消巖湯介導(dǎo)TNKS抑制肺腺癌細(xì)胞生長的初步探討*

韓燕燕 ，鄭旭 ，蘭福 ，李翀

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，天津 300381；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381）

肺癌是當(dāng)今世界上對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤，近年來肺腺癌發(fā)病在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。端錨聚合酶（TNKS）可通過維持端粒長度保證腫瘤細(xì)胞持續(xù)生長繁殖，研究證實TNKS在肝癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均高表達(dá)[2-4]，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TNKS有望成為特異性治療惡性腫瘤的頗有前景的新靶點。目前研究表明中藥復(fù)方消巖湯具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥，減輕化療毒副作用等功效[5-8]，結(jié)合中西醫(yī)結(jié)合治療肺腺癌思路，進一步探討消巖湯是否通過介導(dǎo)TNKS來抑制肺腺癌細(xì)胞的生長。本文采用免疫組化法檢測TNKS在肺腺癌組織中的表達(dá)情況，通過體外加入消巖湯及改變肺腺癌細(xì)胞株A549中TNKS表達(dá)檢測腫瘤細(xì)胞在增殖、DNA損傷及修復(fù)、遷移及侵襲等方面的變化，旨在為肺腺癌的治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2017年1月—2017年12月天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的37例經(jīng)兩名主任醫(yī)師確診為肺腺癌患者的癌組織和癌旁組織，本研究組織樣本的使用得到了天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑 消巖湯劑購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，主要成分包括炙黃芪30 g，郁金10 g，蘄蛇5 g，黨參15 g；兔抗人多克隆TNKS抗體（sc-8337）購自Santa Cruz生物技術(shù)公司；兔抗人γ-H2AX抗體（9718T）購自CellSignalingTechnology司；TNKS siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成（模板序列：上游引物5’-UAUCCAAGCGCUC UUCCCAAACUCCTT-3’，下游引物 5’-GGAGUUUG GGAAGAGCGCUUGGAUATT-3’）；實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自天根生化科技有限公司；同源重組（HR）修復(fù)試劑盒購自NorgenBiotek公司；細(xì)胞DNA提取試劑盒購自Thermo Fisher公司；CCK8試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)公司；SP試劑盒（SP-9001）、EDTA抗原修復(fù)液、DAB顯色試劑購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。山羊分離血清（Cat No.ZLI-9022）購自O(shè)riGene科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測 將蠟塊切成4 μm厚的切片，依次經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；高壓抗原修復(fù)后滴加3% H2O2室溫孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后滴加山羊血清，室溫封閉30 min；滴加一抗 TNKS（1∶800）、γ-H2AX（1∶500），4 ℃ 孵育過夜，DAB顯色后蘇木素復(fù)染；無水乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片、鏡檢。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組 A549細(xì)胞置于RPMI-1640完全培養(yǎng)基及梯度濃度消巖湯（0mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL）中，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，5% CO2，常規(guī)培養(yǎng)24 h。實驗分為4組，包括空白對照組：A549細(xì)胞置于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；陰性對照組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞中，6 h后用于后續(xù)實驗；TNKSsiRNA組（TNKS下調(diào)組）：細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，將TNKS siRNA轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞中，6 h后用于后續(xù)實驗；消巖湯組：用生理鹽水將消巖湯劑充分溶解，用0.22 μm過濾器滅菌，并用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3.3 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測 取出蛋白樣品，濃度測定后，按每孔20 μg上樣，按照海綿-濾紙-膠-聚偏氟乙烯（PVDF）膜-濾紙-海綿的順序進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)脫脂奶粉的TBST封閉1 h；一抗 TNKS（1∶800）4℃搖床孵育過夜；二抗（1∶40000）室溫下?lián)u床孵育1 h；最后將膜置于等體積混合的ECL A/B液中，室溫孵育2 min，化學(xué)曝光機曝光，保存曝光圖片。

1.3.4 qRT-PCR檢測 用TRIzol試劑提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。然后，對每份樣本進行3次實時PCR分析。PCR引物為TNKS上游引物CGCGTGTCTGTTGTAGAGTA，下游引物GGAGCTTGCAGATTTCATAC。擴增片段長度220bp；內(nèi)參β-actin上游引物5’-TGACGTGGA CATCCGCAAAG-3’，下游引物 5’-CTGGAAGGTGG ACAGCGAGG-3’，擴增片段長度 205 bp。

1.3.5 CCK-8實驗 將A549細(xì)胞懸液（1×109/L）按每孔100 μL體積加入96孔板中。每組6個復(fù)孔，各組細(xì)胞處理后在適當(dāng)?shù)臅r間點（24、48或72h），向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定450 nm波長處吸光度（OD）值。

1.3.6 細(xì)胞免疫熒光檢測 A549細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)80%，將其黏附到載玻片上，各組細(xì)胞處理48 h后，用4%多聚甲醛固定15min。將細(xì)胞與0.5%Triton X-100（PBS化合物）孵育20min，山羊分離血清25℃孵育30 min。然后將細(xì)胞與γ-H2AX單克隆抗體（1∶100）在4℃孵育過夜。第2天，F(xiàn)ITC共軛山羊抗小鼠抗體（1∶100）黑暗中孵育 60 min。DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min。熒光顯微鏡（×200倍）捕獲圖像。

1.3.7 同源重組DNA修復(fù)實驗 采用基于定量PCR方法的同源重組修復(fù)試劑盒檢測不同處理組細(xì)胞的同源重組DNA修復(fù)能力。在TNKS siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，再將2個pUC19質(zhì)粒（dl1和dl2）共轉(zhuǎn)染到不同細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞DNA。然后利用HR修復(fù)試劑盒中的引物對DNA進行PCR擴增。PCR的反應(yīng)條件為：3 min 95℃，然后15 s 95℃，30 s 61℃，1 min 72℃，共循環(huán)40次。

1.3.8 細(xì)胞劃痕實驗 用黑色標(biāo)記筆在6孔板背后均勻的劃橫線，將A549細(xì)胞（1×105/孔濃度）按每孔2.5 mL體積接種于該6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用無菌槍頭垂直于背后橫線劃痕，PBS沖洗3次后拍照，繼續(xù)按分組情況無血清培養(yǎng)，0、12、24、48 h同一觀察點處拍照。劃痕修復(fù)率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度。

1.3.9 Transwell實驗 將A549細(xì)胞懸液（2×105/L）200 μL加入到含有matrigel的Transwell小室的上室，同時向24孔板下室中加入500 μL的含20%血清的培養(yǎng)基。將上室放入24孔板中，24 h后，用拭子輕輕去除上室表面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定已發(fā)生穿膜的細(xì)胞，并用2.5%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野（×100）觀察細(xì)胞并計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.4 免疫組化結(jié)果判定 鏡檢顯示細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片于高倍鏡下（×400）隨機取5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。陽性細(xì)胞著色強度：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。組織化學(xué)的最終評分為陽性細(xì)胞的百分比和著色強度的相乘結(jié)果。總評分：0～3 分為陰性（-），3～6 分為弱陽性（+），6～9分為中等陽性（++），>9分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多個均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNKS蛋白在肺腺癌組織及癌旁中的表達(dá)情況 TNKS蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿，肺腺癌組織及癌旁組織陽性表達(dá)率分別為63.00%（27/37）、18.92%（7/37），與癌旁組織比較，癌組織的陽性表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 TNKS蛋白在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Protein expression of TNKS in lung adenocarcinoma tissues and adjacent tissues

2.2 qRT-PCR檢測梯度濃度消巖湯處理A549細(xì)胞后TNKS mRNA表達(dá)水平的影響 隨消巖湯濃度升高，細(xì)胞中TNKS mRNA表達(dá)水平降低。且與空白對照組相比，10 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL 消巖湯處理后細(xì)胞中TNKS mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。不同劑量消巖湯之間兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)意義，后續(xù)選擇10 mg/mL消巖湯用于實驗。

圖2 梯度濃度消巖湯處理A549細(xì)胞后TNKS mRNA的表達(dá)水平Fig.2 Expression of TNKS mRNA after treatment with gradient concentration Xiaoyan Decoction in A549 cells

2.3 Western blotting及qRT-PCR檢測TNKS的表達(dá) 與空白對照組、陰性對照組相比，TNKS siRNA組中細(xì)胞TNKS蛋白（見圖3 A、B）及mRNA（見圖3 C）表達(dá)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 Western Blot及qRT-PCR法檢測TNKS的蛋白及mRNA表達(dá)Fig.3 Protein and mRNA expressions of TNKS detected by Western Blot and qRT-PCR

2.4 不同處理組細(xì)胞的增殖影響 與空白對照組相比，48 h及72 h后，TNKS siRNA組及消巖湯組細(xì)胞增殖活性隨作用時間的延長而逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖 4。

圖4 不同處理組細(xì)胞的增殖活性Fig.4 Proliferation activity of cells in different treatment groups

2.5 γ-H2AX的表達(dá)情況 與空白對照組相比，陰性對照組γH2AX熒光表達(dá)無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與TNKS siRNA組相比，消巖湯組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與空白對照組相比，TNKS siRNA組及消巖湯組的γ-H2AX熒光表達(dá)均明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

圖5 不同處理組γ-H2AX的熒光表達(dá)情況Fig.5 Fluorescence expression of γ-H2AX in different treatment groups

2.6 同源重組DNA修復(fù)試驗 與空白對照組相比，陰性對照組的DNA修復(fù)能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；TNKS siRNA組及消巖湯組DNA修復(fù)能力表達(dá)明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖6。

圖6 不同處理組同源重組DNA修復(fù)能力Fig.6 Repair ability of homologous recombinant DNA in different treatment groups

2.7 各處理組中A549細(xì)胞遷移能力的影響 空白對照組、TNKS siRNA組、陰性對照組及消巖湯組細(xì)胞處理48 h后，各組細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（43.12±2.34）%、（8.98±0.513）%、（40.71%±3.50）%和（9.343±1.212）%，與對照組相比，TNKS siRNA 組、消巖湯組細(xì)胞遷移能力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖7A、7B。陰性對照組細(xì)胞遷移能力稍下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與TNKS siRNA組相比，消巖湯組細(xì)胞遷移能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.8 各處理組中A549細(xì)胞侵襲能力的影響 空白對照組、TNKS siRNA組、陰性對照組及消巖湯組細(xì)胞處理48 h后，各組細(xì)胞穿過小室膜發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為（66.30±6.00）、（21.00±5.30）、（69.00±7.00）和（20.70±1.50）個。結(jié)果顯示，與對照組相比，TNKS siRNA組及消巖湯組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖7C、7D。與TNKS siRNA組相比，消巖湯組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖7 不同處理組細(xì)胞遷移與侵襲能力Fig.7 Migration and invasion ability of cells in different treatment groups

3 討論

肺癌是世界癌癥病死率之首，雖然目前肺癌的病死率較以往有所下降，但因其早期發(fā)病隱匿，缺乏特異性，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已屬晚期，很難通過手術(shù)完全根治，而且腫瘤侵襲性較強，大多數(shù)肺癌患者在手術(shù)、放療或化療后不久發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，5年相對生存率極低，嚴(yán)重影響著人們的健康[9]。

中醫(yī)藥具有良好的經(jīng)濟價值，且不良反應(yīng)較少，在臨床上應(yīng)用廣泛。消巖湯是天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院以人參、郁金、夏枯草、黃芪等藥抗癌扶正、解毒祛瘀研發(fā)出的院內(nèi)制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床十余年，主要涉及肺癌、乳腺癌、肝癌等[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，消炎湯作用于肺腺癌細(xì)胞后，TNKS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且XAV939（TNKS的小分子抑制劑）可通過下調(diào)Wnt通路抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

TNKS是一種位于端粒的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，具有PARP催化域，它在端粒酶陽性細(xì)胞中過表達(dá)，可使端粒長度增加，從而影響染色體的穩(wěn)定性，使腫瘤細(xì)胞可以無限增殖。目前TNKS特異性抑制劑主要包括 G007-LK、E7449、RK-287107、NV G-631和JW55[13-15]。G007-LK可以抑制小腸LGR5+干細(xì)胞增殖；RK-287107不僅能抑制PARP1酶的活性，還可以通過阻斷β-catenin信號通路，抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的腫瘤生長；研究報道XAV939是首個報道的tankyrase選擇性聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（PARP）抑制劑，XAV939可抑制 TNKS 1和TNKS 2的（PARP）活性，使軸蛋白（Axin）活性增強，加速β-catenin磷酸化降解，從而阻滯Wnt信號通路，阻滯癌基因的激活，最終抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究[12]結(jié)果顯示，XAV939對肺腺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用有明顯的濃度依賴性和時間依賴性，與以上學(xué)者研究相符，且檢測發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞的TNKS蛋白表達(dá)水平高于Calu-3和SK-LU-1細(xì)胞。本實驗利用qRT-PCR法檢測梯度濃度消巖湯作用于A549細(xì)胞后TNKS mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨消巖湯濃度升高，A549細(xì)胞中TNKS表達(dá)降低。另外本研究通過回顧性分析，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中TNKS的表達(dá)顯著增高。如若抑制端粒酶TNKS活性是否可以誘導(dǎo)端?？s短，最終引起細(xì)胞衰老和死亡。

因此，本研究進一步通過使用體外下調(diào)技術(shù)，尋求確認(rèn)TNKS在調(diào)節(jié)肺腺癌發(fā)生及進展中的作用，探討消巖湯是否通過抑制TNKS表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，增加細(xì)胞DNA損傷并抑制DNA修復(fù)能力。CCK8實驗結(jié)果表明，下調(diào)TNKS的表達(dá)顯著抑制了A549細(xì)胞的活性及增殖能力，與消巖湯組相同，提示消巖湯可能通過下調(diào)TNKS的表達(dá)抑制A549細(xì)胞的增殖。

人類絕大多數(shù)體細(xì)胞缺乏端粒酶活性，端粒長度縮短，細(xì)胞DNA受損，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和凋亡，而腫瘤細(xì)胞端粒酶活性可保持在一個較高水平。有研究報道TNKS抑制劑XAV939，可增加誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的抗癌藥物的敏感性，并與DNA損傷抗癌藥物聯(lián)合治療具有潛在的治療作用[16]。磷酸化的H2AX（γH2AX）是DNA損傷的敏感新標(biāo)志物，目前的研究表明，下調(diào)TNKS后，A549細(xì)胞γH2AX熒光表達(dá)明顯增強，給予消巖湯處理的A549細(xì)胞γH2AX熒光表達(dá)也增強。結(jié)果提示，下調(diào)TNKS及給予消巖湯都會增加細(xì)胞的DNA損傷，同時抑制同源重組DNA修復(fù)能力。

下調(diào)TNKS后傷口愈合實驗的結(jié)果顯示，與對照組相比，TNKS下調(diào)組細(xì)胞劃痕愈合率降低，提示下調(diào)TNKS后A549細(xì)胞遷移能力下降，同樣下調(diào)TNKS后細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，TNKS下調(diào)組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)減少，提示下調(diào)TNKS后A549細(xì)胞侵襲能力降低。以上結(jié)果與消巖湯組一致。再一次驗證既往研究報道，如下調(diào)TNKS表達(dá)可抑制大腸癌、前列腺癌的增殖[17]；在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中，下調(diào)TNKS表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]等。

綜上所述，下調(diào)TNKS可以抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，TNKS的異常表達(dá)在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，抑制TNKS的活性或阻斷其作用位點有可能成為治療肺腺癌的新方法。中藥消巖湯可降低TNKS的表達(dá)，具有抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)特性，其機制可能與TNKS相關(guān)。然而肺腺癌發(fā)生發(fā)展是多基因多因素相互作用的結(jié)果，消巖湯抑制肺腺癌生長的具體機制有待于進一步深入研究。