蚯蚓堆肥對(duì)畜禽糞污耐藥基因的影響研究進(jìn)展

牟美睿，楊鳳霞，田雪力，韓秉君，李仲瀚，張克強(qiáng)

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191）

我國畜牧業(yè)規(guī)?；娘w速發(fā)展使得種養(yǎng)脫節(jié)問題日益突出[1]，畜禽養(yǎng)殖廢棄物的資源化處理和利用引起了國家和社會(huì)的廣泛關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019 年我國養(yǎng)殖廢棄物產(chǎn)生量高達(dá)40 億t[2]，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在《畜禽糞污資源化利用行動(dòng)方案（2017—2020 年）》中明確要求，到2020 年，全面提升我國畜禽糞污資源化利用能力，全國畜禽糞污綜合利用率達(dá)到75%以上[3]，畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化利用已成為我國生態(tài)環(huán)境保護(hù)和養(yǎng)殖業(yè)綠色健康發(fā)展的重大需求。近年來，蚯蚓堆肥作為一種生態(tài)友好型畜禽糞便處理方式逐漸受到人們的關(guān)注，該技術(shù)方式不僅能有效地將畜禽糞便轉(zhuǎn)化為具有更高價(jià)值的新型有機(jī)肥料，還能有效降低畜禽糞便帶來的環(huán)境污染問題，滿足養(yǎng)殖業(yè)綠色健康發(fā)展需求[4]。因此，在大力倡導(dǎo)“減肥減藥”、加強(qiáng)畜禽糞便資源化利用的背景下，“畜禽養(yǎng)殖-蚯蚓堆肥-蚓糞還田”的高值資源化生態(tài)循環(huán)模式逐漸成為我國綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要趨勢(shì)。

畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；c集約化的發(fā)展也加速了抗生素的使用，導(dǎo)致抗生素抗性細(xì)菌（Antibiotic resistant bacteria，ARB）以及抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）在畜禽糞便中大量積累[5-6]。畜禽糞便作為ARGs 的重要儲(chǔ)存庫之一，其不合理利用會(huì)造成ARGs 在環(huán)境中的積累和二次傳播，加劇ARGs 污染帶來的風(fēng)險(xiǎn)[7]。目前，在河流沉積物[8]、土壤[9]、水體[10]甚至農(nóng)作物[11]中均檢測(cè)出大量ARGs；而具有多重耐藥性甚至泛耐藥性的“超級(jí)細(xì)菌”的頻繁出現(xiàn)，也增加了人類面臨死亡的風(fēng)險(xiǎn)[12]。預(yù)計(jì)到2050年，全球死于抗生素相關(guān)疾病的人數(shù)將從2014 年的70 萬·a-1增加至1 000 萬·a-1，細(xì)菌耐藥性的危害或?qū)⒊^癌癥[13]。因此，ARGs 的污染問題引發(fā)了世界各國的高度關(guān)注[14]。與傳統(tǒng)畜禽糞便處理方式相比，蚯蚓轉(zhuǎn)化技術(shù)作為一種畜禽糞污高值資源化利用的方式，除了能夠增加有機(jī)廢棄物中生物可利用成分、提高糞便附加值外，還可以利用蚯蚓腸道內(nèi)的生物酶和微生物對(duì)畜禽糞污中的ARGs 進(jìn)行分解與轉(zhuǎn)化。另外，蚯蚓腸道也可減少ARGs 主要傳播載體——可移動(dòng)遺傳元件（MGEs），通過控制ARGs 的傳播來降低ARGs的含量[15]。然而，轉(zhuǎn)化底物畜禽糞便中ARGs含量較高且種類豐富，使得蚯蚓體內(nèi)和蚓糞中仍會(huì)檢出一定量的ARGs，而殘留的ARGs 會(huì)伴隨蚓糞的后續(xù)利用在土壤中不斷積累[16]，甚至可能進(jìn)入農(nóng)作物可食用部分污染食物鏈，最終威脅人類健康和生命安全[17]。ARGs 殘留也成為了目前綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展中限制糞肥還田、制約種養(yǎng)結(jié)合、影響生態(tài)循環(huán)的關(guān)鍵問題。

為探究我國種養(yǎng)循環(huán)綠色技術(shù)發(fā)展的前景，促進(jìn)畜禽糞便的合理資源化利用，本文在簡要論述蚯蚓堆肥畜禽糞便現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，聚焦蚯蚓堆肥及產(chǎn)物利用過程中耐藥基因的污染問題，梳理總結(jié)了轉(zhuǎn)化過程中耐藥基因的污染排放特征、環(huán)境行為規(guī)律及遷移主控因子，并提出基于“畜禽養(yǎng)殖-蚯蚓堆肥-蚓糞還田”全過程耐藥基因污染防控的建議及展望，以期為我國畜禽糞便的資源化及無害化利用提供理論支撐。

1 蚯蚓堆肥畜禽糞便技術(shù)及產(chǎn)物應(yīng)用

1.1 蚯蚓堆肥——畜禽糞便高值資源化的新興技術(shù)

由于傳統(tǒng)糞污處理方式具有一定的局限性且存在環(huán)境污染問題（表1），近年來，我國不斷推進(jìn)畜禽糞便資源化利用，促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展，逐漸出現(xiàn)了一些新型的畜禽廢棄物處理利用方式，特別是利用能以畜禽糞便為食的食腐性動(dòng)物進(jìn)行的環(huán)境友好型生物處理方式，如黑水虻處理豬糞、蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞等，一定程度上拓展了畜禽糞便的資源化利用途徑，提高了畜禽廢棄物的資源化、無害化利用比例。其中，蚯蚓轉(zhuǎn)化作為一種畜禽糞便高值資源化的新型處理技術(shù)，越來越受到人們的重視。1981 年美國學(xué)者HAIMI[23]首次嘗試?yán)抿球咎幚硇笄菁S便，隨后我國學(xué)者孫振軍等[24]對(duì)畜禽糞便-蚯蚓養(yǎng)殖技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為目前蚯蚓轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展奠定了良好的基石。蚯蚓轉(zhuǎn)化通常被稱為“蚯蚓堆肥”，是將傳統(tǒng)堆肥工藝與生物處理工藝相結(jié)合，充分發(fā)揮兩者的優(yōu)點(diǎn)并規(guī)避缺點(diǎn)的處理方法，即畜禽廢棄物經(jīng)快速發(fā)酵及殺菌等預(yù)堆制處理后，利用蚯蚓體內(nèi)的消化系統(tǒng)及微生物，進(jìn)一步分解轉(zhuǎn)化為高效農(nóng)用有機(jī)肥料[25]，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)無害化、減量化、資源化處理[22]。蚯蚓堆肥技術(shù)因投資小、附加值高且有助于實(shí)現(xiàn)畜禽糞便綠色資源化利用等優(yōu)勢(shì)，在畜禽糞污的高效資源化利用技術(shù)中逐漸嶄露頭角。

表1 畜禽糞便不同處理方式優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of different treatment methods of livestock and poultry manure

1.2 蚯蚓堆肥產(chǎn)物的應(yīng)用現(xiàn)狀

蚯蚓堆肥技術(shù)也是種養(yǎng)結(jié)合產(chǎn)業(yè)中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（蚓糞）作為畜禽糞便高效資源化利用的一種重要產(chǎn)物，不僅具有良好的通氣性和保水性，還能改善土壤結(jié)構(gòu)、提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)與產(chǎn)量。有研究表明，蚓糞的投加明顯增強(qiáng)了土壤的蓄水能力，且小顆粒蚓糞的效果大于大顆粒[24]。此外，蚓糞也是一種提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)的高效肥料[25]，IEVINSH 等[26]利用蚯蚓堆肥產(chǎn)物生產(chǎn)有機(jī)藥草，效果明顯優(yōu)于用傳統(tǒng)容器堆肥生產(chǎn)的有機(jī)藥草。YATOO等[27]的研究也發(fā)現(xiàn)利用蚓糞代替農(nóng)業(yè)傳統(tǒng)肥料，不僅能可持續(xù)地促進(jìn)作物生長、增加產(chǎn)量，還能有效抑制病蟲害的發(fā)生。蚓糞還田也可以有效緩解土壤中的污染物質(zhì)，降低土壤中壬基酚（NP）的生物有效性，通過增強(qiáng)作物的抗逆性來幫助作物應(yīng)對(duì)NP脅迫，促進(jìn)作物健康生長[21]。因此，蚯蚓堆肥產(chǎn)物的還田利用也在一定程度上加快了畜禽養(yǎng)殖糞污從達(dá)標(biāo)排放向全量利用轉(zhuǎn)變的步伐，同時(shí)助推種養(yǎng)結(jié)合農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展。

以“蚓糞”“蚯蚓肥”“蚯蚓堆肥”“Wormcast”“Vermicompost”和“Vermicomposting”為關(guān)鍵詞，選擇時(shí)間跨度為1948—2020 年，在中國知網(wǎng)（CNKI）和Web of Science 檢索到文獻(xiàn)1 474 篇（包括碩博學(xué)位論文219篇），其中近五年占比達(dá)44.84%（圖1），可見蚯蚓糞已逐漸成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。本研究在前期調(diào)研過程中也發(fā)現(xiàn)，我國大部分蚯蚓養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)主要集中在北方地區(qū)，以山東、山西為主，而利用蚯蚓糞種植則主要集中在中東部地區(qū)，以上海、江蘇為主。此外，隨著國家政策的牽引，我國部分地區(qū)已逐步形成“畜糞養(yǎng)殖蚯蚓-蚓糞還田施肥”的典型綠色循環(huán)試驗(yàn)區(qū)。李建勇等[28]研究發(fā)現(xiàn)，利用葉類蔬菜-蚯蚓種養(yǎng)模式可有效降低蔬菜復(fù)種指數(shù)，使設(shè)施土壤得到休耕，改善了土壤理化性質(zhì)，同時(shí)保障了蔬菜生產(chǎn)安全和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全，促進(jìn)了農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增效、農(nóng)民增收。蚯蚓堆肥畜禽糞便技術(shù)不僅處理效率高，且可以變廢為寶，已成為一條重要的、新型的生態(tài)循環(huán)產(chǎn)業(yè)鏈，對(duì)于促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，逐步在畜禽糞便處理及資源化利用領(lǐng)域受到重視[29]。

圖1 國內(nèi)外文獻(xiàn)變化趨勢(shì)Figure 1 The trend of the number of literatures

2 蚯蚓堆肥對(duì)畜禽糞污耐藥基因的影響及因素解析

2.1 蚯蚓堆肥底物畜禽糞污中耐藥基因的賦存特征

我國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國和消費(fèi)國，其中52%以上用于促進(jìn)動(dòng)物生長和治療疾病[30]。抗生素的長期使用會(huì)顯著提升ARGs 豐度及種類水平[31-32]，特別是在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中[33]。迄今為止，畜禽糞便中已檢出了大量的ARGs，其中四環(huán)素類ARGs（tetO、tetQ、tetW 和tetX）在糞便中的含量最高，相對(duì)豐度可達(dá)10-2～10-1copies·16S copies-1，磺胺類ARGs（sul1 和sul2）、大環(huán)內(nèi)酯類ARGs（ermB 和ermC）和鏈霉素類ARGs（aadA、strA 和strB）的污染水平次之[34]。在集約化養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場還檢測(cè)到氨基糖苷類、氯霉素類和萬古霉素類ARGs 的存在[35]。值得注意的是，與人類健康密切相關(guān)的β-內(nèi)酰胺類ARGs（bla-ARGs）曾主要出現(xiàn)在醫(yī)院環(huán)境中，近年來也越來越頻繁地出現(xiàn)在畜禽源性微生物中[36]。YANG 等[37]發(fā)現(xiàn)部分bla-ARGs 亞型在牲畜糞便中普遍存在，甚至包括高風(fēng)險(xiǎn)“超級(jí)細(xì)菌”blaNDM。蚯蚓堆肥作為一種重要的畜禽糞污處理方式[38]，其轉(zhuǎn)化原料大多來自長期使用抗生素的畜禽養(yǎng)殖場[39]，而畜禽糞便中的ARGs 隨著蚯蚓吞食會(huì)進(jìn)入蚯蚓腸道，經(jīng)蚯蚓轉(zhuǎn)化后再排入環(huán)境中，進(jìn)入受納環(huán)境中的ARGs 可在各介質(zhì)中發(fā)生二次傳播，且有可能通過食物鏈進(jìn)入人體，其傳播遷移途徑如圖2所示。

圖2 蚯蚓堆肥畜禽糞便過程中耐藥基因的遷移途徑Figure 2 The migration pathway of ARGs during earthworm transformation into animal feces

2.2 蚯蚓堆肥過程中耐藥基因的消長規(guī)律

畜禽養(yǎng)殖糞污中ARGs 的種類多樣且具有多種耐藥機(jī)制并存的污染特點(diǎn)。不同的糞便處理方式和利用模式對(duì)ARGs 的影響不同，如傳統(tǒng)好氧堆肥和厭氧堆肥等處理方法主要是通過處理?xiàng)l件的變化（如溫度、濕度、酸堿度及抗生素含量等）來改變微生物群落的結(jié)構(gòu)與組成，進(jìn)而影響ARGs 的豐度和多樣性，并非直接改變或阻止基因的水平轉(zhuǎn)移（Horizontal gene transfers，HGTs）和垂直轉(zhuǎn)移（Vertical gene transfers，VGTs）[39]。相比于傳統(tǒng)處理方式，蚯蚓堆肥可更有效地降低有機(jī)廢物中的ARGs 含量，且對(duì)豬糞、牛糞處理效果更加明顯（表2）。早在1996 年，DAANE 等[43]已經(jīng)認(rèn)識(shí)到蚯蚓對(duì)于轉(zhuǎn)移運(yùn)輸有益細(xì)菌的重要性，隨后研究者提出蚯蚓是細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的載體和貢獻(xiàn)者[44-45]。蚯蚓堆肥過程中細(xì)菌16S rDNA 基因豐度顯著降低，同時(shí)蚯蚓對(duì)攜帶ARGs 的宿主菌群具有很大的影響。轉(zhuǎn)化前期ARGs 宿主菌主要來自畜禽糞便，而后期的宿主菌主要來源于蚯蚓腸道[46]，ARGs 宿主菌的變化直接或間接地驅(qū)動(dòng)了蚯蚓對(duì)ARGs 的去除作用，有效抑制了蚯蚓堆肥產(chǎn)物中的致病菌[47]。陳景陽等[48]也證實(shí)了蚯蚓堆肥可以有效降低整合子的豐度，控制ARGs 的傳播。此外，蚯蚓和微生物的聯(lián)合作用有助于在蚯蚓堆肥過程中降解有機(jī)物成分[49]。

表2 不同畜禽糞便處理方式對(duì)耐藥基因含量的去除效果Table 2 The reduction effect of different animal manure treatment methods on the content of ARGs（copies·16S copies-1）

此外，蚯蚓腸道消化耐藥菌或激活非抗生素耐藥菌具有一定選擇性，部分ARGs（如sul-ARGs）會(huì)通過水平轉(zhuǎn)移的方式持續(xù)存在，同時(shí)蚯蚓腸道內(nèi)特殊的厭氧和酸性環(huán)境也促進(jìn)了一些重要ARGs 宿主微生物（如細(xì)菌和肌酸）的繁殖和富集[50]，致使蚯蚓堆肥對(duì)ARGs的削減存在選擇性[9]。HUANG 等[51]利用相對(duì)定量PCR 研究了蚯蚓污泥堆肥過程中四環(huán)素和喹諾酮類ARGs 的變化，發(fā)現(xiàn)蚯蚓可去除其中的qnrS 基因，但對(duì)tet-ARGs 的去除效果偏弱。而蚯蚓堆肥對(duì)相同機(jī)制的ARGs 產(chǎn)生的影響是類似的。例如，蚯蚓處理組中外排泵類基因tetC 和tetG 的豐度略有升高，但增加不顯著（P＞0.05），而核糖體保護(hù)基因tetM和tetW 的豐度都有一定的下降，且鈍化酶基因tetX 豐度顯著降低（P＜0.05）[49]。此外，動(dòng)物腸道微生物群通常被視為ARGs 的蓄水池[42]，蚯蚓腸道中53%的ARGs 來自土壤環(huán)境或畜禽糞便[52]。雖然蚯蚓堆肥有助于減少畜禽糞便中的ARGs，但轉(zhuǎn)化后蚯蚓腸道中微生物量（16S rRNA）減少會(huì)導(dǎo)致ARGs 相對(duì)豐度顯著增加，如sul1、sul2、blaTEM-1[53]。TIAN 等[54]也在蚯蚓堆肥后的蚯蚓糞中發(fā)現(xiàn)blaampc、cfr和fexA 的豐度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)?？梢?，蚯蚓堆肥技術(shù)雖然可有效降低畜禽糞便中部分ARGs，但是蚯蚓腸道及末端產(chǎn)物蚓糞中依然會(huì)殘留一定量的ARGs，且在還田利用過程中存在污染農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在合理利用蚯蚓堆肥技術(shù)實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的同時(shí)，重點(diǎn)研究轉(zhuǎn)化過程及后續(xù)利用中的ARGs污染具有重要意義。

2.3 蚯蚓堆肥過程中耐藥基因的驅(qū)動(dòng)因素分析

2.3.1 蚯蚓腸道微生物與MGEs

微生物作為ARGs 的重要載體和主要攜帶者，其活性、豐度以及多樣性的變化是驅(qū)動(dòng)ARGs 變化的重要因素[55]，同時(shí)攜帶ARGs 的微生物宿主種群結(jié)構(gòu)也成為決定ARGs 種類多樣性的重要因素之一[56-57]。蚯蚓堆肥過程的主要場所是蚯蚓腸道，利用蚯蚓腸道分泌的生物酶和微生物對(duì)畜禽糞便進(jìn)行生物分解和轉(zhuǎn)化[58]，而蚯蚓體內(nèi)前腸器官和腸道的厭氧環(huán)境以及蚯蚓的黏液排泄和需氧掘洞可以直接改變細(xì)菌群落組成及多樣性[49]。有研究表明，蚯蚓堆肥過程中細(xì)菌譜的變化對(duì)ARGs豐度的變化具有直接決定作用[59]。此外，蚯蚓堆肥也會(huì)顯著改變蚯蚓糞中攜帶ARGs 的微生物群落組成，如增加擬桿菌的相對(duì)豐度，降低變形菌、厚壁菌和放線菌的相對(duì)豐度[60]，進(jìn)而對(duì)ARGs豐度產(chǎn)生影響。另外，MGEs作為HGT過程的主要載體，在ARGs的傳播中也發(fā)揮著重要作用[61]。IntI1作為典型的MGEs 之一，可攜帶一個(gè)或多個(gè)ARGs，且與tetG、tetM、tetX、tetW、tetO、qnrS 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）[62]。HUANG 等[47]針對(duì)蚯蚓腸道內(nèi)的ARGs變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明MGEs 和土壤性質(zhì)對(duì)ARGs 變化的解釋率可達(dá)72%。目前蚯蚓堆肥過程中蚯蚓體內(nèi)微生物和MGEs的變化已被證實(shí)是ARGs 消長的主要驅(qū)動(dòng)因素，但由于蚯蚓腸道內(nèi)微生物群落的復(fù)雜性，關(guān)于不同轉(zhuǎn)化階段ARGs遷移消長的趨勢(shì)有待進(jìn)一步研究。

2.3.2 蚯蚓養(yǎng)殖條件

蚯蚓堆肥過程中養(yǎng)殖條件的變化不僅影響轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的穩(wěn)定性，還會(huì)影響轉(zhuǎn)化過程中ARGs的歸趨[63]。蚯蚓作為一種變溫、濕生動(dòng)物，環(huán)境的變化對(duì)其轉(zhuǎn)化畜禽糞便的速率具有顯著的影響。劉亞納[64]的研究表明，蚯蚓堆肥有機(jī)廢物的最適宜溫度為24.5 ℃，最適濕度范圍為60%～70%。另外，蚯蚓堆肥畜禽糞便的效率在一定范圍內(nèi)與蚯蚓的接種密度成正比。蚯蚓堆肥中不同的養(yǎng)殖條件會(huì)改變蚯蚓體內(nèi)微生物分布，包括微生物數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)ARGs 產(chǎn)生影響[65]。LI 等[66]在利用蚯蚓堆肥降解不同有機(jī)廢物過程中發(fā)現(xiàn)，蚯蚓堆肥的設(shè)備、蚓床堆肥高度以及蚯蚓密度對(duì)ARGs 的去除效果具有顯著影響。同時(shí)，在活性污泥中接種密度較高的蚯蚓會(huì)導(dǎo)致蚯蚓糞中qnrA 和qnrS 的增加[59]。目前已有研究大多集中在傳統(tǒng)堆肥處理中不同條件對(duì)ARGs 的影響，而針對(duì)蚯蚓堆肥過程不同養(yǎng)殖條件對(duì)ARGs 遷移轉(zhuǎn)化的影響研究較少。

2.3.3 畜禽糞便基質(zhì)及添加劑

蚯蚓堆肥畜禽糞便過程中影響ARGs 遷移與消長的基質(zhì)因素有多種，如畜禽糞便物料中總氮（TN）、總磷（TP）、酸堿度（pH）、碳氮比（C/N）等理化指標(biāo)，重金屬、抗生素等其他污染物以及轉(zhuǎn)化基質(zhì)中的不同添加劑等[67]。基質(zhì)的理化參數(shù)可以通過改變微生物和MGEs間接決定ARGs的去向。HE等[68]發(fā)現(xiàn)在蚯蚓堆肥過程中無機(jī)碳、總氮和總?cè)芙庥袡C(jī)碳通過影響細(xì)菌的生存來調(diào)節(jié)ARGs 通量的變化。此外，傳統(tǒng)堆肥過程中的pH、氨氮、硝態(tài)氮和總氮也可以影響和消除MGEs 的潛在宿主細(xì)菌，從而有效降低ARGs 在環(huán)境中水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[69]。另外，為促進(jìn)蚯蚓的轉(zhuǎn)化、提高蚓糞中的營養(yǎng)物質(zhì)含量，通常會(huì)在畜禽糞便中添加不同配比的添加劑，而不同添加劑會(huì)通過改變基質(zhì)的理化性質(zhì)對(duì)ARGs 的遷移產(chǎn)生影響，如在蚯蚓堆肥過程中添加富含稻殼和玉米芯的生物炭，可提高污泥基質(zhì)中ARGs（ermF、tetM和sul1）的去除率[70]。然而，由于目前蚯蚓堆肥過程中的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，仍需對(duì)蚯蚓堆肥過程中畜禽糞便基質(zhì)性質(zhì)的影響進(jìn)行進(jìn)一步探究，以期為后續(xù)選擇添加劑種類及含量提供理論依據(jù)，以降低最終產(chǎn)物中ARGs傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

2.3.4 污染物協(xié)同作用

除ARGs外，畜禽糞便中還存在著多種有毒有害污染物質(zhì)，如抗生素、重金屬等，這些物質(zhì)也會(huì)對(duì)ARGs的持久性存在和傳播產(chǎn)生直接作用[71]?？股丶爸亟饘僭陴B(yǎng)殖過程中常被用來治療畜禽細(xì)菌性疾病以及促進(jìn)生長，但抗生素和重金屬的濫用也造成其在畜禽糞便中的嚴(yán)重殘留。研究表明，抗生素在ARGs水平轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[72]，對(duì)ARGs具有一定的選擇壓力，會(huì)增加ARGs的傳播風(fēng)險(xiǎn)[73]。另外，重金屬也會(huì)通過協(xié)同抗性、交叉抗性和共調(diào)節(jié)等機(jī)制誘導(dǎo)ARGs的產(chǎn)生和富集[74]。BERG 等[75]發(fā)現(xiàn)Cu 對(duì)四環(huán)素和萬古霉素ARGs具有聯(lián)合選擇壓力，而Cu抗性基因（tcrB和cueO）的水平轉(zhuǎn)移會(huì)伴隨四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素等ARGs的轉(zhuǎn)移[76]。由此可見，畜禽糞便中的污染物也會(huì)通過相互影響、協(xié)同作用等方式對(duì)ARGs產(chǎn)生聯(lián)合作用，進(jìn)而影響蚯蚓堆肥過程中ARGs的遷移消長。綜上所述，在蚯蚓轉(zhuǎn)化過程中ARGs的遷移消長伴隨著復(fù)雜多變的生化過程，其中微生物群落結(jié)構(gòu)和MGEs是ARGs的主要驅(qū)動(dòng)因素，另外還受到轉(zhuǎn)化條件、畜禽糞便基質(zhì)性質(zhì)和其他污染物等多種因素的影響。

3 蚯蚓堆肥產(chǎn)物中耐藥基因的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及管控措施

目前，我國蚯蚓糞年產(chǎn)量已達(dá)30萬t[77]，但由于蚯蚓轉(zhuǎn)化底物中污染水平較高且ARGs 具有生物特殊性[49]，部分ARGs 會(huì)在蚓糞中殘留甚至富集[48]，如tet-ARGs 和高風(fēng)險(xiǎn)bla-ARGs，增加了蚓糞后續(xù)利用的安全風(fēng)險(xiǎn)[78]。有研究表明，ARB 和ARGs 進(jìn)入健康的生物體后，會(huì)不斷地增殖進(jìn)而在生物體內(nèi)逐漸形成對(duì)抗抗生素的耐藥模塊[79]，從而降低抗生素的治療能力。CHEN 等[9]發(fā)現(xiàn)長期施用糞肥會(huì)促使畜禽源ARGs 在植物中的積累和富集；GAO等[80]通過對(duì)糞肥種植的有機(jī)蔬菜樣品中ARGs 的研究，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于未施用糞肥的蔬菜，施用糞肥的蔬菜體內(nèi)ARGs 及相關(guān)內(nèi)生菌豐度均顯著增加。而蔬菜內(nèi)生菌中的ARGs 是人類接觸土壤抗性菌的一個(gè)潛在途徑[81]，食用含有ARGs 相關(guān)內(nèi)生菌的蔬菜存在一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。此外，在施用畜禽糞肥的大田小白菜和黃瓜中也檢測(cè)出具有抗生素耐藥性的作物內(nèi)生細(xì)菌[82]?？梢?，殘留的ARGs 會(huì)增加人類攝入ARGs的風(fēng)險(xiǎn)[83]。隨著蚓糞作為新型有機(jī)肥逐漸替代化肥，蚓糞中的ARGs 進(jìn)入農(nóng)田土壤同樣增加了ARGs 的環(huán)境輸入，也會(huì)造成受納環(huán)境中ARGs 的二次污染與傳播。TIAN 等[54]在對(duì)蚯蚓養(yǎng)殖場的研究中發(fā)現(xiàn)，ARGs 在施用蚓糞的菜田土壤中普遍存在。因此，蚓糞的還田利用也存在ARGs 向食物鏈傳播的風(fēng)險(xiǎn)。目前，關(guān)于ARGs 的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究主要集中在畜禽糞肥施用于農(nóng)田土壤中，而針對(duì)蚓糞施用的研究尚鮮見報(bào)道。因此，對(duì)畜禽糞源蚓糞還田過程中ARGs 的環(huán)境歸趨及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究是十分必要的，同時(shí)還需對(duì)蚓糞還田的途徑進(jìn)行有效管控，從而降低ARGs對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成的風(fēng)險(xiǎn)。

為解決畜禽糞源蚓糞還田過程中ARGs 污染，需要在蚓糞中ARGs 的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化、利用各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行有效管控，以最大程度地減少ARGs 向農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的排放，降低其通過食物鏈等向人體傳播的風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)ARGs 的管控策略主要以源頭控制為主，包括加強(qiáng)獸用抗生素的使用管理，加強(qiáng)養(yǎng)殖技術(shù)培訓(xùn)[84]，以及使用替代方法等[85]。蚯蚓堆肥具有降低ARGs的潛力，但降低的程度受蚯蚓養(yǎng)殖條件、堆肥底物性質(zhì)和預(yù)處理等因素的影響[63]，應(yīng)進(jìn)一步闡明這些因素對(duì)ARGs 的潛在作用機(jī)制，從而通過優(yōu)化條件降低蚯蚓堆肥產(chǎn)物中ARGs 和致病菌的豐度和多樣性。另外，有研究表明，蚯蚓糞中抗生素/重金屬的生物利用度與ARGs 豐度呈顯著正相關(guān)，且ARGs 與重金屬抗性基因（Heavy metal resistance genes，HRGs）呈顯著正相關(guān)[86]；蔬菜種類也是決定ARGs 污染的關(guān)鍵因素[87]。因此，可以通過調(diào)控畜禽源蚓糞中與ARGs 豐度變化相關(guān)的因素來降低還田利用過程中ARGs 的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。最終，應(yīng)對(duì)“蚓糞土壤-作物-人類”鏈條進(jìn)行抗性傳播的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[88]，降低蚯蚓堆肥中ARGs 對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的影響。

4 研究展望

利用蚯蚓堆肥技術(shù)進(jìn)行畜禽糞便的高值資源化利用，形成“畜禽糞便-蚯蚓-蚓糞-養(yǎng)殖/種植”生態(tài)模式，可達(dá)到以蚯蚓養(yǎng)殖為紐帶，雙向帶動(dòng)畜禽養(yǎng)殖與作物種植等循環(huán)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的目的。雖然蚯蚓堆肥技術(shù)可有效削減畜禽糞污中的ARGs，但其具有一定選擇性，致使蚓糞中仍存在較高水平的ARGs；而蚓糞中殘留的ARGs會(huì)隨著“畜禽糞便-蚯蚓-蚓糞-養(yǎng)殖/種植”這一種養(yǎng)循環(huán)鏈條進(jìn)入食物鏈，對(duì)人類和動(dòng)物健康造成威脅，這也是限制蚓糞還田、制約種養(yǎng)結(jié)合、實(shí)現(xiàn)生態(tài)循環(huán)發(fā)展的關(guān)鍵問題。然而，目前對(duì)蚯蚓堆肥畜禽糞便中ARGs 污染的研究主要集中在蚯蚓堆肥對(duì)ARGs的去除、轉(zhuǎn)化過程中ARGs的行為歸趨以及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中ARGs 的殘留，而對(duì)于蚓糞后續(xù)還田過程中ARGs的遷移規(guī)律及耐藥菌的傳播問題仍缺乏系統(tǒng)研究。因此，未來的研究應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注以下幾點(diǎn)：

（1）畜禽糞便中ARGs 種類繁多，不同畜種間存在顯著差異，雖已有研究對(duì)蚯蚓堆肥牛糞開展了部分工作，但若要全面了解和系統(tǒng)評(píng)估蚯蚓堆肥對(duì)畜禽糞便中ARGs 污染的影響，還需進(jìn)一步加強(qiáng)不同畜種、不同來源糞污的蚯蚓堆肥研究。

（2）蚓糞中殘留的ARGs 不容忽視，摸清糞源ARGs 在土壤-作物系統(tǒng)中的積累分配特征、行為規(guī)律及其驅(qū)動(dòng)因素，是控制農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 傳播和降低ARGs 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵，故開展蚓糞源ARGs 的環(huán)境行為及傳播機(jī)制的研究非常必要。

（3）蚓糞還田利用過程中ARGs 與其他共生污染物（重金屬、抗生素）的相互作用及其對(duì)蔬菜耐藥性的影響，是評(píng)價(jià)其安全食用風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要內(nèi)容，因此共存污染物對(duì)ARGs 遷移傳播的影響規(guī)律及機(jī)制亟需進(jìn)一步探究。

（4）為真正實(shí)現(xiàn)蚓糞資源化、無害化利用，推動(dòng)畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展，在全面解析“畜禽糞便-蚯蚓-蚓糞-養(yǎng)殖/種植”過程中耐藥基因的行為歸趨、遷移機(jī)制和驅(qū)動(dòng)因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)蚓糞ARGs 向農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移規(guī)律、傳輸途徑及削減措施等方面的研究，減少其帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。