一種離體心房肌細胞壓應(yīng)力超負荷模型的建立方法

郭秋哲，潘湘斌，楊為民

心房顫動（簡稱房顫）常見而高危[1]。2020年《中國心血管健康與疾病報告》統(tǒng)計中國房顫患病人數(shù)約487萬人，60歲以上人群房顫患病率接近2%[2]，引發(fā)心力衰竭、卒中是其主要危害[3]。多種病因、誘因長期交互作用導(dǎo)致心房電-解剖重構(gòu)是房顫發(fā)生和持續(xù)的重要基礎(chǔ)[4]。在生理情況下左心房壓≤8 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），病理情況下可＞25 mmHg[5，6]。左心房壓升高和容積增大的程度與房顫發(fā)生、持續(xù)、治療成功率、復(fù)發(fā)率等密切相關(guān)，但力學(xué)因素導(dǎo)致房顫的分子機制遠未闡明[7，8]。目前房顫治療主要依賴腔肺靜脈電隔離及抗心律失常藥物，對導(dǎo)致心房電-解剖重構(gòu)的上游因素缺乏有效干預(yù)手段，研究房顫的力學(xué)機制對于改善房顫治療現(xiàn)狀意義重大[9]。既往在體研究通過構(gòu)建二尖瓣反流或主動脈縮窄升高心房壓，但應(yīng)力不可控且受到神經(jīng)體液干擾[10，11]。離體實驗可排除神經(jīng)體液干擾，研究單一應(yīng)力對細胞的影響，是探索心房機械-電反饋過程和房顫力學(xué)機制的有效手段。

心房近似一球形壓力容器，心房肌細胞承受的主要應(yīng)力包括垂直于心房壁（心房徑向）的壓應(yīng)力和與心房壁相切（心房環(huán)向）的牽張應(yīng)力[12]，除此之外還有切應(yīng)力和扭轉(zhuǎn)。病理情況下由于瓣膜病變或左心室順應(yīng)性下降，左心房壓升高，心房壁內(nèi)各應(yīng)力相應(yīng)增大[13]。牽張應(yīng)力在房壁內(nèi)分布較均勻，其內(nèi)外表面間的應(yīng)力差較小，而壓應(yīng)力則呈現(xiàn)明顯的由內(nèi)到外遞減趨勢，內(nèi)外表面的壓應(yīng)力分別接近于腔內(nèi)壓和腔外壓[14]。不均勻的壓應(yīng)力可能導(dǎo)致其力學(xué)效應(yīng)也呈不均勻分布，而心房肌細胞電生理特性是否均勻及其離散程度與心律失常發(fā)生關(guān)系密切[15]，因此與牽張應(yīng)力、切應(yīng)力相比，壓應(yīng)力對房顫力學(xué)機制更為重要。

已有研究通過牽拉接種于彈性膜的心肌細胞實現(xiàn)離體細胞的的牽張刺激[16]。但國內(nèi)外尚無對壓應(yīng)力精細刻畫的心肌細胞模型。在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、黃韌帶成纖維細胞的力學(xué)研究中，已通過離心培養(yǎng)方式對細胞施加壓應(yīng)力刺激，并可通過離心機轉(zhuǎn)速估算所施加壓應(yīng)力的大小[17，18]。筆者設(shè)計培養(yǎng)箱內(nèi)離心裝置，對原代培養(yǎng)的乳鼠心房肌細胞施加不同強度壓應(yīng)力刺激，構(gòu)建離體心房肌細胞壓應(yīng)力超負荷模型，檢測壓應(yīng)力刺激后細胞的活性及形態(tài)，為研究壓應(yīng)力相關(guān)的房顫分子機制提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗動物

選擇出生0～3 d、常規(guī)飼養(yǎng)的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠30只，體質(zhì)量5～10 g，雌雄不限。由昆明醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物使用許可證號SCXK（滇）K2020-0004。

1.1.2 主要試劑、儀器

達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液（Dulbecco modified Eagle’s medium，DMEM）高糖培養(yǎng)液（Corning，美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Sigma-Aldrich，美國）；胰蛋白酶（Gibco，美國）；Ⅱ型膠原酶（Life，美國）；新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）（Hyclone，美國）；青霉素（Hyclone，美國）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine，Brdu）（Sigma-Aldrich，美國）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Amresco，美國）；3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁）（內(nèi)鹽）[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，inner salt，MTS]細胞活性檢測試劑（Promega，美國）；鬼筆環(huán)肽（Cytoskeleton，美國）；小鼠抗大鼠α橫紋肌輔肌動蛋白單克隆抗體（Abcam，美國）。

壓應(yīng)力離心機（長沙湘儀儀器有限公司，中國）；電子溫度計（成都環(huán)安儀表有限公司，中國）；細胞培養(yǎng)箱（SANYO，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）；全波長多功能熒光比色儀（Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建壓應(yīng)力刺激裝置

實驗設(shè)計的離體心房肌細胞壓應(yīng)力刺激裝置由以下部分組成。①離心機選用中國產(chǎn)水平轉(zhuǎn)子離心機，機身大小適合被整體放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)（圖1A），離心轉(zhuǎn)子體懸掛4枚可容納50 mL離心管的水平轉(zhuǎn)子。②特制離心用細胞培養(yǎng)瓶，為圓柱形平底螺紋蓋玻璃瓶，底面積約3.7 cm2，高10 cm，可安置于轉(zhuǎn)子內(nèi)（圖1B）；培養(yǎng)瓶底面與12孔板細胞爬片兼容，用于細胞接種及培養(yǎng)。③細胞培養(yǎng)箱為常規(guī)二氧化碳（CO2）孵箱，可保證離心過程中氧氣（O2）濃度、CO2濃度、pH值、濕度等滿足細胞培養(yǎng)所需條件。④電子溫度計探頭貼附于離心機內(nèi)腔；通過監(jiān)測離心機腔內(nèi)溫度實時調(diào)整培養(yǎng)箱溫度，保證離心過程中細胞的環(huán)境溫度處于生理范圍。

1.2.2 SD大鼠乳鼠原代心房肌細胞獲取、培養(yǎng)

取SD乳鼠，用75%乙醇溶液清洗乳鼠后呈仰臥位固定，消毒軀干皮膚，沿左側(cè)腋中線剪開并去除前胸壁（圖2），迅速離斷升主動脈及氣管，一并取出心肺置于冷磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）中。更換另外一套無菌器械，逐葉剔除肺葉，用PBS反復(fù)清洗并去除血凝塊，修剪并去除厚壁、圓潤、搏動有力的心室組織，保留薄壁松軟的心房組織。

將心房組織剪成最大直徑約0.5 mm碎塊，向其中加入5 mL 0.05%胰酶+0.05%Ⅱ型膠原酶消化液，于37℃條件下水浴5 min；隨后吹打，自然沉淀，反復(fù)消化5～10次，棄去第一次消化上清液，其余上清液加入含10%NBS的DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化，將細胞懸液用100μm無菌細胞濾網(wǎng)過濾后移入離心管，于1 000 r/min室溫離心5 min。棄上清液，加入含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，將細胞團打散為單細胞懸液。

通過差速貼壁的方法純化心房肌細胞：將單細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，然后將細胞培養(yǎng)瓶放置于37.0℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h；平穩(wěn)取出細胞培養(yǎng)瓶，吸取出細胞懸液，將成纖維細胞及上皮細胞等大部分貼壁較快的細胞去除。

調(diào)整細胞數(shù)為5×105/mL，加入Brdu使其終濃度為0.1 mmol/L，將細胞接種入培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)瓶經(jīng)清潔、泡酸處理，使用前分別置入一片直徑2 cm細胞爬片于玻璃瓶底部，一并行高溫、高壓蒸汽滅菌，接種前24 h用0.2%明膠對培養(yǎng)瓶進行打底。接種細胞后，將培養(yǎng)瓶逐個松口放置于孵箱，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，換不含Brdu的DMEM高糖培養(yǎng)液。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、大小、貼壁情況、搏動情況并拍照記錄。

1.2.3 心肌細胞鑒定

培養(yǎng)48 h后取出細胞爬片，置入12孔培養(yǎng)板中，預(yù)溫的PBS洗滌3次；用4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min，洗滌3次。用0.1%Triton X-100打孔，再用0.1%BSA封閉非特異性反應(yīng)。將小鼠α橫紋肌輔肌動蛋白抗體（一抗）用1%BSA按1∶200稀釋，于4℃條件下孵育過夜。洗滌后用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記二抗室溫下避光孵育2 h。用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色細胞核。在共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。于60倍顯微鏡下任選10個視野，計數(shù)陰性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，重復(fù)3次求平均值，陽性細胞率（%）=（細胞總數(shù)－陰性細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 實施壓應(yīng)力刺激

將原代培養(yǎng)的心房肌細胞分低壓應(yīng)力組、高壓應(yīng)力組、對照組3組，每組細胞n=4，體外培養(yǎng)周期均96 h。兩個實驗組細胞在培養(yǎng)48 h后分別按轉(zhuǎn)速375 r/min、735 r/min離心培養(yǎng)48 h，對照組細胞不施加離心刺激，其余過程同實驗組。

細胞培養(yǎng)42 h后，更換含4%NBS的DMEM高糖培養(yǎng)液對所培養(yǎng)細胞進行饑餓處理，同時對離心機行紫外線照射消毒，用0.1%苯扎溴銨溶液消毒離心機內(nèi)腔，并將離心機整體放入37.0℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱內(nèi)預(yù)熱。饑餓培養(yǎng)6 h后，再次更換含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，將細胞培養(yǎng)瓶松口置入預(yù)先經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌的離心機轉(zhuǎn)子中，并將轉(zhuǎn)子安置于離心機內(nèi)。離心機腔內(nèi)貼附電子溫度計以監(jiān)測腔內(nèi)溫度。按既定轉(zhuǎn)速及時間對所培養(yǎng)細胞實施離心刺激，期間每2 h記錄離心機腔內(nèi)溫度，并通過設(shè)置孵箱溫度調(diào)整腔內(nèi)溫度于37.0℃～37.5℃。

低轉(zhuǎn)速與高轉(zhuǎn)速分別對應(yīng)壓應(yīng)力為0.931 kPa（7 mmHg、9.5 g/cm2）及3.591 kPa（27 mmHg、36.7 g/cm2），分別模擬生理及病理情況下左心房內(nèi)壓力（表1）。

表1 實驗分組及壓應(yīng)力實施Tab.1 Comparison of experiment grouping and compressive stress implementation in 3 groups

壓應(yīng)力依據(jù)相關(guān)文獻提供的公式計算[17，18]：P=（m×r×r.p.m.2×π2）/（A×9.8×900），其中：P為細胞所受壓應(yīng)力（kg/cm2）；m為培養(yǎng)液質(zhì)量；r為離心半徑；r.p.m.為離心轉(zhuǎn)速；A為培養(yǎng)液與細胞接觸面積。

1.2.5 MTS法檢測細胞活性

選用直徑為1 cm的細胞爬片供細胞貼附，其余細胞培養(yǎng)及壓應(yīng)力刺激流程同上述。完成心房肌細胞培養(yǎng)及壓應(yīng)力刺激48 h后分別將各組細胞爬片逐個置入48孔培養(yǎng)板內(nèi)，細胞面朝上，每孔內(nèi)分別加200μL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液及40μL MTS檢測試劑，另在3個空白孔內(nèi)加上述培養(yǎng)液及試劑，用于熒光比色儀校零。將培養(yǎng)板再次放回細胞孵箱內(nèi)孵育2 h，取出培養(yǎng)板上機，使用熒光比色儀讀取各樣本490 nm波長處的光密度（optical density，OD）值，通過比較各組間OD值，可比較各組間活細胞相對數(shù)量。

1.2.6 細胞骨架染色和細胞面積計算

完成48 h離心刺激后，將實驗組及對照組細胞爬片取出，置入12孔培養(yǎng)板內(nèi)；細胞面朝上，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min，洗滌3次后加入0.1%Triton X-100對細胞進行打孔；用濃度100 nmol/L鬼筆環(huán)肽室溫下避光孵育30 min，用DAPI染色細胞核，于熒光顯微鏡下觀察并攝片。攝片后每組選取50個細胞輪廓清晰、不重疊、單個核且非分裂相的細胞。使用Image JX2軟件對所選取細胞輪廓進行描計，對細胞面積進行計算。比較各組間細胞面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析行多組間比較，采用獨立樣本t檢驗行兩組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 壓應(yīng)力刺激裝置的建立和運行

實驗組建立的細胞壓應(yīng)力刺激裝置整體運行良好，可同時離心4個細胞樣品，在0～4 000 r/min轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)對細胞施加應(yīng)力刺激，所選用轉(zhuǎn)子體為水平轉(zhuǎn)子體，細胞所受應(yīng)力方向與離心-重力綜合方向，即細胞沉降方向一致，近似垂直于接種底面。離心機運行過程中保持半開蓋狀態(tài)，有利于培養(yǎng)箱內(nèi)氣體向離心機腔內(nèi)有效彌散，確保培養(yǎng)瓶區(qū)域的濕度、O2、CO2濃度與培養(yǎng)箱整體環(huán)境保持一致。

由于機械產(chǎn)熱，在離心過程中，離心機腔內(nèi)溫度有升高趨勢，呈現(xiàn)離心機腔內(nèi)溫度和培養(yǎng)箱溫度不一致。實驗觀察到各組培養(yǎng)箱及腔內(nèi)溫度差值△t隨離心過程逐漸升高，在6 h后趨于恒定。高壓應(yīng)力組最高△t約2℃，通過實時調(diào)控培養(yǎng)箱溫度，可穩(wěn)定維持離心機腔內(nèi)溫度于37.0℃～37.5℃，各時間點的培養(yǎng)箱溫度設(shè)置及腔內(nèi)溫度記錄見圖3，完成離心后即刻測量各組細胞培養(yǎng)液溫度分別為37.2℃±0.2℃、37.3℃±0.1℃和37.2℃±0.1℃（P=0.46）。

2.2 SD大鼠乳鼠心房肌細胞的分離、純化、培養(yǎng)及鑒定

2.2.1 心房肌細胞的分離、培養(yǎng)結(jié)果

采用He J等[19]報道的成熟方法完成SD大鼠乳鼠心房肌細胞提取、消化、分離、純化和體外原代培養(yǎng)。分離心房組織時，選擇先將心肺一并取出胸腔，再逐葉剔除肺葉，較直接在胸腔內(nèi)剪取心臟可保留更完整的心房組織。心房組織經(jīng)適當(dāng)修剪后，加酶吹打5～8次可基本完成心肌組織消化，殘留部分血管組織。分離后的細胞經(jīng)差速貼壁接種于培養(yǎng)瓶，12～24 h后細胞完全貼壁，細胞密度70%～80%，細胞多呈長梭形或三角形，48 h后細胞貼壁更充分，部分細胞呈不規(guī)則多邊形，可見單個細胞搏動（圖4）。心房肌細胞與相同方法分離的心室肌細胞比較，搏動頻率較慢，收縮力較弱；與心房成纖維細胞比較，心房肌細胞胞質(zhì)更飽滿，胞核明顯。

2.2.2 心房肌細胞鑒定結(jié)果

用免疫熒光染色法檢測心肌細胞中特異性α-橫紋肌輔肌動蛋白，對培養(yǎng)細胞進行鑒定?？梢娦募〖毎禺愋缘臋M紋，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像（圖5），胞質(zhì)經(jīng)綠色熒光染色呈陽性的為心肌細胞；心肌細胞純度約達90%～95%。

2.3 壓應(yīng)力刺激對心房肌細胞形態(tài)的影響

通過鬼筆環(huán)肽分別對對照組、低壓應(yīng)力組及高壓應(yīng)力組心房肌細胞骨架染色，熒光顯微鏡下觀察并攝片（圖6），以對照組細胞面積的均值為基準(zhǔn)，計算實驗組每個細胞的相對面積。通過方差齊同性檢驗后（Levene=2.38，P=0.10），經(jīng)單因素方差分析，3組細胞相對面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1.00±0.23 vs 1.20±0.16 vs 1.59±0.20。F=108.88，P＜0.05；圖7）；組間兩兩比較，低壓應(yīng)力組細胞面積大于對照組（P＜0.05），高壓應(yīng)力組細胞面積大于低壓應(yīng)力組及對照組（P＜0.05）。由此可見，體外培養(yǎng)心房肌細胞施加離心所致的壓應(yīng)力可改變心房肌細胞面積，心房肌細胞面積隨壓應(yīng)力刺激強度增加而增加。

2.4 壓應(yīng)力刺激對心房肌細胞活性的影響

采用MTS法檢測3組細胞活性。熒光比色儀測得3組細胞的OD值分別為0.50±0.02、0.57±0.03、0.50±0.01，經(jīng)方差齊同性檢驗（Levene=0.59，P=0.58），單因素方差分析，3組間OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.76，P＜0.05）。組間兩兩比較，低壓應(yīng)力組細胞活性高于對照組和高壓應(yīng)力組（P＜0.05），高壓應(yīng)力組細胞活性與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.69）。提示體外培養(yǎng)的心房肌細胞暴露于壓應(yīng)力環(huán)境仍可存活且細胞活性發(fā)生變化，低強度壓應(yīng)力刺激引發(fā)的心房肌細胞活性增加在高強度壓應(yīng)力刺激時消失。見圖6、7。

3 討論

心房力學(xué)（機械）環(huán)境改變常見于易發(fā)房顫的疾病，如瓣膜病、高血壓等，表現(xiàn)為心房內(nèi)壓力升高和心房擴大。力學(xué)因素對于房顫發(fā)生、發(fā)展格外重要，大量研究顯示心房擴大程度與房顫發(fā)生、維持、根治性治療成功率及房顫復(fù)發(fā)密切相關(guān)。半個世紀以來，隨著歐美發(fā)達國家疾病譜變化，瓣膜病尤其是二尖瓣狹窄已經(jīng)不再是房顫的首要病因，有人認為力學(xué)機制對于房顫已不再重要，但這種觀點混淆了病因機制在疾病中的權(quán)重和與疾病的關(guān)聯(lián)性，力學(xué)因素與房顫之間的強關(guān)聯(lián)不應(yīng)由于瓣膜病發(fā)病率下降而受到忽視。

如將左右心房分別視為規(guī)則、均勻、連續(xù)、由單一材料構(gòu)建的球形薄壁壓力容器，則其中任意點所受應(yīng)力包括徑向壓應(yīng)力和環(huán)向牽張應(yīng)力（σ）（圖8），球壁內(nèi)表面壓應(yīng)力的大小約等于腔內(nèi)壓（P），并向外表面逐層遞減至腔外壓力（P’），由于左右心房并非規(guī)則球形；心房壁因梳狀肌而厚薄不均；三腔/肺靜脈及房室瓣使心房壁不連續(xù)；心肌細胞和細胞外基質(zhì)存在截然不同的力學(xué)特性；在心房壁不同結(jié)構(gòu)之間及心內(nèi)膜面還存在切應(yīng)力的影響……心房整體應(yīng)力分布比理想模型復(fù)雜得多，準(zhǔn)確計算心房內(nèi)應(yīng)力的大小和方向非常困難，但各應(yīng)力的大小與腔內(nèi)壓力呈正相關(guān)。病理生理情況下，由于瓣膜病變或左心室順應(yīng)性下降，導(dǎo)致左心房內(nèi)壓力升高，心房壁內(nèi)牽張應(yīng)力、壓應(yīng)力及切應(yīng)力相應(yīng)增加。研究證實心房電生理特性的均一性對于正常電活動至關(guān)重要，不均一性增加，例如傳導(dǎo)各向異性增加和復(fù)極離散度增加，往往是折返形成和房顫發(fā)生的基礎(chǔ)[15]。因此筆者所在團隊認為，天然分布不均勻的壓應(yīng)力比牽張應(yīng)力對于房顫意義更為重大。

既往生物力學(xué)研究存在的一個突出問題是將心房內(nèi)壓的升高簡單理解為心肌細胞所受牽張應(yīng)力的增加，而忽視了心房力學(xué)構(gòu)成的復(fù)雜性。現(xiàn)有的離體研究均通過將心肌細胞接種于商品化或自制的彈性膜牽拉裝置實現(xiàn)，至今仍無一款成熟系統(tǒng)能對離體心房肌細胞施加壓應(yīng)力刺激。

用離心方式對心房肌細胞施加壓應(yīng)力的設(shè)想來自于其他器官、系統(tǒng)的研究[17，18]，不難發(fā)現(xiàn)，眼球與心房同為球形壓力容器，在病理情況下均可發(fā)生腔內(nèi)壓力升高。該方法的原理是：細胞在離心環(huán)境下受到離心力作用，有向外移動并遠離中心的趨勢，而細胞培養(yǎng)瓶的底面則對細胞施加反作用力，維持細胞在空間中相對位置不變，該反作用力就是底面對細胞的單軸單向壓應(yīng)力。該方法的優(yōu)點是應(yīng)力施加穩(wěn)定、持續(xù)、可控并且在一定程度上可量化。但目前沒有商品化的細胞離心培養(yǎng)裝置，須自主構(gòu)建。

構(gòu)建該裝置面臨的首要問題是如何確保細胞同時處于離心狀態(tài)和良好的培養(yǎng)環(huán)境。在筆者研究中將離心機置于培養(yǎng)箱環(huán)境下，有效控制了離心期間細胞生長所需的濕度、O2和CO2濃度，但實驗發(fā)現(xiàn)在離心過程中必須對培養(yǎng)箱溫度進行實時調(diào)整，否則離心機腔內(nèi)溫度可能在離心過程中伴隨器械產(chǎn)熱逐漸升高并超過細胞生理范圍。該裝置面臨的另一個問題是如何讓細胞培養(yǎng)容器與商品化的離心機兼容。筆者采取的方法是設(shè)計并定制適配的玻璃材質(zhì)培養(yǎng)瓶，每次重復(fù)使用前經(jīng)過泡酸、清洗、消毒過程，置入細胞爬片并用明膠打底預(yù)處理。該方法可以確保細胞貼壁良好，完成離心后玻片易取出，便于對細胞進一步研究。細胞培養(yǎng)環(huán)境中大多數(shù)材料如細胞爬片、培養(yǎng)瓶及離心機掛杯轉(zhuǎn)子均可行高溫、高壓消毒，實驗過程中未發(fā)生細胞污染。

驗證細胞所受應(yīng)力的類型和強度比較困難，在實驗中筆者借助鬼筆環(huán)肽對細胞骨架進行染色。由于細胞與接觸面的貼附程度越佳，細胞面積通常越大，而作用方向垂直于接種底面的壓應(yīng)力可能有助于心肌細胞貼壁，促進其在所貼附材料表面的延展。在實驗中筆者觀察到心房肌細胞面積隨離心強度逐漸增加，與預(yù)期一致，提示壓應(yīng)力刺激有效。

通過MTS法檢測心房肌細胞活性，筆者發(fā)現(xiàn)低壓應(yīng)力組細胞活性高于對照組和高壓應(yīng)力組，高壓應(yīng)力組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。首先，該結(jié)果顯示離心培養(yǎng)沒有導(dǎo)致大量心肌細胞死亡和活性下降，證明該方法安全、可行；此外，低壓應(yīng)力下細胞活性升高，提示生理性的壓應(yīng)力環(huán)境可能有助于心房肌細胞貼壁、存活，而超生理范圍的壓應(yīng)力刺激，則開始呈現(xiàn)損傷效應(yīng)，不利于心肌細胞存活。

4 結(jié)論

筆者構(gòu)建的離體細胞壓應(yīng)力超負荷模型具有良好的安全性、有效性和可重復(fù)性，通過離心向培養(yǎng)環(huán)境中的心房肌細胞施加定量、定時的壓應(yīng)力刺激后，SD大鼠乳鼠心房肌細胞可以存活，細胞形態(tài)和活性隨壓應(yīng)力強度發(fā)生變化。該模型可為進一步探索壓應(yīng)力相關(guān)的心房機械-電反饋機制提供方法學(xué)基礎(chǔ)。