UPLC-Q-TOF-MS法分析貓爪草化學(xué)成分

黃華靖， 江潔怡， 肖觀林， 曾志浩， 楊敏娟， 畢曉黎*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095)

貓爪草為毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb.的干燥塊根，其味甘、辛，性溫，入肝、肺二經(jīng)，具有化痰散結(jié)、解毒消腫的功效，用于治療瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷，1977年開始收載于《中國藥典》[1-2]，具有抗結(jié)核[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[6]，臨床上常與其他藥物聯(lián)合治療肺結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核、肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌[6-10]、慢性乙型肝炎、甲狀腺炎等[11-12]，化學(xué)成分有酯類、有機(jī)酸、黃酮、苷類、生物堿、揮發(fā)油、多糖、微量元素、氨基酸等[1]。目前，貓爪草活性物質(zhì)尚未明確，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)報(bào)道也較少。

近年來，UPLC-Q-TOF-MS法在中藥及其復(fù)方成分的定性鑒別中應(yīng)用廣泛，具有高分辨率、高選擇性、高靈敏度等特點(diǎn)[13-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用該方法對(duì)貓爪草化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，以期為進(jìn)一步闡釋其藥效物質(zhì)、作用機(jī)制、質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 ExionLC AC型液相色譜儀、X500R QTOF型質(zhì)譜儀(美國Sciex公司)；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Sorvall Legend Micro17R型微量離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；XS205型電子分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸(110831-201204，純度89.9%)、蘆丁(100080-201409，純度91.9%)、小檗堿(110713-201814)、原兒茶醛(110810-201007)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；原兒茶酸(Y-031-161227)、鞣花酸(R-004-170426)、咖啡酸(K-003-150730)對(duì)照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；對(duì)羥基苯甲醛(PS010495)對(duì)照品購自成都普思生物科技有限公司；亞油酸(AF7060202)對(duì)照品購自成都埃法生物科技有限公司，純度均大于98.0%。貓爪草于2019年8月購自河南省駐馬店市，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦研究員鑒定為毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb.的塊根。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純(美國Fisher公司)；水為蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取貓爪草5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，加熱回流2 h，放冷，用95%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，濾液減壓濃縮，甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、蘆丁、原兒茶醛、小檗堿、原兒茶酸、鞣花酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL，即得。

2.3 色譜條件 Waters CORTECS UPLC T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～2 min，5%～15%A；2～8 min，15%～43%A；8～20 min，43%～65%A；20～37 min，65%～92%A；37～42 min，92%～98%A；42～45 min，98%A)；體積流量0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 正負(fù)離子模式，掃描范圍m/z100～1 000；霧化氣、輔助氣壓力379.2 kPa；氣簾氣壓力241.3 kPa；霧化溫度500 ℃；毛細(xì)管電壓5 500 V/-4 500 V；裂解電壓100 V/-80 V；碰撞能量35 V。

2.5 數(shù)據(jù)庫建立 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)、SciFinder、PubMed、ChemSpider等平臺(tái)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，收集貓爪草中196個(gè)化合物、毛茛屬植物報(bào)道的66個(gè)化合物，建立包括化合物名稱(含英文名稱)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、CAS號(hào)、分類的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

3 結(jié)果

3.1 成分鑒定 基峰離子色譜圖見圖1，共鑒別出37個(gè)化合物，包括20個(gè)有機(jī)酸，4個(gè)生物堿，3個(gè)酯類，2個(gè)香豆素，2個(gè)萜類，2個(gè)黃酮等，其中鞣花酸、小檗堿為首次從貓爪草中發(fā)現(xiàn)。通過查閱文獻(xiàn)[13-33]和比對(duì)對(duì)照品，結(jié)合裂解規(guī)律、保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果見表1。

3.2 有機(jī)酸 包括化合物2～4、9、11～12、14、18、20、23～24、28～35、37?；衔?在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z169.013 7[M-H]-，脫去一分子COOH形成碎片離子m/z125.023 0，鑒定為沒食子酸[13]?；衔?4在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z300.998 8[M-H]-，脫去一分子CO2、一分子CO后得到m/z257.009 6、229.014 5，脫去兩分子CO2、一分子CO后得到m/z185.024 6，鑒定為鞣花酸[33]。

3.3 香豆素 包括化合物5、8?；衔?在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z163.039 0[M+H]+，脫去一分子CO、一分子H2O形成特征碎片m/z135.043 9、117.033 7、117.033 7，再脫去一分子CO，形成特征碎片m/z89.038 6；m/z92.025 4由準(zhǔn)分子離子峰脫去兩分子CO后再脫去一分子甲基形成，鑒定為傘形花內(nèi)酯[18]。化合物8在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z177.019 5[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜有m/z149.024 9、133.029 3、105.044 3的碎片離子，鑒定為秦皮乙素[19-20]，其裂解途徑見圖2。

表1 貓爪草化學(xué)成分

3.4 生物堿 包括化合物15～17、22。原阿片堿為普羅托品類生物堿，母核大多數(shù)為含有羰基的十元環(huán)，丟失羰基和1個(gè)氫可形成2個(gè)六元環(huán)，同時(shí)容易發(fā)生Retro-Diels-Alder(RDA)反應(yīng)和α裂解，再繼續(xù)脫去羥基或水分子等取代基，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z354.133 8[M+H]+, 發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生碎片m/z206.080 9、149.060 1，其中前者再發(fā)生RDA裂解，脫去1個(gè)OH產(chǎn)生碎片m/z189.078 5，鑒定為原阿片堿[30]，小檗堿為原小檗堿類生物堿，母核一般不發(fā)生裂解，裂解途徑以小分子取代基的裂解為主，如m/z321.099 2、292.096 4、278.081 2為取代基裂解形成的特征碎片離子峰?；衔?2準(zhǔn)分子離子峰為m/z336.122 7 [M+H]+，脫去一分子CH3可產(chǎn)生碎片m/z321.099 2或m/z320.105 1，后者再脫去一分子CO產(chǎn)生m/z292.096 4碎片；脫去兩分子CH3后，再脫去一分子 CO,可產(chǎn)生碎片m/z278.081 2，鑒定為小檗堿[31]，其裂解途徑見圖3。

3.5 萜類 包括化合物27、36?；衔?7在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z487.339 4[M-H]-，脫去一分子 H2O，生成碎片m/z469.333 7，再脫去一分子HCOOH產(chǎn)生碎片m/z423.329 7，鑒定為積雪草酸[14,26]，其裂解途徑見圖4。

3.6 黃酮 黃酮苷元在質(zhì)譜條件下裂解方式主要有CO、CO2、C2H2O、H2O等中性粒子的丟失，以及C環(huán)發(fā)生RDA裂解；黃酮苷則常發(fā)生糖基均裂，形成黃酮苷元離子[26]。化合物26在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z313.071 6[M-H]-，母離子丟失?；玫剿槠琺/z271.061 5，再脫去一分子H2O得到碎片m/z253.050 5，鑒定為pinobanksin-3-O-acetate[25]?；衔?3在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z609.147 0[M-H]-，脫去蕓香糖基產(chǎn)生離子m/z301.035 7，鑒定為蘆丁[32]。

4 討論

4.1 分析條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察不同提取溶劑、不同處理方式、不同提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)提取溶劑為95%乙醇、回流提取、提取時(shí)間為120 min時(shí)各分析物提取效果最好，響應(yīng)值較高，故最終確定以95%乙醇加熱回流120 min作為供試品制備方法。在優(yōu)化色譜條件時(shí)，考察乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸，結(jié)果表明，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸時(shí)分離度好，色譜峰峰形較好，故以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相。

4.2 化學(xué)成分分析 貓爪草具有抗結(jié)核、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[1]，其有機(jī)酸部位是發(fā)揮抗結(jié)核、抗腫瘤作用的活性成分之一[6]。采用 UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)檢測貓爪草中的化學(xué)成分，共鑒定37個(gè)化合物，包括20個(gè)有機(jī)酸，4個(gè)生物堿，2個(gè)香豆素，2個(gè)黃酮，2個(gè)萜類，大部分為有機(jī)酸類，部分具有明確生理活性。例如，咖啡酸具有抗氧化、抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)DNA甲基化水平、升高白細(xì)胞與血小板[34]等作用；鞣花酸具有良好的抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)肝損傷、抗菌、抗病毒、抗過敏、鎮(zhèn)靜降壓等作用[35]；沒食子酸具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用，在心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝纖維化等方面均有一定藥理作用[36]。但目前貓爪草有機(jī)酸部位發(fā)揮抗結(jié)核、抗腫瘤作用的活性成分尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

本研究建立UPLC-Q-TOF-MS法快速分析貓爪草中化學(xué)成分，為進(jìn)一步深入研究該植物有機(jī)酸部位、尋找其藥效物質(zhì)、闡明作用機(jī)制提供依據(jù)，也為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。