電刺激調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化作用及機(jī)制研究

陳艷梅，劉琦石，王莉輝，張 哲，余詠宜

女性盆底功能障礙性疾病是常見(jiàn)的婦產(chǎn)科疾病，孕期及分娩引起盆底支持組織損傷是主要病因；組織學(xué)特征是盆底支持組織中平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells，SMC）凋亡、膠原減少[1，2]。目前尚缺乏有效的治療手段。近些年，成體干細(xì)胞移植是受到越來(lái)越多關(guān)注的組織工程治療手段，在女性盆底功能障礙性疾病的治療中展現(xiàn)出積極應(yīng)用前景[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是來(lái)源廣泛的成體干細(xì)胞之一，具有取材方便、自我更新、多向分化等特點(diǎn)，是用于組織工程治療理想的種子細(xì)胞。

盆底神經(jīng)肌肉電刺激是治療盆底功能障礙性疾病的常用方式之一，新近有研究證實(shí)電刺激對(duì)干細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用。根據(jù)Dong ZY的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，電刺激通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路促進(jìn)神經(jīng)元干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[4]。在SMC分化的過(guò)程中，PI3K/Akt通路、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路起重要的調(diào)控作用[5]，但電刺激對(duì)干細(xì)胞向SMC分化的調(diào)控作用及機(jī)制尚不清楚。筆者以PI3K/Akt通路及ERK通路為切入點(diǎn)，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究電刺激調(diào)控BMSC向SMC分化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠5只，鼠齡8～10周，平均鼠齡9.12周（標(biāo)準(zhǔn)差0.28周）；體質(zhì)量180～200 g。由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2018-0004。

1.1.2 主要試劑

PI3K抑制劑LY294002（簡(jiǎn)稱(chēng)LY）、ERK抑制劑PD98059（簡(jiǎn)稱(chēng)PD）（MCE，美國(guó)）；四唑化合物即3-（4，5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑內(nèi)鹽[（3-（4，5-diethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）2-（4-sulfophenyl）-2H-etrazolium，inner salt，MTS]細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Promega，美國(guó)）；CD44、CD29、CD45、CD34一抗（BD，美國(guó)）；平滑肌α肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重鏈（smooth muscle-myosin heavy chain，SM-MHC）、鈣調(diào)節(jié)蛋白（calpoin）一抗（Abcam，美國(guó)）；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK一抗（CST，美國(guó)）。

1.1.3 主要儀器

細(xì)胞電刺激裝置（型號(hào)microcontrol。北京久易科儀科技公司，中國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)Form311。Thermo，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)CytoFlex。Beckman Coulter，美國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)XRS。Bio-rad，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

取大鼠脛骨及股骨的骨髓，采用干細(xì)胞分離液分離BMSC；在含有10%胎牛血清的達(dá)氏改良伊氏培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中原代培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液；待細(xì)胞匯合至70%時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

取第3代BMSC，制備成密度5×105/mL細(xì)胞懸液；將200μL細(xì)胞懸液加入1.5 mL離心管內(nèi)，分別加入2μL CD44、CD29、CD45、CD34抗體，于4℃避光條件下孵育1 h。在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD44、CD29、CD45、CD34的表達(dá)情況。

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分組與干預(yù)

取第3代BMSC進(jìn)行分組，即對(duì)照組、電刺激組、溶劑對(duì)照組、溶劑+電刺激組、LY+電刺激組、PD+電刺激組、si-NC組、si-NC+電刺激組、si-PI3K+電刺激組、si-ERK+電刺激組。每組重復(fù)5次。

對(duì)照組在DMEM中進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)10 d；電刺激組參照唐敏等[6]的研究給予電壓2 V、頻率2 Hz、脈寬5 ms的電刺激干預(yù)，2 h/d，連續(xù)10 d；溶劑對(duì)照組在含有0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM中進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)10 d；溶劑+電刺激組在含有0.1%DMSO的DMEM中進(jìn)行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；LY+電刺激組在含有20μmol/L LY294002[7]的DMEM中進(jìn)行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；PD+電刺激組在含有50μmol/L PD98059[8]的DMEM中進(jìn)行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；si-NC組轉(zhuǎn)染NC siRNA，6 h后更換為DMEM并繼續(xù)培養(yǎng)10 d；si-NC+電刺激組轉(zhuǎn)染NC siRNA，6 h后更換為DMEM并進(jìn)行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；si-PI3K+電刺激組轉(zhuǎn)染PI3K siRNA，6 h后更換為DMEM并進(jìn)行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；si-ERK+電刺激組轉(zhuǎn)染ERK siRNA，6 h后更換為DMEM并進(jìn)行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d。

1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)

取干預(yù)后第2天、第4天、第6天、第8天、第10天時(shí)對(duì)照組和電刺激組BMSC，采用MTS法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作并在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的光密度（optical density，OD）450值。

1.2.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中平滑肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白及信號(hào)通路蛋白的檢測(cè)

取干預(yù)后第10天時(shí)對(duì)照組和電刺激組BMSC，采用細(xì)胞裂解液對(duì)BMSC進(jìn)行裂解，提取BMSC中的蛋白；檢測(cè)蛋白濃度后，將含有20μg蛋白的樣本加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，用電泳分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，室溫，孵育于5%脫脂牛奶1 h；4℃條件下孵育1∶1 000稀釋的α-SMA、SM-MHC、calpoin一抗、1∶2 000稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK一抗、1∶5 000稀釋的β-actin一抗過(guò)夜；次日室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶。以β-actin條帶的灰度值為內(nèi)參，計(jì)算α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平；以信號(hào)蛋白質(zhì)相應(yīng)總蛋白質(zhì)的灰度值為內(nèi)參，計(jì)算磷酸化信號(hào)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

BMSC表面干細(xì)胞標(biāo)志基因CD44、CD90的陽(yáng)性率均在99%以上，而造血細(xì)胞表型標(biāo)志基因CD45的陽(yáng)性率僅0.1%，符合干細(xì)胞特性。見(jiàn)圖1。

2.2 電刺激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活力的影響

干預(yù)后第2天、第4天、第6天、第8天、第10天時(shí)，對(duì)照組與電刺激組BMSC的OD450水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=0.171、0.2841、0.112、0.093，P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 電刺激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的影響

干預(yù)后第10天時(shí)，電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin表達(dá)水平的比較Tab.1 Comparison of BMSC expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin between control group and electrical stimulation group

2.4 電刺激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中PI3K/Akt通路及ERK的影響

干預(yù)后第10天時(shí)，電刺激組BMSC中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組與電刺激組BMSC中p-PI3K、p-Akt、p-ERK表達(dá)水平的比較Tab.2 Comparison of BMSC expression level of p-PI3K,p-Akt and p-ERK between control group and electrical stimulation group

2.5 PI3K抑制劑及ERK抑制劑對(duì)電刺激促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的影響

溶劑+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平均高于溶劑對(duì)照組（P<0.05）；LY+電刺激組、PD+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平均低于溶劑+電刺激組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 溶劑對(duì)照組、溶劑+電刺激組、LY+電刺激組、PD+電刺激組α-SMA、SM-MHC、calpoin表達(dá)水平的比較Tab.3 Comparison of expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin in solvent group,solvent+electrical stimulation group,LY+electrical stimulation group and PD+electrical stimulation group

2.6 敲低PI3K、ERK對(duì)電刺激促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的影響

si-NC+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平均高于si-NC組（P<0.05）；si-PI3K+電刺激組、si-ERK+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平均低于si-NC+電刺激組（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 si-NC組、si-NC+電刺激組、si-PI3K+電刺激組、si-ERK+電刺激組α-SMA、SM-MHC、calpoin表達(dá)水平的比較Tab.4 Comparison of expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin in si-NC group,si-NC+electrical stimulation group,si-PI3K+electrical stimulation group and si-ERK+electrical stimulation group

3 討論

近些年，組織工程技術(shù)在組織修復(fù)中的作用受到越來(lái)越多關(guān)注，BMSC是組織工程中常用的種子細(xì)胞，用于心肌梗死[6，7]、脊髓損傷[8，9]、腦梗死[10，11]、腦外傷[12]等能夠促進(jìn)組織修復(fù)、改善臟器功能。盆底功能障礙性疾病以盆底組織結(jié)構(gòu)損傷為特征，包括壓力性尿失禁和盆腔器官脫垂，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。盆底支持組織中的SMC對(duì)維持盆底功能具有重要意義，進(jìn)行干細(xì)胞移植并促進(jìn)干細(xì)胞向SMC分化是近些年組織工程技術(shù)治療盆底功能障礙性疾病主要思路[13，14]。

干細(xì)胞具有多向分化潛能，施加一定的干預(yù)條件以促進(jìn)干細(xì)胞向SMC分化在盆底功能障礙性疾病的治療中具有重要意義。電刺激是臨床上治療盆底功能障礙性疾病的常用手段，主要通過(guò)增強(qiáng)盆底肌肉功能起到治療作用[15，16]。干細(xì)胞的相關(guān)研究證實(shí)，電刺激是誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的重要物理手段，在神經(jīng)元干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的過(guò)程中，電刺激起到促進(jìn)作用[4]。筆者將電刺激用于BMSC的干預(yù)，旨在發(fā)揮電刺激調(diào)控干細(xì)胞分化的作用。在電刺激干預(yù)后通過(guò)檢測(cè)SMC標(biāo)志蛋白α-SMA、SM-MHC、calpoin表達(dá)的方式評(píng)價(jià)SMC分化程度，結(jié)果顯示電刺激后BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平顯著增加，表明電刺激對(duì)BMSC向SMC的分化具有促進(jìn)作用。

BMSC向SMC分化的調(diào)控機(jī)制涉及復(fù)雜的生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，其中PI3K/Akt通路、ERK通路是已知參與BMSC向SMC分化調(diào)控的信號(hào)通路。根據(jù)Wei S等[5]研究，激活PI3K/Akt通路和ERK通路對(duì)SMC的分化具有促進(jìn)作用。另有電刺激相關(guān)的研究證實(shí)，電刺激對(duì)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt通路、ERK通路的激活具有促進(jìn)作用[17～19]。筆者研究在使用電刺激對(duì)BMSC進(jìn)行干預(yù)后觀(guān)察到細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的表達(dá)水平顯著增加，表明電刺激對(duì)BMSC中PI3K/Akt通路、ERK通路的激活具有促進(jìn)作用，調(diào)控上述信號(hào)通路可能是電刺激促進(jìn)BMSC向SMC分化的分子機(jī)制。

為了進(jìn)一步明確PI3K/Akt通路、ERK通路在電刺激促進(jìn)BMSC向SMC分化中的作用，筆者分別通過(guò)使用信號(hào)通路抑制劑及轉(zhuǎn)染siRNA的方式進(jìn)行驗(yàn)證。LY294002和PD98059分別是目前使用最廣泛的PI3K抑制劑和ERK抑制劑，對(duì)兩種信號(hào)蛋白的磷酸化具有抑制作用，進(jìn)而抑制信號(hào)通路的激活。在電刺激干預(yù)的同時(shí)加用信號(hào)通路抑制劑，細(xì)胞中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平顯著降低。轉(zhuǎn)染siRNA是特異性敲低基因表達(dá)的有效手段，在電刺激干預(yù)的同時(shí)轉(zhuǎn)染PI3K或ERK的siRNA，敲低PI3K或ERK的表達(dá)后，細(xì)胞中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果表明信號(hào)通路抑制劑及敲低信號(hào)蛋白表達(dá)均能削弱電刺激對(duì)BMSC向SMC分化的促進(jìn)作用，進(jìn)而表明電刺激促進(jìn)BMSC向SMC分化的作用與激活PI3K/Akt通路、ERK通路有關(guān)。