林氏念珠藻對(duì)酸化稻田水稻產(chǎn)量和土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能的影響

邵繼海，陳杰鋒，胡婷

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

化學(xué)氮肥在提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面發(fā)揮了極大的作用.然而，長(zhǎng)期過量使用化學(xué)氮肥已導(dǎo)致一系列的農(nóng)業(yè)和環(huán)境問題，如農(nóng)田土壤酸化、水體富營(yíng)養(yǎng)化和溫室氣體的釋放等[1-4].自20世紀(jì)80年代至今，我國(guó)農(nóng)田土壤酸化形勢(shì)依然嚴(yán)峻，減少化學(xué)氮肥的使用量和提高化學(xué)氮肥的利用效率是遏制農(nóng)田土壤酸化的主要措施.

固氮藍(lán)藻是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要微生物類群.研究表明，固氮藍(lán)藻每季向稻田輸入的氮素量可以達(dá)到20～60 kg/hm2[5].在水稻生長(zhǎng)過程中，接種固氮藍(lán)藻可減少近一半的化學(xué)氮肥，且使水稻增產(chǎn)10%～30%[6].固氮藍(lán)藻在提高水稻產(chǎn)量和減少稻田化學(xué)氮肥使用量方面具有很大的應(yīng)用潛力.盡管目前關(guān)于固氮藍(lán)藻對(duì)農(nóng)田氮素輸入以及對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)和增產(chǎn)效應(yīng)有較多的研究，但向酸化農(nóng)田接種固氮藍(lán)藻后，對(duì)水稻產(chǎn)量及農(nóng)田微生物結(jié)構(gòu)與功能的影響卻鮮有報(bào)道.本研究通過稻田小區(qū)試驗(yàn)，探討了在酸化稻田中接種固氮藍(lán)藻對(duì)水稻產(chǎn)量、土壤酶活性和土壤中細(xì)菌多樣性的影響，以期為酸化稻田中固氮藍(lán)藻的合理利用以及提高水稻產(chǎn)量與土壤肥力提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 小區(qū)試驗(yàn)位點(diǎn)概況及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

小區(qū)試驗(yàn)于2020年在湖南省瀏陽市蕉溪鎮(zhèn)水稻田(113°32′13.11″E，28°13′40.79″N)進(jìn)行.該稻田土壤pH為5.2;全氮0.55 g/kg;銨態(tài)氮0.05 mg/kg;總磷0.65 g/kg;有效磷11.63 mg/kg.試供藻種為林氏念珠藻(NostoclinckiaFACHB104)，由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供.使用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行藻種擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，光照周期光暗比設(shè)置為12L∶12D，光照強(qiáng)度為24 lx.待林氏念珠藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，將其轉(zhuǎn)入無氮BG-11培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，然后接種至稻田.試驗(yàn)分為對(duì)照(CK)和接種林氏念珠藻處理(NL).每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列，共設(shè)計(jì)6個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)的大小為4 m×5 m.NL處理組接種經(jīng)過氮饑餓的林氏念珠藻培養(yǎng)液，CK處理組接種等體積的無氮BG-11培養(yǎng)基.每次接種量約為6.6×1010cells/m2.從水稻插秧后第2 d到水稻乳熟期，每15 d接種1次.水稻品種為雜交稻天優(yōu)華占.水稻插秧前一周施加基肥，施用量為尿素166.67 kg/hm2, 氯化鉀166.67 kg/hm2, 過磷酸鈣291.29 kg/hm2.插秧1月后施加追肥，追肥用量為氯化鉀100 kg/hm2, 過磷酸鈣175.68 kg/hm2.水分管理方式為全生育期淹水.

1.2 樣品采集及測(cè)定

土壤樣品于水稻成熟期采集，在各試驗(yàn)小區(qū)采集至少5個(gè)點(diǎn)的0～20 cm耕作層土壤，混勻，挑出植物殘?bào)w后，采用4分法裝袋.一部分新鮮土樣裝于封口袋放于-80 ℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，用于分析土壤微生物分子多樣性；一部分新鮮土壤裝于封口袋放于4 ℃冷藏，用于分析土壤酶活性.另一部分樣品儲(chǔ)存于自封袋內(nèi)并轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，碾磨過篩后測(cè)定其基本理化性質(zhì).

土壤pH采用電位法測(cè)定[7]；土壤中有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總磷、有效磷、陽離子交換量參考文獻(xiàn)[7].土壤中脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定；酸性磷酸酶采用對(duì)硝基苯比色法測(cè)定；土壤纖維素酶采用蒽酮硫酸比色法測(cè)定.上述酶活性具體測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[8].土壤固氮酶活性采用乙炔還原法測(cè)定[9-10].水稻成熟后，采用5點(diǎn)取樣法收割水稻穗.將谷粒樣品置于室外陽光下曬干，稱質(zhì)量，測(cè)定其產(chǎn)量.

1.3 高通量測(cè)序

選用土壤DNA提取試劑盒(天根)提取土壤樣品總DNA，使用16S rDNA通用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3')和806R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3')擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)[11].PCR熱循環(huán)方案設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入25個(gè)循環(huán)擴(kuò)增階段，每個(gè)循環(huán)包括變性95 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，最后于72 ℃保溫5 min.PCR擴(kuò)增在ABI GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems，CA，USA)上進(jìn)行.使用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進(jìn)一步純化.使用QuantiFluorTM-ST(PromegaUSA)對(duì)純化的擴(kuò)增子進(jìn)行定量，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，處理組和對(duì)照組的兩兩比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05時(shí)表示差異顯著.采用皮爾森(pearson)相關(guān)性分析來研究土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)，以及細(xì)菌相對(duì)豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)與水稻產(chǎn)量

由表1可以看出，接種林氏念珠藻顯著提高了土壤中銨態(tài)氮的含量，與對(duì)照組相比，其銨態(tài)氮含量提高了27.0%.林氏念珠藻對(duì)土壤pH，有機(jī)質(zhì)，硝態(tài)氮，陽離子交換量影響不顯著.接種林氏念珠藻處理組土壤中速效磷平均值大于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示其差異未達(dá)到顯著性水平.由圖1可知，接種林氏念珠藻能顯著增加水稻的產(chǎn)量，增幅為33.7%.

表1 不同處理的土壤理化特征

2.2 土壤酶活性

由圖2可以看出，接種林氏念珠藻處理組的土壤固氮酶、酸性磷酸酶和纖維素酶的活性均顯著增強(qiáng)，與對(duì)照相比，分別增加了40.3%，50.8%和90.9%.土壤脲酶活性分析結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻對(duì)該酶的活性沒有顯著影響.

2.3 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

由表2可知，土壤中酸性磷酸酶與銨態(tài)氮的相關(guān)系數(shù)為0.82，呈顯著正相關(guān).纖維素酶與pH的相關(guān)系數(shù)為-0.82，呈顯著負(fù)相關(guān).纖維素酶與銨態(tài)氮的相關(guān)系數(shù)為0.96，呈極顯著正相關(guān).固氮酶活性與有機(jī)質(zhì)的相關(guān)系數(shù)為-0.83，呈顯著負(fù)相關(guān).

表2 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的皮爾森相關(guān)性分析

2.4 土壤中細(xì)菌群落多樣性分析

高通量測(cè)序的結(jié)果顯示，該稻田土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要分布于變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)，這5個(gè)菌門的相對(duì)豐度占比之和高達(dá)73.19%～74.89%(圖3)，其中變形菌門占比最高，為22.89%～23.10%.其次為放線菌門和綠彎菌門，分別占比 13.53%～17.22% 和 12.42%～21.72%.從各類群相對(duì)豐度的平均值來看，接種林氏念珠藻后，放線菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對(duì)豐度均有所增加，而綠彎菌門和浮霉菌門相對(duì)豐度均有所降低.統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示，在上述主要的微生物類群中，僅放線菌門的相對(duì)豐度在接種林氏念珠藻處理和對(duì)照之間存在顯著性差異.

為了揭示土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與主要環(huán)境因子的關(guān)系，將相對(duì)豐度前10位的細(xì)菌類群(門水平)與土壤中總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總磷、效磷、有機(jī)質(zhì)含量和pH等7個(gè)環(huán)境因子做皮爾森相關(guān)性分析(表3).結(jié)果顯示，放線菌與浮霉菌的相對(duì)豐度分別與土壤中的總磷、速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)；疣微菌和藍(lán)藻的相對(duì)豐度均與土壤中的銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)；擬桿菌的相對(duì)豐度與土壤的氨氮呈顯著正相關(guān)，與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān).其余5個(gè)主要細(xì)菌類群與上述7個(gè)環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性.

為了進(jìn)一步了解細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與主要環(huán)境因子的關(guān)系，在上述相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上，從目分類水平將放線菌門、疣微菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門中的主要類群與土壤的pH、銨態(tài)氮、總磷進(jìn)行了皮爾森相關(guān)性分析(附表2)，結(jié)果顯示疣微菌門中的Chthoniobacterales,藍(lán)藻門中的色球藻目(Synechococcales)和細(xì)鞘絲藻目(Leptolyngbyales)與pH呈顯著正相關(guān)，而擬桿菌門中的擬桿菌目(Bacteroidales)和Kryptoniales與pH呈顯著負(fù)相關(guān).色球藻目和細(xì)鞘絲藻目與土壤中銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而放線菌門中的弗蘭克氏菌目(Frankiales),Solirubrobacterales和擬桿菌門中的擬桿菌目與銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān).疣微菌門中的Pedosphaerales與土壤中總磷含量呈顯著正相關(guān).

表4顯示了不同處理?xiàng)l件下稻田土壤中細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)的變化情.各處理組高通量測(cè)序覆蓋率均大于95%，說明測(cè)序結(jié)果比較可靠，能夠有效反映樣本中細(xì)菌群落的多樣性.除Coverage指標(biāo)外，接種林氏念珠藻處理的α多樣性指數(shù)值均略高于對(duì)照組.然而，統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示，這兩組處理的各多樣性指數(shù)均不存在顯著差異.

3 討 論

固氮藍(lán)藻可以通過生物固氮和光合作用向農(nóng)田輸入銨態(tài)氮和有機(jī)碳，提高土壤肥力，促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)[10-11].此外，有研究表明，一些固氮藍(lán)藻還能合成植物促長(zhǎng)激素，促進(jìn)作物生長(zhǎng)和提高作物產(chǎn)量[12].本研究結(jié)果顯示，在酸化稻田接種固氮藍(lán)藻可以有效地提高水稻產(chǎn)量.研究結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻可以顯著提高土壤中固氮酶的活性和銨態(tài)氮的含量，基于這些結(jié)果推測(cè)氮素輸入是該固氮藍(lán)藻提高水稻產(chǎn)量的作用方式之一.磷酸酶能活化土壤中的非生物有效態(tài)磷元素，使其變?yōu)樽魑锟梢晕盏挠行B(tài)磷，進(jìn)而促進(jìn)作物生長(zhǎng)[13].接種林氏念珠藻后，土壤中酸性磷酸酶活性顯著升高，但是土壤中有效磷的含量與對(duì)照相比無顯著差異，其原因可能是稻田中的微生物和水稻吸收了更多的有效磷.據(jù)此推測(cè)，提高磷元素的可獲取性也可能是接種林氏念珠藻提高水稻產(chǎn)量的另一原因.文獻(xiàn)[14]研究了稻田新紀(jì)錄固氮藍(lán)藻類珠藻對(duì)水稻生長(zhǎng)、產(chǎn)量及稻田土壤理化特性的影響，在大田試驗(yàn)條件下，接種類珠藻可以使水稻增產(chǎn)25.1%，但是對(duì)土壤理化特性無顯著影響；本研究結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻使水稻增產(chǎn)33.7%，土壤中的銨態(tài)氮含量顯著高于對(duì)照處理.本研究所用的土壤為酸性土壤，土壤酸化能抑制作物對(duì)氮素養(yǎng)分和無機(jī)陽離子的吸收，降低作物產(chǎn)量[15]，這些因素導(dǎo)致本田間試驗(yàn)水稻產(chǎn)量較低.

表3 土壤中主要細(xì)菌類群相對(duì)豐度與土壤理化性質(zhì)的皮爾森相關(guān)性分析

表4 接種林氏念珠藻對(duì)土壤中細(xì)菌α多樣性指數(shù)的影響

土壤酶的活性受土壤理化性質(zhì)的影響.有研究表明，微生物磷酸酶活性與環(huán)境中氮素營(yíng)養(yǎng)水平直接相關(guān)[16].根據(jù)本文皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果，土壤中銨態(tài)氮含量與酸性磷酸酶呈顯著正相關(guān).接種林氏念珠藻后，土壤固氮酶活性升高，銨態(tài)氮含量增加.氮素營(yíng)養(yǎng)水平的升高刺激土壤微生物磷酸酶的活性.纖維素酶活性是評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)[17]，纖維素分解菌與固氮微生物之間存在較為普遍的碳氮互惠關(guān)系[18]，接種林氏念珠藻增強(qiáng)了土壤中纖維素酶的活性，再次從酶活性的角度證明固氮藍(lán)藻與纖維素分解菌之間存在互惠的關(guān)系，該結(jié)果也從纖維素酶活性的角度表明接種林氏念珠藻能夠提高土壤肥力.盡管有文獻(xiàn)報(bào)道固氮藍(lán)藻可以通過光合作用向農(nóng)田輸入有機(jī)碳[11]，然而本試驗(yàn)結(jié)束后，接種林氏念珠藻處理組土壤中有機(jī)質(zhì)含量與對(duì)照相比無顯著差異.其原因可能是接種固氮藍(lán)藻后微生物分解代謝有機(jī)質(zhì)的活性增強(qiáng)，有機(jī)物分解速度增加，抵消了固氮藍(lán)藻光合作用向土壤輸入的有機(jī)質(zhì).而土壤有機(jī)質(zhì)與固氮酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)也間接證明了這一點(diǎn).

土壤中變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門和綠彎菌門的豐度往往較高[19]，本研究結(jié)果顯示，這5個(gè)細(xì)菌類群的相對(duì)豐度之和超過總細(xì)菌類群的70%.這也進(jìn)一步肯定了這些微生物是稻田土壤的主要細(xì)菌類群.如圖3所示，接種林氏念珠藻后，土壤中放線菌門的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照.放線菌是農(nóng)田土壤中的重要微生物類群，這類微生物具有強(qiáng)大的有機(jī)物分解能力，一些種類還具有生防和固氮的活性[20-21].屬分類水平的分析結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻處理組土壤中諾卡氏菌屬(Nocardioides)、酸熱菌屬(Acidothermus)及一個(gè)未鑒定到屬的蓋勒氏菌目(Gaiellales)放線菌的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照.諾卡氏菌和酸熱菌對(duì)纖維素、木質(zhì)素及多種有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的降解能力[22-23].該類微生物豐度的增加可以提高稻田土壤有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)，這也可能是接種林氏念珠藻處理組土壤中纖維素分解酶活性高于對(duì)照的原因.

土壤中微生物的群落組成與環(huán)境因子息息相關(guān).土壤中氮、磷、有機(jī)質(zhì)含量及土壤pH對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著的影響[24].皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果顯示，藍(lán)藻門的相對(duì)豐度均與土壤中的銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)，而擬桿菌門和放線菌門中的一些種類的相對(duì)豐度與土壤中銨態(tài)氮呈顯著正相關(guān).盡管接種的林氏念珠藻在分類系統(tǒng)中屬于念珠藻科(Nostocaceae)，本研究在科分類水平的群落組成分析結(jié)果顯示，念珠藻科的類群在藍(lán)藻門中所占的相對(duì)比例比較低，占比均不到10%，其中的優(yōu)勢(shì)類群為色球藻科(Synechococcaceae)、微囊藻科(Microcystaceae)和細(xì)鞘絲藻亞科(Leptolyngbyaceae).本研究中生物多樣性樣品的采集時(shí)間為水稻成熟期，距離最近的一次林氏念珠藻接種時(shí)間已有一個(gè)多月，林氏念珠藻種群在稻田中的衰退可能是導(dǎo)致念珠藻科藍(lán)藻相對(duì)豐度較低的原因.藍(lán)藻分布與環(huán)境因子的關(guān)系復(fù)雜，不同生境存在著不同模式.以色球藻科藍(lán)藻為例，SILAMBARASAN等[25]研究結(jié)果顯示，海洋中色球藻科藍(lán)藻的豐度與水體營(yíng)養(yǎng)鹽，如銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、磷酸鹽等的含量呈負(fù)相關(guān)，而FRADE等[26]研究結(jié)果則顯示大堡礁周圍海水中的色球藻科藍(lán)藻的豐度與水體營(yíng)養(yǎng)鹽呈正相關(guān).本研究結(jié)果則顯示稻田色球藻科藍(lán)藻與土壤中銨態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān).也正是因?yàn)樯蛟迥亢图?xì)鞘絲藻目這些優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻類群的相對(duì)豐度與土壤中銨態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)，從而出現(xiàn)藍(lán)藻門的相對(duì)豐度與土壤中銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)的現(xiàn)象.本研究接種林氏念珠藻后，土壤中綠彎菌門和浮霉菌門相對(duì)豐度均有所降低，但相關(guān)性分析結(jié)果顯示，這兩類微生物的相對(duì)豐度變化與本研究測(cè)定的7個(gè)環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性.土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替除了與環(huán)境因子相關(guān)外，還與微生物之間的相互作用相關(guān)[27].對(duì)本研究中主要細(xì)菌類群相對(duì)豐度之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明綠彎菌與酸桿菌、浮霉菌、疣微菌呈顯著正相關(guān)，與擬桿菌呈顯著負(fù)相關(guān).浮霉菌與疣微菌呈顯著正相關(guān).目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物之間的相互作用與群落演替關(guān)系的認(rèn)識(shí)還非常有限，關(guān)于稻田接種林氏念珠藻引起微生物群落結(jié)構(gòu)改變的驅(qū)動(dòng)因子還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié) 論

向酸化稻田接種林氏念珠藻能顯著增加土壤中銨態(tài)氮的含量并提高水稻產(chǎn)量.林氏念珠藻能提高土壤中放線菌的相對(duì)豐度，并增強(qiáng)土壤中固氮酶、磷酸酶和纖維素酶的活性.