不同品牌熒光定量PCR儀的性能比較及維護策略

梁 秋，劉相花，周德強，劉 偉，李 睿

熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，準確地說是實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescen quantitative-polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術，是指在PCR體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[1～3]。熒光定量PCR技術在醫(yī)學中的應用主要是癌癥的診斷、病原體檢測、基因缺陷性疾病檢測等方面[4，5]。目前，筆者所在單位投入使用的熒光定量PCR儀主要為進口醫(yī)療設備，如美國Agilent、BIO-RAD和瑞典Roche公司的產品。各品牌型號的儀器基本原理一致，但是各自有其優(yōu)缺點；如果單純依賴價格優(yōu)勢來選擇醫(yī)療設備購置肯定不能滿足各種實驗設計的需求，因此筆者主要基于日常工作實踐中收集的單位投入使用的幾大品牌熒光定量PCR儀功能信息等進行分析，從儀器的基本結構、性能參數與維護保養(yǎng)等方面來評價它們相互之間的差異，為以后工作中PCR儀維護保養(yǎng)及提高工作效率提供技術參考。

1 基本功能、結構、性能參數比較

1.1 加熱模塊

加熱模塊根據儀器的溫度均一性、升降溫的方式和升降溫的速度來體現(xiàn)熒光定量PCR儀的性能[6]，是保證樣品擴增效能的重要指標之一。筆者所在單位使用的3個品牌中Roche Light Cycler96的溫控均一性為±0.2℃，精度高于BIO-RAD CFX96的±0.4℃和Agilent Stratagene Mx3000P的±0.25℃；升降溫方式三者都是Peltier半導體模式[7]；升降溫速度BIO-RAD CFX96的5.0℃/s，高于Roche LightCycler96的升溫速度（4.4℃/s）和降溫速度（2.2℃/s）、Agilent Stratagene Mx3000P的升降溫速度（2.5℃/s）。見表1。

表1 3種品牌熒光定量PCR儀加熱模塊技術參數比較Tab.1 Comparison of heating module technical parameter in 3 brands of fluorescence quantitative PCR instrument

1.2 光源

光源是激發(fā)熒光染料，其強度和激發(fā)范圍影響擴增目的基因的信號收集[8]。Agilent Stratagene Mx3000P的光源為石英鹵鎢燈，檢測光波長為350～700 nm；BIO-RAD CFX96為6個發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED），檢測光波長為450～730 nm；Roche LightCycler96的光源為1個LED，檢測光范圍為非連續(xù)光譜。石英鹵鎢燈的光比LED的激發(fā)范圍寬，強度強，可以選用的熒光染料品種就更多，更適合做多通道的定量PCR，但是LED光源的壽命要相對長一些。因為BIO-RAD CFX96有6個LED光源，因此在強度和激發(fā)范圍上能夠彌補與石英鹵鎢燈的差異，設計最多5通道也優(yōu)于其他兩個品牌。見表2。

表2 3種品牌熒光定量PCR儀的光源技術參數比較Tab.2 Comparison of light source technical parameter of 3 brands of fluorescence quantitative PCR instrument

1.3 掃描模式

掃描模式是指儀器收集擴增后樣品熒光信號的方式，常見的分為電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）照相和逐孔掃描兩種，包括檢測器和濾光系統(tǒng)[9]。3種不同品牌熒光定量PCR儀掃描模式的比較見表3。其中Agilent Stratagene Mx3000P的檢測器為光電倍增管（photo multiplier tube，PMT），具有靈敏度高、線性范圍廣等優(yōu)點，但是成本高；BIO-RAD CFX96和Roche LightCycler96的檢測器均為LED，具有體積小、壽命長耐用的特點，區(qū)別為BIO-RAD CFX96每臺儀器具有6個LED，而Roche LightCycler96每臺儀器為單個LED。對應的濾光系統(tǒng)Agilent Stratagene Mx3000P帶有4個激發(fā)光濾鏡和4個反射光濾鏡；BIO-RAD CFX96帶有6個激發(fā)光濾鏡和6個反射光濾鏡；Roche LightCycler96帶有3個激發(fā)光濾鏡和6個反射光濾鏡。Agilent Stratagene Mx3000P和BIO-RAD CFX96均使用逐孔掃描的信號收集模式，Roche LightCycler96則為CCD照相模式。信號通量，三者都是96孔。

表3 3種品牌熒光定量PCR儀掃描模式比較Tab.3 Comparison of scanning mode in 3 brands of fluorescence quantitative PCR instrument

2 維護保養(yǎng)

后期維護服務是儀器廠家保證用戶正常、高效運行儀器，產出可靠實驗結果的重要保障。售后團隊的人數、分布的區(qū)域范圍，都決定了用戶反饋問題后售后響應速度。筆者單位目前BIO-RAD占比明顯高于其他品牌儀器，這跟筆者單位所在區(qū)域BIO-RAD的市場占有率較大有較大關系。

2.1 熒光定量PCR儀使用過程中的常見問題

①上電開機儀器無反應。應著重注意電源線是否接觸良好、保險絲是否熔斷等問題[10]。②加熱或冷卻速度緩慢。這種情況很可能是控制器問題[10]。③半導體模塊主要用于加熱或制冷，常見問題是出現(xiàn)冷凝水、滴落水珠造成電路板短路等，使用過程中應注意環(huán)境的溫度和濕度的適宜[10，11]。④灰塵影響散熱，縮短相關模塊的壽命問題[10]。

2.2 熒光定量PCR儀使用過程中的維護保養(yǎng)

①日常維護保養(yǎng)：使用潔凈抹布清潔儀器外觀，避免灰塵落入反應裝置。②定期維護保養(yǎng)：根據品牌型號特性不同，由專業(yè)工程師每半年或1年對熱循環(huán)組件和光路系統(tǒng)，包括去污染、校準溫度、光路等[12]進行維護保養(yǎng)。③質量檢測：主要對熒光信號進行檢測，以確保熒光定量PCR儀使用過程中的質量滿足臨床要求，這通常由專業(yè)的檢測技術機構來完成。

3 討論

綜上所述，從熒光定量PCR儀的幾個指標的比較可知，筆者所在單位投入使用的BIO-RAD CFX96在性能和后期維護上都具有一定的地區(qū)優(yōu)勢，而需要做某種特殊激發(fā)光源的熒光定量PCR實驗可以參考使用Agilent Stratagene Mx3000P或Roche LightCycler96，因為Agilent Stratagene Mx3000P的石英鹵鎢燈光源具有更寬的激發(fā)范圍，適用的熒光染料也更全面，而Roche LightCycler96的光源具有不連續(xù)性，表明針對特定波長的激發(fā)光源特異性較高。

熒光定量PCR儀使用質量直接關系到臨床的診斷結果，定期校準、去污染維護等，直接關系到樣本質量和實驗準確性。因此根據不同品牌型號的產品特點制定維護保養(yǎng)措施、制定檢測流程對醫(yī)院中熒光定量PCR儀的使用過程中的質量控制與診斷結果的準確性、有效性都具有重要作用。

儀器設備維護團隊成員應該主動收集儀器設備相關信息，建立完善儀器設備各項指標及相應維護責任人的信息錄入，便于后期追溯和處理。通過熒光定量PCR儀不同品牌型號差異性的比較，既使儀器設備維護團隊成員熟知掌握不同產品的性能特點，又為臨床使用過程的維護保養(yǎng)與質量控制措施提供了參考依據，提高熒光定量PCR儀的使用管理水平。