豬圓環(huán)病毒2 型檢測技術研究進展

陳 旭，湯德元，楊志剛，晏仁潭，韓超逸，羅 柳，陳閶崢，袁盛林，廖正波

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒基因組為單股負鏈環(huán)狀DNA，病毒呈二十面體對稱，無囊膜結構，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒。豬圓環(huán)病毒依據(jù)其致病性和基因組差異分為無致病性的豬圓環(huán)病毒1 型（Porcine Circovirus 1，PCV1）和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV2），豬圓環(huán)病毒3 型（Porcine Circovirus 3，PCV3），豬圓環(huán)病毒4 型（Porcine Circovirus 4，PCV4）。PCV2 主要侵害機體的免疫系統(tǒng)，引起機體繼發(fā)感染斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post-weaning multisystem wasting syn-drome，PMWS）、豬皮炎和腎病綜合征（porcine dermatitis andnephropathy syndrome，PDNS）、豬呼吸道病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）、母豬繁殖障礙、肉芽腫性腸炎、仔豬先天性震顫等疾病。2000 年，我國首次報道了PCV2 感染。目前，PCV2 感染在我國豬群中廣泛流行，種豬有很高感染率，與其他疾病混合感染現(xiàn)象嚴重。PCV2 現(xiàn)已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認為是繼豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）之后新發(fā)現(xiàn)的引起豬免疫障礙的重要傳染病病原，因此建立即時有效的檢測PCV2 的技術方法尤為重要，文章綜述了多種PCV2 檢測技術，旨在為養(yǎng)殖場PCV2 有關疾病的檢測防控提供技術支持。

1 病毒分離培養(yǎng)

PCV2 可選用豬腎細胞、PK-15細胞、豬睪丸細胞等來進行分離培養(yǎng)，取病死豬的淋巴結組織研磨，加PBS 緩沖液制成懸液，-20℃反復凍融3 次后離心取上清液，經(jīng)過濾器過濾除菌，接種易感細胞，置于37℃培養(yǎng)箱，盲傳1～3 代后進行PCV2 抗原或核酸檢測加以鑒定。何錫忠等利用有限稀釋法從含豬PCV2 的PK15 細胞中克隆得到1 株 含PCV2 高 感 染 比 例 的PK15-A8 細胞株，將該克隆株在細胞瓶中靜置培養(yǎng)，連續(xù)傳代40 代后病毒滴度最高可達107.5TCID50/mL，用生物反應器培養(yǎng)病毒滴度最高可達108.0TCID50/mL 以上。郭光富等將陽性病料懸液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后接種PK15 細胞，連續(xù)盲傳5 代后收取細胞病毒液并提取DNA，通過PCR 檢測及間接免疫熒光（IFA）鑒定出分離株為PCV2，并命名為TAIZ110926 株。Cruz TF等將PCV2 接種到添加有d-氨基葡萄糖的豬睪丸細胞中，并使用shell小瓶技術對其進行培養(yǎng)，經(jīng)歷15 次傳代后，RT-PCR 監(jiān)測結果顯示，該方法比傳統(tǒng)吸附法獲得的DNA量高出2 倍。病毒分離培養(yǎng)可以觀察到病毒接種細胞后產(chǎn)生的細胞病變，但此方法首先需要培養(yǎng)出狀態(tài)較好的病毒易感細胞，這個過程比較耗時，操作過程中容易遭到污染，且血清成本高，因此不適用于常規(guī)檢測。

2 電鏡觀察

電子顯微鏡是用電子束代替可見光的顯微裝置，一種高放大，高分辨的大型精密儀器。電鏡檢測技術主要有掃描電鏡和透射電鏡，掃描電鏡主要通過發(fā)射電子聚焦光束來掃描PCV2 樣品的表面形態(tài)確定病毒，透射電鏡則是通過電子束穿透組織和細胞來觀察PCV2 感染細胞內(nèi)的超微結構來檢測病毒。將待檢組織樣本通過固定，脫色，包埋，切片，染色等步驟制成超薄切片，在電子顯微鏡下通過調(diào)節(jié)放大倍數(shù)進行電鏡觀察。Liu Z 等使用29 nm（2.9 ?）分辨率的單顆粒冷凍電子顯微鏡觀察到PCV2 的1.67 MDa 病毒樣顆粒。電鏡法具有直觀，快捷等優(yōu)點，但是電子顯微鏡設備價格較高，且該法只能觀察病毒的外觀形態(tài)，很難與同科的病毒相區(qū)別。

3 分子生物學檢測

3.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（PCR）是利用DNA 半保留復制原理，通過溫度變化控制DNA 的變性和復性，并設計特異性引物做啟動子，加入DNA 聚合酶、dNTP，從而完成特定基因的體外復制。這是一種快速，靈敏，特異性強，對樣本純度要求較低的病原學檢測方法。在普通PCR 的基礎上，發(fā)展出了多種形式的PCR 技術，包括實時熒光定量PCR、多重PCR、數(shù)字微滴PCR、其他PCR 等。

3.1.1 常規(guī)PCR

通過提取待測樣品的DNA，將DNA 加入合適的PCR 反應體系中，調(diào)節(jié)反應溫度進行擴增，從而獲得目的基因片段，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所獲條帶是否符合目標條帶。苗麗娟等通過Genbank對豬PCV2 基因的序列進行分析，用Primer 5.0 設 計 了ORF2 基 因的擴增引物，引物的序列為P1：5′-GTCCTGGTCGTATITACTGT-3′；P2：5′-GTCACAACGCCCTCCTG-3′。首先將需要檢驗的病料凍融1～2 次后使用滅菌剪刀將病豬的脾臟、淋巴結、扁桃體等器官剪下小塊，將其剪碎后加入PBS 緩沖液進行研磨，倒入離心管中離心取上清，提取DNA，按照設計的PCR 反應體系加入所需試劑及DNA 進行PCR擴增，獲得447 bp 大小的ORF2 基因片段，敏感性檢驗分析表明檢測樣本DNA 濃度最低可達到9.8×10-4ng/μL，且PCR 反應具有良好的穩(wěn)定性和重復性。

3.1.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（qPCR）是一種在DNA 擴增反應中，以熒光化學物質(zhì)測定每次PCR 循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA 序列進行定量分析的方法。吳葉好等建立了PCV2 質(zhì)粒的熒光定量PCR。使用其所在實驗室構建并保存的感染性克隆質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-PCV1-2m-V5 作為模板，根據(jù)該質(zhì)粒的測序結果，設計1 對熒光PCR引 物（ORF2-V5 F1/R1） 和 探 針（ORF2-V5-Probe）， 經(jīng) 過 對 熒 光PCR 反應體系進行優(yōu)化后，確定以20 μ L作為反應體系，優(yōu)化后的反應體系為10 μ L 2×T5 Fast qPCR Mix（Probe），6.8 μ L ddH2O，F(xiàn)2／R2 各0.8 μ L，0.6 μ L探針，1.0 μ L模板。反應條件：95℃ 2 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s，設置40 個循環(huán)。該方法的最低檢測濃度可達1.29×101copies／μ L，且特異性和重復性試驗結果判定均為良好。

3.1.3 多重PCR

多重PCR 是在同一PCR 反應體系里加上2 對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR 反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR 相同。龐歌等為了建立PCV1 和PCV2 混合感染快速檢測的PCR 方法，根據(jù)GenBank 已發(fā)表PCV1 和PCV2 全基因組序列，設計合成4 條引物，通過構建它們的陽性質(zhì)粒、反應條件的優(yōu)化、敏感性試驗和特異性試驗，建立了PCV 多重PCR 檢測方法，可擴增出PCV1 和PCV2 長度分別為726 bp和433 bp 特異性基因片段。結果顯示，建立的PCV 多重PCR 可檢測到50 個拷貝的PCV1 和PCV2 目的基因，具有良好的特異性和敏感性。對現(xiàn)場42 份疑似PCV2 陽性的樣本進行檢測，結果表明PCV1、PCV2的陽性率分別為33.3%和45.2%，其中PCV1 和PCV2 混合感染陽性率為16.6%。

3.1.4 數(shù)字微滴PCR

數(shù)字PCR 能夠對核酸進行定量分析，通過將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器中，每個反應器的核酸模板數(shù)少于或等于1 個，這樣經(jīng)過PCR 循環(huán)之后，有1 個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號，根據(jù)相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。數(shù)字微滴PCR（ddPCR）因其高靈敏度、強抗干擾性和絕對定量等優(yōu)點被廣泛應用于動物病毒的檢測。ddPCR 與qPCR最大的不同點在于通過乳化方式獲得大量的獨立微小反應體系，使抑制劑以及其他雜質(zhì)對擴增效率的影響大大削弱，提高了檢測的穩(wěn)定性和靈敏度。同時它的絕對定量不需要依賴標準曲線來獲得，省下了制備及檢驗標準品的時間。吳朦晨等針對PCV2 ORF1 基因設計引物和探針，通過對引物探針濃度、退火溫度以及熒光閾值等條件的優(yōu)化，確定反應體系中引物和探針終濃度分別為0.7 μmol/L 和0.25 μmol/L，且退火溫度為59 ℃時，建立了具有最佳的擴增效率的PCV2 的ddPCR檢測方法。經(jīng)過特異性、靈敏性和重復性試驗，表明該檢測體系靈敏度相比傳統(tǒng)qPCR 方法高出10 倍以上，對PCV2 的最低檢測濃度可達2.93 拷貝/μL。

3.1.5 其他PCR

隨著納米技術在生命科學領域的逐步滲透，采用納米顆粒與PCR技術相結合，可以去除非特異性擴增、提高反應靈敏度。梁琳等建立了一種同時檢測PCV2 和PCV3的雙重納米PCR（nano-dPCR）方法，該方法對PCV2 和PCV3 兩種病毒的最低核酸檢測量分別為93.2和91.6 拷貝/μL，其敏感性比普通PCR 高100 倍，該方法的特異性和敏感性良好，為PCV2 和PCV3早期感染進行快速、敏感的鑒別診斷提供了新方法。大量研究表明納米材料由于其特殊的理化性質(zhì)，能夠和DNA 分子進行非共價結合。HUANG Y 等開發(fā)了一種基于超敏納米顆粒DNA 探針的PCR 測定法（UNDP-PCR）用于PCV2 檢測，該測定的靈敏度是傳統(tǒng)PCR 的500 倍，檢測限為血清中純化的PCV2 DNA的2 個拷貝和PCV2 的10 個病毒拷貝，此法能可靠地排除基于抗體檢測的假陰性結果，為現(xiàn)場PCV2 感染提供了無核酸提取，特異性強，超敏感，經(jīng)濟快速的診斷方法。

3.2 環(huán)介導等溫擴增法

環(huán)介導等溫擴增法（LAMP）是2000 年時開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，針對靶基因的6 個區(qū)域設計4 種特異引物，在恒溫條件保溫30～60 min，即可完成核酸擴增反應。QIU X 等建立了一種LAMP 方法來檢測PCV2 的2a、2b 基因型，使用此法最低可以檢測出1 個拷貝的病毒粒子，且與PCV2c 無交叉反應，為PCV2a和PCV2b 感染的大規(guī)模檢測提供了更靈敏特異的手段。廖帆等建立了PCV2 LAMP 可視化檢測方法，試驗根據(jù)PCV2 ORF1 基因中的保守序列設計合適的LAMP 引物對，63℃恒溫擴增45 min 即可出現(xiàn)梯形條帶，檢測下限為1.0×101copies/L，較普通PCR 敏感性提高100 倍，在產(chǎn)物中加入SYBR Green Ⅰ染料后可實現(xiàn)可視化檢測，對72 份臨床樣品進行檢測，PCV2 陽性率為47.2%（34/72），與qPCR 檢 測 的 符合率為98.6%，與普通PCR 的符合率為94.4%。此法的靈敏度高，特異性強，且不需要電泳，可以進行室外檢測，但反應需要的儀器價格昂貴，檢測成本較高。

3.3 重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增（RPA）技術使用重組酶與引物結合形成的復合物能在模板上尋找同源序列，定位后就會引發(fā)鏈交換反應并啟動DNA 合成對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。為了能獲得不依賴于瓊脂糖凝膠電泳且更快速的核酸擴增方法，Yang Y 等針對PCV2 ORF2 基因開發(fā)了使用實時熒光檢測（PCV2 實時RPA 測定）和RPA結合側流試紙（PCV2 RPA LFD 測定）的兩種測定方法。這兩種測定方法均可在37℃ 20 min 內(nèi)可檢測出每個反應的病毒拷貝數(shù)，對PCV2具有高度特異性和靈敏性。Wang J等開發(fā)了一種實時重組酶聚合酶擴增（RPA）測定法，該測定僅檢測PCV2，沒有與豬中重要的其他病原體發(fā)生交叉反應，以PCV2 DNA為模板，實時RPA 的分析靈敏度為103個拷貝，通過測試38 個現(xiàn)場樣品并與實時PCR 進行比較，檢測結果顯示具有100%診斷一致性，表明實時RPA 測定為快速，簡單和可靠地檢測PCV2 提供了一種替代工具，特別是在沒有專業(yè)設備儀器的偏遠農(nóng)村地區(qū)。

3.4 重組酶輔助擴增

重組酶輔助擴增（RAA）是一種等溫核酸擴增技術，可以在恒溫下快速擴增靶基因片段，使用帶有相應抗體的試紙可以目視檢測標記有特定分子的擴增產(chǎn)物。Chen W 等開發(fā)了RAA 技術與核酸試紙相結合（RAA 試紙）的檢測技術。該試紙條可以檢測到低至103拷貝/μL 含有PCV2 ORF2 基因片段的重組質(zhì)粒，病毒DNA 和病毒滴度的最低檢測限為6.7×10-6ng/μL和10 TCID50/mL，由于具有特異性強、靈敏度高、重復性好、操作方法簡單等優(yōu)點，所以PCV2 RAA 試紙適用于PCV2 現(xiàn)場的快速臨床檢測。

3.5 原位雜交法

原位雜交法（ISH）是指用特定標記的已知序列核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸序列進行精確定量定位的過程。Hansen MS 等用原位雜交法（ISH）檢測PCV2 的核酸，在受PMWS 影響的豬中，20 頭豬胸腺樣本中有19 份檢測結果為陽性，陽 性 率 為95%。Baró J 等 在96 頭患有腸道疾病并提交尸檢的豬中，72 頭豬通過原位雜交（ISH）顯示PCV2 呈陽性，陽性率為75%。

3.6 其他分子生物學方法

光學表面等離子體共振（SPR）免疫測定法是一種非破壞性、無標記、實時的檢測方法。SPR 是一種物理光學現(xiàn)象，SPR 信號隨金屬表面折射率的變化而變化，通過SPR角的生物反應過程的動態(tài)變化可以獲得生物分子相互作用的特定信號。Hu J 等基于表面等離子體共振（SPR）并建立了特殊的分子鑒定膜，研究了一種靈敏且無標記的分析方法，用于檢測血清樣品中PCV2。SPR 生物傳感方法的理論檢測限計算為0.04 μg/mL。相應地，回收率從81.0%到89.3%不等，與PCV2檢測試劑盒相比，該表面等離子體共振生物傳感系統(tǒng)通過線性度、精度和恢復率進行了驗證，證明了表面等離子體共振免疫測定是可靠和穩(wěn)健的。

4 免疫學檢測

4.1 酶聯(lián)免疫吸附測定

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法是利用抗原抗體之間專一性結合的特性，通過特異性顯色反應對抗原或抗體進行檢測。該方法具有特異性高、操作簡便、耗時少、結果便于觀察等優(yōu)點，目前被廣泛研究和應用。常見的ELISA 檢測方法有：間接ELISA，雙抗夾心ELISA，競爭性ELISA。

4.1.1 間接ELISA

間接ELISA 是用可溶性抗原包被于固相載體，洗滌，加入含有被測抗體的標本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標記抗抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色，即可測出待測抗體的量。栗利芳等建立了PCV2 合成肽間接ELISA 抗體檢測方法。試驗通過對國內(nèi)PCV2 流行毒株的序列測定并結合豬圓環(huán)疫苗毒株序列，化學合成可能的抗原位點肽段，通過血清學試驗對這些候選多肽抗原進行篩選，得到免疫原性較高的肽段，通過120 份PCV2 陽性血清篩選，選取出4 條肽段混合作為包被抗原，建立了間接ELISA 抗體檢測方法。進一步試驗可見建立的間接ELISA 方法敏感性為95.0%，特異性為97.5%，重復性穩(wěn)定性好。PCV2 自然感染和疫苗免疫都產(chǎn)生PCV2 Cap 抗體陽性的結果，因此它們無法診斷免疫豬場中的PCV2感染，CHEN Q 等建立了一種非結構蛋白（Rep’蛋白）抗體檢測方法，該方法可區(qū)分自然感染產(chǎn)生的抗體和疫苗免疫誘導的抗體。

4.1.2 雙抗夾心ELISA

雙抗夾心ELISA 法是指將特異性針對待測抗原的抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入待測抗原與固相載體上的抗體結合，而后加入生物素化的針對待測抗原的抗體，形成夾心。許兆君等建立了豬圓環(huán)病毒2型Cap 蛋白雙抗體夾心ELISA 定量檢測方法。試驗采用氯化銫密度梯度超速離心方法制備PCV2 Cap 蛋白標準品，用純化的Cap 蛋白免疫小鼠和家兔，分別獲得特異性強的單克隆抗體和親和力、敏感性較高的多克隆抗體，在此基礎上建立了雙夾心ELISA 定量檢測PCV2 Cap蛋白的抗原檢測方法。通過方陣試驗確定捕獲抗體兔多抗和酶標單抗最佳濃度都為1 ∶10 000，該方法建立的標準曲線線性相關系數(shù)大于0.99，定量檢測上限為250 ng/mL，下限為15.6 ng/mL，在此范圍內(nèi)的檢測結果可靠。

4.1.3 競爭性ELISA

競爭性ELISA 是將特異性抗體包被于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成2 組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，另一組只加酶標記抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這2 組底物降解量之差，即可測定的未知抗原的量。Mu Y 等開發(fā)了一種以納米體（Nb）-辣根過氧化物酶（HRP）融合蛋白為超敏探針的競爭性ELISA（cELISA），敏感性和特異性分別為99.68%和95.92%，該方法是一種快速可靠、低成本的基于納米體的工具，可用于當前PCV2 疫苗療效的血清學評估和PCV2 感染的間接診斷。

4.2 免疫層析試紙條

免疫層析是出現(xiàn)于20 世紀80 年代初期的一種新型的，快速的免疫分析方式。將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入待測樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動到固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應的抗原與該抗體發(fā)生特異性結合，用免疫膠體金染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。JIN Q 等成功開發(fā)出膠體金標記抗原探針的快速免疫層析試紙條，應用于PCV2 抗體的檢測，通過條帶和商用ELISA 試劑盒評估了500 個臨床豬血清樣品，免疫層析試紙條與ELISA 試劑盒的一致性為94.00%。該試紙可用作現(xiàn)場快速診斷PCV2 抗體的候選方法。

4.3 其他免疫學方法

單結構域抗體（sdAbs）和堿性磷酸酶（AP）的融合已被證明可用作免疫診斷試劑，psdAb-AP 融合效率高，需要更少的操作步驟，并且能在短時間內(nèi)結束測定。Yang S等描述了一種與堿性磷酸酶（AP）融合的單結構域抗體（sdAbs）用于檢測PCV2，為了評估psdAb-AP融合作為診斷試劑的實用性，將融合用于蛋白質(zhì)印跡（WB）、直接ELISA 和免疫細胞化學測定（ICC）。結果表明，sdAbs 與AP 的融合為開發(fā)更優(yōu)質(zhì)的免疫試劑提供了有價值的途徑，為PCV2 檢測提供了一種簡單，方便和靈敏的方法。

5 小結

PCV2 引起的豬圓環(huán)病毒病的發(fā)生對生豬生產(chǎn)有著重大影響，預防和控制該類疾病對于最大限度地減少經(jīng)濟損失至關重要。PCV2 的檢測技術數(shù)不勝數(shù)，其中病毒分離鑒定方法因其耗時長，血清成本高等缺點不適于常規(guī)檢測。電鏡觀察也因為電子顯微鏡設備價格較高，難以與同種屬病毒區(qū)別等劣勢同樣不適于常規(guī)檢測。目前，PCV2 在分子生物學方面的抗原檢測方法研究較多，如PCR，LMAP，RPA，RAA，ISH 等；而免疫學檢測方法研究較少，如ELISA，免疫層析等。許多研究人員對常用的抗原抗體檢測方法以外的新型檢測方法做了一些探索，發(fā)表了一些具備良好應用前景的PCV2 檢測鑒定方法，但仍需繼續(xù)發(fā)現(xiàn)更先進、更高效的臨床檢測技術，為臨床獸醫(yī)科技工作者建立快速、簡便、準確、實用的PCV2 檢測方法提供參考。