炒萊菔子中蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽在腸道菌群體外代謝的研究

高 磊， 張 茜,2， 盛華剛， 于紹華， 周洪雷， 朱立俏*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.臨沂高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管理委員會，山東 臨沂 276000)

萊菔子為十字花科植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子，其味辛、甘，性平，歸脾、胃、肺經(jīng)，臨床大多以炒制品入藥，具有消食除脹、降氣化痰的作用，可用于治療飲食停滯、脘腹脹痛、大便秘結(jié)[1]，有著降血壓[2-3]、降血脂[4-5]、祛痰鎮(zhèn)咳[6]、抗炎[7-8]、防癌[9]、消食[10]等活性，主要含硫苷[11-12]、生物堿[13]、脂肪酸[14]、黃酮[15-16]、多糖、蛋白質(zhì)[17-18]等成分，以硫苷類成分蘿卜苷和生物堿類成分芥子堿為代表。

中藥大多以口服形式進(jìn)入人體，首先會在消化道內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，腸道菌群代謝是消化道內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的環(huán)節(jié)[19]。蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽均為離子型化合物，屬于強(qiáng)極性，故在腸道中較難吸收，生物利用度低，而腸道菌群會使兩者發(fā)生代謝，生成疏水性更強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，從而被機(jī)體吸收進(jìn)入血液。目前，給予化學(xué)成分對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，以及腸道菌群代謝產(chǎn)物鑒定的研究較多[20-21]，但鮮有涉及它們在腸道菌群作用下的規(guī)律。因此，本實(shí)驗(yàn)考察炒萊菔子中蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽在大鼠腸道菌群作用下的體外代謝，以期為該藥材開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 炒萊菔子購于山東百味堂中藥飲片有限公司(批號160101)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張芳教授鑒定為十字花科植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子。芥子堿硫氰酸鹽對照品(成都德斯特生物技術(shù)有限公司，批號DST160910-21)；蘿卜苷對照品(美國Cayman公司，批號0453522-24，純度≥98%)。營養(yǎng)瓊脂(批號20170838)、牛肉膏(批號20170502)購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；L-半胱氨酸(批號313E026)、胰蛋白胨(批號1939536)購自北京索萊寶生物科技有限公司；L-抗壞血酸(批號20150831)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇為色譜純(美國 Fisher公司)；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器 Agilent Techologies 1260 Infinity高效液相色譜儀(配置DAD檢測器，美國Agilent Techologies公司)；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；HFszfe-1200TE生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器；厭氧產(chǎn)氣袋(AnaeroPack-Anaero)、厭氧培養(yǎng)盒(Pack-Rectangular Jars)(日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社)；3K15型離心機(jī)(北京索萊寶科技有限公司)；SZ-1快速混勻器(江蘇金壇市金城國勝儀器廠)；SCIENTZ-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FA2004電子分析天平(上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 動物 雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)合格證號SCXK(魯)20140007。

2 方法

2.1 提取液制備 稱取飲片約100 g，粉碎，加入12倍量水煎煮30 min，濾過，藥渣再加10倍量水煎煮30 min，合并提取液，濃縮至每1 mL藥液相當(dāng)于0.4 g藥材。量取適量，蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度為0.04 g/mL，過0.22 μm無菌微孔濾膜，即得。

2.2 腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化

2.2.1 厭氧培養(yǎng)液制備 參考文獻(xiàn)[22]報(bào)道。A液為0.78%K2HPO437.5 mL，B液為0.47%KH2PO4、1.18%NaCl、1.2%(NH4)2SO4、0.12%CaCl2、0.25%MgSO4·H2O 37.5 mL，C液為8%Na2CO350 mL，將三者與0.5 gL-半胱氨酸、2 mL 25%L-抗壞血酸溶液、1 g牛肉膏、1 g蛋白胨、1 g營養(yǎng)瓊脂混勻，加蒸餾水至1 L，鹽酸調(diào)pH至7.5～8.0，即得。

2.2.2 大鼠腸道菌液制備 取大鼠2只，禁食不禁水12 h，取新鮮糞便0.4 g，加入4倍量生理鹽水，組織勻漿機(jī)中充分混勻后5 000 r/min離心10 min，取上清液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.2.3 腸菌培養(yǎng)液制備 參考文獻(xiàn)[23]報(bào)道。取大鼠腸道菌液2 mL，置于無菌培養(yǎng)皿中，加入?yún)捬跖囵B(yǎng)液18 mL，混合均勻，置于厭氧培養(yǎng)盒中，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋后迅速蓋上盒蓋以保證厭氧環(huán)境，置于37 ℃氣浴恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24 h，即得。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)操作 將腸菌培養(yǎng)液平均分為2份，每份10 mL，一份(有腸菌)中加入“2.1”項(xiàng)下提取液5 mL，作為給藥組，而另一份(有腸菌)作為空白組；另取“2.1”項(xiàng)下提取液5 mL，加到10 mL厭氧培養(yǎng)液(無腸菌)中，作為對照組，將上述樣品置于厭氧培養(yǎng)盒中，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋后迅速蓋上盒蓋以保證厭氧環(huán)境，置于37 ℃氣浴恒溫振蕩箱中培養(yǎng)，于0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h時(shí)取出，加入10 mL甲醇渦混振搖3 min終止反應(yīng)，8 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件 InertSuatain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，2%A；5～8 min，2%～5%A；8～10 min，5%～12.5%A；10～12 min，12.5%～14%A；12～25 min，14%～25%A；25～40 min，25%～50%A；40～50 min，50%～70%A；50～60 min，70%～100%A)；體積流量1 mL/min；柱溫27 ℃；檢測波長225、326 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.4 對照品溶液制備 精密稱取蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，少量純凈水溶解后加預(yù)先滅菌的腸菌培養(yǎng)液，制成兩者質(zhì)量濃度分別為76、13.4 μg/mL的溶液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察，吸取對照品溶液適量，8 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，分別取1、5、10、20、40、60 μL，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得蘿卜苷方程為Y=1 186.6X-154.8(R2=0.999 4)，線性范圍0.076～7.6 μg；芥子堿硫氰酸鹽方程為Y=1 320.6X+20.612(R2=0.999 3)，線性范圍0.013 4～1.34 μg。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蘿卜苷、蘿卜苷代謝產(chǎn)物、芥子堿硫氰酸鹽、芥子堿硫氰酸鹽代謝產(chǎn)物峰面積RSD分別為2.40%、2.39%、4.41%、4.65%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液適量，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得蘿卜苷、蘿卜苷代謝產(chǎn)物、芥子堿硫氰酸鹽、芥子堿硫氰酸鹽代謝產(chǎn)物峰面積RSD分別為1.99%、1.15%、3.76%、0.47%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蘿卜苷、蘿卜苷代謝產(chǎn)物、芥子堿硫氰酸鹽、芥子堿硫氰酸鹽代謝產(chǎn)物峰面積RSD分別為2.10%、4.67%、4.79%、3.59%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下各培養(yǎng)液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽保留時(shí)間分別為4.57、21.34 min，而兩者代謝產(chǎn)物分別為16.33、28.77 min，并且大鼠腸菌液和厭氧培養(yǎng)液不干擾測定，表明該方法專屬性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取孵育某一時(shí)間點(diǎn)、各成分含量已知的腸道菌群培養(yǎng)液6份，精密加入適量對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽平均加樣回收率分別為92.35%、97.12%，RSD分別為6.26%、6.93%。

2.6 降解率、生成率測定 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，標(biāo)記在腸道菌群孵育過程中發(fā)生變化的特征峰，記錄峰面積，分別按Qi=(1-Ai/A0)×100%、Qd=(Ed/A0)×100%計(jì)算蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸苷降解率及其代謝產(chǎn)物生成率，并繪制轉(zhuǎn)化曲線[24]。其中，Qi為某一時(shí)間點(diǎn)的降解率，A0為0 h時(shí)1、2號峰的峰面積之和或4、5、7、9號峰的峰面積之和，Ai為某一時(shí)間點(diǎn)1、2號峰的峰面積之和或4、5、7、9號峰的峰面積之和，Qd為某一時(shí)間點(diǎn)代謝產(chǎn)物的生成率，Ed為某一時(shí)間點(diǎn)代謝產(chǎn)物的峰面積。

2.7 降解動力學(xué)參數(shù)測定 以蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別采用零級方程、一級方程、非線性動力學(xué)方程進(jìn)行線性擬合，通過相關(guān)系數(shù)(R2)來判斷擬合程度。

3 結(jié)果

3.1 樣品測定 將提取液不同腸道菌群孵育時(shí)間的225 nm波長處HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，得到HPLC疊加圖，標(biāo)記9個(gè)孵育時(shí)間發(fā)生變化的特征峰，見圖2。通過Agilent色譜工作站導(dǎo)出1～3號特征峰(225 nm)和4～9號特征峰(326 nm)在不同腸道菌群孵育時(shí)間的峰面積，見表1。

表1 不同腸道菌群孵育時(shí)間特征色譜峰的峰面積

1、2號峰(蘿卜苷)在大鼠腸道菌群作用下隨著共孵育時(shí)間延長，兩者峰面積均減小，前8 h程度緩慢，在8 h時(shí)分別為0 h的69.97%、68.47%，10 h時(shí)分別為0 h的32.39%、28.81%；隨著1、2號峰峰面積的降低，3號峰峰面積逐漸升高，24 h時(shí)達(dá)到最大值。由此推測，1、2號峰在大鼠腸道菌群作用下發(fā)生降解，代謝產(chǎn)物峰為3號峰。

在326 nm波長處，芥子堿硫氰酸鹽(4號峰)隨著共孵育時(shí)間延長，其峰面積降低，在8 h時(shí)僅為0 h的3.14%；保留時(shí)間為28 min的6號峰(芥子酸)峰面積逐漸升高。由此推測，芥子堿硫氰酸鹽在大鼠腸道菌群作用下的代謝產(chǎn)物為6號峰，并通過對照品比對確定為芥子酸。

炒萊菔子中本身含有芥子酸，故在0 h時(shí)就檢測到6號峰；10 h后4號峰(芥子堿硫氰酸鹽)被代謝完全，峰面積為0，但6號峰峰面積仍在增加，提示除芥子堿硫氰酸鹽外，還有其他成分在大鼠腸道菌群下也會被代謝為6號峰；隨著孵育時(shí)間延長，5、7、9號峰峰面積也在逐漸減小。查閱文獻(xiàn)[25]發(fā)現(xiàn)，炒萊菔子除了含芥子堿硫氰酸鹽外，還含芥子酸葡萄糖苷、(Z)-β-D-(3-芥子酰基)呋喃果糖基-α-D-葡萄糖苷、(E)-β-D-(3-芥子?；?呋喃果糖基-α-D-葡萄糖苷，它們會斷裂其葡萄糖苷鍵得到芥子酸。

3.2 轉(zhuǎn)化曲線 蘿卜苷及其代謝產(chǎn)物的生成曲線見圖3，芥子堿硫氰酸鹽及芥子酸衍生物、芥子酸生成曲線見圖4。

在0、0.25、0.5、1、2 h時(shí)，蘿卜苷降解率分別為0、1.5%、2.5%、4.0%、4.5%，降解速率較慢；在3、4、6、8、10 h時(shí)，其降解率分別為5.2%、8.1%、18.3%、30.0%、68.8%，即在腸菌作用下被大量降解，8～10 h降解速率最快；在10 h后，其降解曲線趨于平緩。

在0、0.25、0.5、1、2、3、4、6 h時(shí)，蘿卜苷代謝物生成率分別為0、0.90%、1.13%、1.23%、5.10%、8.79%、18.76%、26.49%，上升速率較慢；在8、10 h時(shí)，其生成率分別為50.00%、111.50%，即大量產(chǎn)生；在10 h后，其生成率趨于平緩。

在0、0.25、0.5、1、2、3、4、6 h時(shí)，芥子堿硫氰酸鹽及其他成分降解率分別為0、15.8%、32.5%、43.52%、62.87%、75.27%、84.31%、90.98%；在12 h時(shí)，其降解率為96.31%，幾乎被代謝完全。

在0、0.25、0.5、1、2、3、4 h時(shí)，芥子酸生成率分別為0、14.12%、23.36%、35.28%、50.66%、67.34%、70.76%；在12 h時(shí)，其生成率為86.21%；12 h后，其生成率仍在升高，但程度緩慢。

3.3 腸道菌群轉(zhuǎn)化動力學(xué)研究 蘿卜苷零級方程、一級方程、非線性動力學(xué)方程分別為Y=-0.011 2X+0.258 (R2=0.852 1)、lnY=-0.096 7X-1.274 2 (R2=0.967 7)、Y=0.243 6+0.013 6X-0.004 0X2+0.000 1X3(R2=0.986 0)，即其體外代謝過程更符合非線性動力學(xué)方程；芥子堿硫氰酸鹽三者分別為Y=-0.004 8X+0.030 8 (R2=0.860 9)、lnY=-0.643 0X-3.042 2 (R2=0.979 6)、Y=0.036 72-0.012 86X+0.001 47X2-0.000 05X3(R2=0.997 0)，即其體外代謝過程也符合非線性動力學(xué)方程。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過文獻(xiàn)查閱及對照品比對，確定芥子堿硫氰酸鹽的代謝產(chǎn)物為芥子酸，對蘿卜苷的代謝產(chǎn)物沒有進(jìn)行定性鑒別及純化制備。由表1可知，除峰3(16.34 min)和峰6(28.78 min)外，峰8(38.61 min)峰面積在逐漸增加，紫外吸收在326 nm波長處，推測為芥子堿硫氰酸鹽除芥子酸外的其他轉(zhuǎn)化。

蘿卜苷在甲醇溶液中時(shí)，會發(fā)生轉(zhuǎn)化，由原來的1個(gè)峰(4.54 min)轉(zhuǎn)化為2個(gè)峰，保留時(shí)間分別為3.24、4.54 min，而在乙腈中并未有此轉(zhuǎn)化發(fā)生。肉蓯蓉中松果菊苷也有類似現(xiàn)象發(fā)生，松果菊苷在甲醇中的轉(zhuǎn)化途徑主要包括糖苷鍵水解、甲基化和順式/反式異構(gòu)化[26]。

今后，本實(shí)驗(yàn)將采用離體代謝方法證明炒萊菔子中的蘿卜苷、芥子堿硫氰酸鹽及其他葡萄糖苷類化合物會在腸菌作用下發(fā)生生物轉(zhuǎn)化生成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，并且分析其代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律。