苦蕎不同部位酚類化合物組成與抗氧化活性

陳 月 朱 勇,2 秦禮康,2

(1. 貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學西南藥食兩用資源開發(fā)利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

苦蕎屬雙子葉蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrumesculentum)植物，學名韃靼蕎麥[1-2]。研究[3-7]表明，苦蕎具有多種保健功能，其中內(nèi)源酚類化合物是使其表現(xiàn)出這些保健功能的重要成分。課題組前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，苦蕎酚類化合物包括蘆丁、槲皮素、沒食子酸、綠原酸和2,3,4-三羥基苯甲酸，且蘆丁是主要酚類化合物。Guo等[9]研究表明，苦蕎中的蘆丁、對羥基苯甲酸、咖啡酸和綠原酸主要分布在麩皮部位，原兒茶酸是苦蕎殼中含量最豐富的酚酸，對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、咖啡酸和綠原酸等酚類物質(zhì)少量存在于苦蕎殼和苦蕎粉中。劉琴等[10]研究表明，苦蕎殼、麩皮和粉中共鑒定出8個多酚組分，其中蘆丁為主要成分，在麩皮中的含量最高(2.6%～5.4%)，殼中次之(0.34%～1.75%)，粉中最低(0.15%～0.54%)。任順成等[11]研究表明，苦蕎殼和苦蕎粉中也含有一定量的酚類化合物。Sinkovic等[12]研究了苦蕎殼、苦蕎麩皮和苦蕎粉的生物化學組成、抗氧化活性和礦物質(zhì)組成，但未對其酚類物質(zhì)組成進行分析。

目前，苦蕎加工主要集中在苦蕎粉的制備及其綜合利用，苦蕎殼和苦蕎麩皮的利用率較低。研究擬基于苦蕎殼、苦蕎麩皮和苦蕎粉的酚類化合物組成與抗氧化活性，揭示苦蕎酚類化合物及抗氧化活性在苦蕎不同部位的分布規(guī)律，為苦蕎精深加工與高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

苦蕎：黔苦3號，貴州省威寧自治縣農(nóng)牧局；

沒食子酸、福林酚、熒光素鈉鹽：美國Sigma-Aldrich公司；

蘆丁、槲皮素、綠原酸、冰乙酸、2,2'-聯(lián)氮雙-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

2,3,4-三羥基苯甲酸、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)：北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：日本TCI公司；

2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)：上海安耐吉化學有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：1200 Infinity型，美國安捷倫公司；

光吸收酶標儀：SpectraMax190型，美谷分子儀器(上海)有限公司；

多功能酶標儀：M200 PRO型，瑞士Tecan公司；

臺式高速冷凍離心機：H2-16KR型，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

高速萬能粉碎機：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

恒溫搖床：TS-100C型，上海天呈實驗儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 苦蕎研磨后過40目鋼篩，篩上物為苦蕎殼；篩下物再過60目鋼篩后，篩上物為苦蕎麩皮，篩下物為苦蕎粉。

1.2.2 酚類化合物提取 根據(jù)文獻[13-14]修改如下：1.0 g樣品與15 mL 70%乙醇混合并振蕩提取15 min，8 000 r/min離心5 min，收集上清液。剩余殘渣繼續(xù)提取2次，合并所有上清液，用70%乙醇定容至50 mL，每個樣品做3次平行，此提取液用于總酚、總黃酮、HPLC以及抗氧化活性分析。

1.2.3 總酚測定 根據(jù)文獻[15-16]修改如下：用去離子水配制一系列濃度的沒食子酸標準品溶液，并將提取液稀釋至適當倍數(shù)，100 μL提取液、100 μL沒食子酸標準溶液分別與400 μL蒸餾水混合，向混合液中加入100 μL福林酚試劑，混勻并靜置6 min，向其中加入1 mL 7% Na2CO3溶液和0.8 mL蒸餾水，室溫避光反應(yīng)1.5 h，測定760 nm處反應(yīng)液的吸光度，以沒食子酸標準液的濃度與吸光度繪制標準曲線。

1.2.4 總黃酮測定 根據(jù)文獻[17]修改如下：用60%無水乙醇配制一系列濃度的蘆丁標準品溶液，并將提取液稀釋至適當倍數(shù)，0.5 mL提取液、0.5 mL蘆丁標準溶液分別與2.25 mL蒸餾水和0.15 mL 5% NaNO2混合并反應(yīng)6 min，加入0.3 mL 10% AlCl3·6H2O并反應(yīng)5 min，加入1.0 mL 1 mol/L NaOH室溫避光反應(yīng)15 min后，測定510 nm處反應(yīng)液的吸光度，以蘆丁標準溶液的濃度與吸光度繪制標準曲線。

1.2.5 酚類化合物分析 根據(jù)文獻[8]修改如下：提取液過0.45 μm濾膜，采用裝有C18色譜柱(Agilent ZORBBAX 250 mm×4.6 mm，5 μm)的高效液相色譜儀，流動相包括乙腈(A)和1%冰乙酸(B)，洗脫程序：0～5 min， 5%～15% A；5～35 min，15%～35% A；35～40 min，35%～45% A；40～50 min，45%～5% A。流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長360 nm。利用酚類化合物標準品保留時間對樣品中未知化合物進行定性，以酚類化合物標準溶液濃度與峰面積繪制標準曲線。

1.2.6 氧自由基吸收能力(ORAC)測定 根據(jù)文獻[18-19]修改如下：用磷酸緩沖液(75 mmol/L，pH 7.4)配制一系列濃度的標準品溶液，并將提取液稀釋至適當倍數(shù)，取20 μL提取液和標準液于96孔黑板中，37 ℃孵育10 min，向每孔中加入200 μL熒光素鈉鹽溶液并再次孵育20 min，最后加入20 μL ABAP，并立即于激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm下檢測反應(yīng)液的熒光強度。每隔5 min記錄一次，共記錄35 次。以時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制熒光強度隨時間變化曲線，通過標準品的濃度對曲線下凈面積繪制標準曲線。

1.2.7 鐵離子還原抗氧化能力(FRAP)測定 根據(jù)文獻[20-21]修改如下：FRAP工作液由300 mmol/L醋酸緩沖液(pH 3.6)，10 mmol/L TPTZ溶液(溶于40 mmol/L HCl)和20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液按體積比10∶1∶1混合制備而成。用甲醇溶液配制一系列濃度的Trolox標準品溶液，并將樣品稀釋至適當倍數(shù)，取30 μL提取液和Trolox標準溶液，加入90 μL水和900 μL FRAP工作液，37 ℃下避光反應(yīng)10 min，測定593 nm處反應(yīng)液的吸光度，以Trolox標準品濃度與吸光度繪制標準曲線。

1.2.8 DPPH自由基清除能力測定 根據(jù)文獻[17，22]修改如下：用甲醇配制一系列濃度的Trolox標準品溶液，并將提取液稀釋至適當倍數(shù)，將100 μL提取液和Trolox標準溶液與4 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，測定514 nm處反應(yīng)液的吸光度，以Trolox標準品濃度與吸光度繪制標準曲線。

1.2.9 ABTS+自由基清除能力測定 根據(jù)文獻[23-25]修改如下：將7.4 mmol/L ABTS+溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，室溫下避光反應(yīng)12 h制得ABTS+儲備液；用甲醇將ABTS+儲備液稀釋至適當倍數(shù)制得ABTS+工作液(734 nm處吸光度為1.10±0.02)。用甲醇配制一系列濃度的標準品溶液，并將提取液稀釋至適當倍數(shù)，取300 μL提取液和Trolox標準溶液與6 mL ABTS+工作液混勻，室溫下避光反應(yīng)2 h，測定734 nm處反應(yīng)液的吸光度，以Trolox標準品濃度與吸光度繪制標準曲線。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準偏差表示，n=3。利用Duncan多重比較進行數(shù)據(jù)之間的差異性分析(SPSS version 21.0)，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎殼、麩皮和粉的總酚、總黃酮含量

課題組[8]前期研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎中的總酚、黃酮含量分別高達(3 018.82±57.95) mg GAE/100 g·DW和(2 778.86±25.18) mg RE/100 g·DW。由表1可知，苦蕎殼中總酚、總黃酮含量分別為(1 026±21) mg GAE/100 g·DW 和(1 555±60) mg RE/100 g·DW，占全苦蕎的20.5%和19.9%。苦蕎麩皮中總酚、總黃酮含量分別為(3 042±31) mg GAE/100 g·DW和(5 290±233) mg RE/100 g·DW，占全苦蕎的60.8%和67.7%?？嗍w粉中總酚、總黃酮含量分別為(931.1±16.9) mg GAE/100 g·DW 和(973.5±123.2) mg RE/100 g·DW，占全苦蕎的18.6%和12.5%，說明麩皮是苦蕎總酚、總黃酮的主要富集部位，也有少量存在于苦蕎殼和苦蕎粉中。劉琴等[10]研究表明，苦蕎殼、麩皮和粉中總酚含量分別為29.87～60.93，44.03～79.83，1.18～10.67 mg/g，其中麩皮中的含量最高。Guo等[9]研究表明，苦蕎粉、苦蕎殼和苦蕎麩皮游離酚、游離黃酮含量比結(jié)合酚、結(jié)合黃酮高，游離酚含量分別為苦蕎粉<苦蕎殼<苦蕎麩皮，游離黃酮含量分別為苦蕎粉<苦蕎殼<苦蕎麩皮，與試驗結(jié)果一致。因此，苦蕎麩皮含有更高的總酚、總黃酮，具有更好的健康益處。

2.2 苦蕎殼、麩皮和粉的酚類化合物組成

苦蕎殼、苦蕎麩皮和苦蕎粉中酚類化合物組成如表2所示，液相色譜圖如圖1所示。蘆丁在苦蕎麩皮中的含量為(5 152±61) mg/100 g·DW，占全苦蕎的79.8%，苦蕎殼和苦蕎粉中蘆丁含量分別占全苦蕎的6.3%和13.9%。Guo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎中的酚類物質(zhì)主要來源于麩皮，麩皮中蘆丁含量為(7 431.40±2.14) mg/100 g·DW。任順成等[11]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎麩皮中蘆丁含量為36.37 mg/g，高于苦蕎殼和苦蕎粉中的，與試驗結(jié)論一致。因此，蘆丁是苦蕎中的主要酚類化合物，這些酚類化合物主要富集在苦蕎麩皮部位，但仍有部分存在于苦蕎殼和苦蕎粉中。

表1 苦蕎殼、麩皮和粉的總酚、總黃酮含量?

表2 苦蕎殼、麩皮和粉的酚類化合物組成?

1. 蘆丁 2. 槲皮素圖1 HPLC液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram

2.3 苦蕎不同部位抗氧化活性

由表3可知，苦蕎麩皮的抗氧化活性高于苦蕎殼和苦蕎粉，其ORAC、FRAP、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分別為(1 503.3±249.5) μmol/g·DW、(8 477.5±441.1) mg TE/100 g·DW、(5 642.4±241.3) mg TE/100 g·DW 和(16 764.0±742.0) mg TE/100 g·DW?？嗍w麩皮ORAC、FRAP、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分別占全苦蕎的67.7%，68.7%，65.9%，76.6%。結(jié)果表明，苦蕎大部分抗氧化物質(zhì)來源于麩皮部位。因此，食用全苦蕎可能對健康有益，同時，苦蕎麩皮具有作為功能性食品配料的潛力，可提高苦蕎的附加值?？嗍w麩皮總酚、總黃酮、酚類化合物和抗氧化活性最高，與前人[9]的研究一致，表明苦蕎酚類物質(zhì)主要集中在麩皮部位，這可能是因為苦蕎麩皮中胚乳較少，含有種皮、糊粉層和胚組織(苦蕎籽粒的大部分營養(yǎng)和功能成分集中在胚和糊粉層中)。因此，苦蕎麩皮可以作為良好的功能食品原料。

表3 苦蕎殼、麩皮和粉的抗氧化活性?

3 結(jié)論

試驗表明，苦蕎富含酚類化合物，這些酚類化合物主要富集在苦蕎麩皮部位，其中蘆丁是主要的酚類化合物。此外，苦蕎麩皮表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，其抗氧化能力占全苦蕎的65.9%～76.6%。因此，苦蕎麩皮是苦蕎酚類化合物主要富集部位，在苦蕎功能食品加工方面具有一定的應(yīng)用潛能。后續(xù)可進一步對苦蕎麩皮進行深加工并開展相關(guān)產(chǎn)品研究。