光試劑盒檢測化學發(fā)光。

    2.7 鈣離子濃度的檢測 大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞生長至3~5代時,以每孔6×105個細胞鋪于6孔板,37℃培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液,用HBSS溶液洗3 次,加入 1.5 μmol/L Fluo-3,AM 工作液,37 ℃孵育20 min后,加入2.5 mL含有1%FBS的HBSS溶液,37℃孵育40 min,棄去細胞上清液,HEPES溶液洗3次,用0.25%的胰蛋白酶消化,用HEPES溶液重懸細胞并計數(shù),用3×105個/mL的濃度上流式細胞儀檢測。流式細胞儀參數(shù)設(shè)置見表1。

    表1 流式細胞儀參數(shù)設(shè)置信息Tab.1 Parametersin flow cytometry assay

    2.8 統(tǒng)計方法 使用Graphpad Prism 8.0.1軟件分析,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    3 結(jié)果

    3.1 大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞的培養(yǎng)與鑒定 鬼筆環(huán)肽可以特異性與平滑肌細胞的標記蛋白F-肌動蛋白(F-actin)結(jié)合,因此用鬼筆環(huán)肽染色法可以鑒定平滑肌類型細胞。培養(yǎng)的大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞經(jīng)鬼筆環(huán)肽染色后可見F-actin高表達(綠色熒光);Image J統(tǒng)計F-actin陽性染色細胞比例約為79.29%,提示經(jīng)原代培養(yǎng)的大鼠前列腺間質(zhì)細胞多為平滑肌細胞。見圖2。

    圖2 大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞的鑒定Fig.2 Identification of smooth muscle cells in rat primary prostatic stromal cells

    3.2 豆甾醇對大鼠原代前列腺間質(zhì)細胞活力的影響 不同濃度的豆甾醇處理前列腺間質(zhì)細胞后,用CCK8法檢測藥物對細胞活力的影響,結(jié)果顯示各給藥組OD450數(shù)值與對照組相比無顯著性差異(見圖3A);進一步檢測不同濃度的豆甾醇對前列腺間質(zhì)細胞分泌LDH的影響,結(jié)果顯示各給藥組OD490數(shù)值與對照組相比亦無明顯增加,反而在0.1、0.5和1 μmol/L濃度時可以抑制LDH的生成(見圖3B),提示濃度低于10 μmol/L時,豆甾醇對前列腺間質(zhì)細胞的活力無明顯抑制作用,且無毒性。

    圖3 豆甾醇對大鼠前列腺間質(zhì)細胞活力和毒性的影響(±s,n=6)Fig.3 Effects of stigmasterol on cell viability and toxicity in rat primary prostatic stromal cell(±s,n=6)

    3.3 豆甾醇抑制大鼠前列腺間質(zhì)細胞的收縮 膠原凝膠收縮實驗結(jié)果顯示,含15%胎牛血清的培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)前列腺間質(zhì)細胞的收縮,而加入豆甾醇處理24 h后收縮作用被明顯抑制。并且豆甾醇在濃度10 μmol/L時抑制作用最為明顯,抑制率為77.1%(P<0.05)。

    圖4 豆甾醇對膠原凝膠中大鼠前列腺間質(zhì)細胞收縮能力的影響(±s,n=3)Fig.4 Effect of stigmasterol on the contractility of rat prostatic stromal cells in collagen gel(±s,n=3)

    3.4 豆甾醇抑制大鼠前列腺間質(zhì)細胞中α-SMA和CollagenⅠ表達 與對照組相比,1 μmol/L的豆甾醇可以顯著抑制大鼠前列腺間質(zhì)細胞收縮功能相關(guān)的α-SMA和Collagen I mRNA水平的表達。見圖5。

    圖5 豆甾醇對大鼠前列腺間質(zhì)細胞中α-SMA和CollagenⅠmRNA 表達的影響(±s,n=3)Fig.5 Effect of stigmasterol on α-SMA and CollagenⅠmRNA expressionin rat prostatic stromal cells(±s,n=3)

    3.5 豆甾醇抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠前列腺間質(zhì)細胞中α-SMA的表達 10 ng/mL的TGF-β1可以明顯促進大鼠前列腺間質(zhì)細胞中α-SMA蛋白的表達;1 μmol/L的豆甾醇可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的前列腺間質(zhì)細胞α-SMA蛋白表達的升高。見圖6。

    圖6 豆甾醇對TGF-β1刺激的大鼠前列腺間質(zhì)細胞α-SMA表達的影響Fig.6 Effect of stigmasterol on TGF-β1 stimulated α-SMA expression in rat prostatic stromal cells

    3.6 豆甾醇抑制ACh誘導(dǎo)的大鼠前列腺間質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流 用流式細胞技術(shù)檢測大鼠前列腺間質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子濃度變化,經(jīng)ACh刺激后大鼠前列腺間質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高;豆甾醇可有效抑制ACh誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。作為對照,單獨給藥豆甾醇不會引起前列腺間質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。見圖7。

    圖7 豆甾醇對大鼠前列腺間質(zhì)細胞Ca2+濃度的影響Fig.7 Effect of stigmasterol on intracellular Ca2+concentration in rat prostatic stromal cells

    4 討論

    前列腺間質(zhì)細胞中平滑肌過度收縮是造成BPH相關(guān)LUTS的主要原因之一。本實驗觀察了豆甾醇對大鼠前列腺間質(zhì)細胞收縮作用的影響,發(fā)現(xiàn)豆甾醇可明顯抑制血清誘導(dǎo)的膠原凝膠中前列腺間質(zhì)細胞的收縮;基因表達方面,豆甾醇可以抑制本底水平以及TGF-β1誘導(dǎo)的收縮相關(guān)基因的α-SMA和CollagenⅠ的表達;進一步檢測鈣離子濃度證實豆甾醇可以抑制ACh刺激的細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。

    鈣離子信號通路與細胞收縮調(diào)控關(guān)系密切。有報道指出,前列腺中平滑肌可以通過α-Adrenoceptor打開細胞膜上的電壓依賴性鈣通道,使Ca2+內(nèi)流增加[16];與鈣調(diào)蛋白結(jié)合[17]后作用于肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK),催化肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化,引起前列腺平滑肌的收縮[8]。本研究發(fā)現(xiàn),豆甾醇抑制前列腺間質(zhì)細胞收縮以及抑制ACh誘導(dǎo)的大鼠前列腺間質(zhì)細胞鈣離子內(nèi)流。值得注意的是,PKC和Rho激酶通路亦可以促進MLC磷酸化而產(chǎn)生收縮效應(yīng)[18]。然而豆甾醇是否可以通過其他非鈣離子依賴的信號通路調(diào)節(jié)前列腺間質(zhì)細胞的收縮尚不清楚。

    植物甾醇尚無毒副作用的報道,常作為一種食品添加劑和保健食品原料進行開發(fā)、利用[19]。在歐洲傳統(tǒng)療法中常作為天然保健藥用于治療前列腺肥大癥[15]。以β-谷固醇、豆固醇、菜子固醇等為主要成分的植物甾醇廣泛存在于各種植物油、植物種子、花粉中[20]。研究顯示,植物甾醇可以通過抑制促炎因子的表達以及p38 MAPK信號通路的激活抑制大鼠慢性非細菌性前列腺炎[21]。也有臨床研究證實,β-谷甾醇具有抑制前列腺肥大、改善膀胱收縮的功效[15],但其作用機制尚未明確。目前,關(guān)于豆甾醇在前列腺疾病中的作用尚不清楚。已有的報道發(fā)現(xiàn)豆甾醇具有抗氧化、抗炎、抗癌的活性[12]。

    Li等[22]發(fā)現(xiàn),豆甾醇可以通過抑制氧化應(yīng)激相關(guān)標志物活性氧的產(chǎn)生,增加超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性發(fā)揮抗氧化作用;同時,Liang等[23]發(fā)現(xiàn)豆甾醇還可以通過減少氧化應(yīng)激和炎癥對腦缺血/再灌注損傷大鼠發(fā)揮保護作用。Ahmad等[24]發(fā)現(xiàn),豆甾醇可以通過抑制促炎細胞因子人腫瘤壞死因子α、白介素-6、白介素-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶和環(huán)氧合酶-2的表達,同時上調(diào)抗炎細胞因子白介素-10的表達發(fā)揮抗炎作用。此外,Zhao等[25]發(fā)現(xiàn)豆甾醇可以通過阻斷蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬發(fā)揮抗癌作用。在豆甾醇調(diào)節(jié)鈣離子通路方面,有報道指出[26]豆甾醇可以刺激菜豆根對鈣離子的吸收并誘導(dǎo)鈣調(diào)素的合成。李慶勇等[27]研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇可以通過上調(diào)人肝癌細胞SMMC-7721內(nèi)的鈣離子濃度,阻滯細胞周期的不同階段而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。在豆甾醇對細胞收縮的影響方面,有報道指出,豆甾醇對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠胸大動脈平滑肌細胞A7r5有顯著的抑制作用[22]。本研究首次發(fā)現(xiàn)豆甾醇可以抑制前列腺間質(zhì)細胞的收縮,降低收縮相關(guān)蛋白α-SMA和CollagenⅠ的表達,并且可以抑制ACh誘導(dǎo)的前列腺間質(zhì)細胞鈣離子濃度的升高。這些結(jié)果表明,豆甾醇可以作用于前列腺間質(zhì)細胞,抑制前列腺間質(zhì)的過度收縮,其機制與抑制鈣離子內(nèi)流有關(guān),提示豆甾醇可能通過調(diào)節(jié)前列腺間質(zhì)細胞收縮狀態(tài)而抑制BPH,是臨床治療BPH的潛在候選藥物。

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