微生物誘導(dǎo)碳酸鹽巖沉淀過程及作用機(jī)理

高旭波，潘振東，龔培俐，江 玉，李成城，李鴻煜

（中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院, 湖北 武漢 430074）

0 引 言

當(dāng)前，全球生態(tài)環(huán)境、地質(zhì)環(huán)境形勢十分嚴(yán)峻，發(fā)展基于生物過程的地質(zhì)環(huán)境修復(fù)技術(shù)是我國生態(tài)環(huán)境保護(hù)和綠色可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。對于環(huán)境重金屬修復(fù)，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)修復(fù)方法，如化學(xué)沉淀法、氧化還原法和理化吸附法等得到了廣泛的應(yīng)用。但傳統(tǒng)的治理方法存在成本較高、能耗大、使用大量化學(xué)藥品等缺點(diǎn)。生物法作為一種仿生工程，具有綠色環(huán)保的特點(diǎn)。其原理是微生物通過自身的新陳代謝活動固定或降解環(huán)境中的污染物，與電化學(xué)處理、離子交換、沉淀、反滲透、蒸發(fā)和吸附等物理化學(xué)方法相比，生物修復(fù)方法具有成本更低，效率更高等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。其中，微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀過程已被證明可以有效地固定環(huán)境中的多種重金屬，降低土壤和水體中的重金屬濃度[4]。其主要作用過程為，微生物通過新陳代謝活動，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物CO32-，并且在環(huán)境適宜的條件下，與環(huán)境中Ca2+相互作用而形成了碳酸鈣沉淀，在形成碳酸鈣的過程中固定環(huán)境中的重金屬離子，微生物代謝過程包括：尿素分解、氨基酸氨化、反硝化、異化硫酸鹽菌的還原、光合作用、甲烷氧化等[5-9]。其中利用尿素還原菌分解尿素而誘導(dǎo)碳酸鹽鈣沉淀這一途徑因具有過程簡單、容易控制、短時間內(nèi)就能產(chǎn)生大量的碳酸鹽類沉淀等特點(diǎn)，已被廣泛用于重金屬固定的研究中[1-3]。近年來，該領(lǐng)域研究涵蓋了生物科學(xué)與無機(jī)化學(xué)、生物物理學(xué)和材料科學(xué)等多個學(xué)科交叉，關(guān)于生物誘導(dǎo)礦化的研究及其在各個領(lǐng)域應(yīng)用十分引人注目[10]，特別是生物誘導(dǎo)礦化作用為環(huán)境修復(fù)提供了一種新的思路。

1 微生物誘導(dǎo)下碳酸鹽沉淀機(jī)制

碳酸鈣的生物礦化主要有三種途徑[6,11]：

（1）生物控制礦化過程（Biologically Controlled Mineralization (BCM)）：所產(chǎn)生礦物的成核位置、組成成分以及礦物形態(tài)由微生物的代謝活動準(zhǔn)確地控制，如原生動物和軟體動物的貝殼或珊瑚礁等。

（2）生物誘導(dǎo)礦化過程（Biologically Induced Mineralization (BIM)）：微生物的各種代謝途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與環(huán)境中存在的離子之間的相互作用而生成間接沉淀，如尿素分解菌水解環(huán)境中的尿素，釋放大量OH-以及CO32-，OH-提供了可生成碳酸鈣的堿性環(huán)境，釋放的CO32-與環(huán)境中存在的Ca2+相結(jié)合生成碳酸鈣礦物。

（3）生物影響礦化（Biologically Mediated Mineralization (BMM)）：該過程為有機(jī)基質(zhì)與有機(jī)和/或無機(jī)化合物相互作用，而不需要細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的生物活性。

其中，微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀過程(microbially induced calcium carbonate precipitation，MICP)作為一種主要的生物誘導(dǎo)礦化作用，在海水和沉積物、淡水和土壤的各種環(huán)境中十分常見[11]。由于MICP 在自然過程中的廣泛存在和應(yīng)用潛力，近年來受到了廣泛的關(guān)注。天然環(huán)境中尿素分解、氨基酸氨化、反硝化、異化硫酸鹽菌的還原作用、光合作用、甲烷氧化等是主要的微生物代謝誘導(dǎo)礦化（MICP）作用。

1.1 反硝化作用

微生物通過反硝化過程產(chǎn)生碳酸鈣的反應(yīng)方程式如下：

在微生物反硝化作用過程中，有機(jī)物利用硝酸根作為最終的電子受體發(fā)生氧化反應(yīng)是MICP 發(fā)生的主要原因：硝酸根與氫離子反應(yīng)消耗了環(huán)境中的氫離子，生成了碳酸根，增加了液相中CaCO3的飽和指數(shù)(SI)，創(chuàng)造了有利于生物誘導(dǎo)CaCO3沉淀的環(huán)境條件，此時，環(huán)境中存在的Ca2+將會在堿性條件下與C相結(jié)合，生成碳酸鈣礦物[11]。

反硝化菌施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）的模擬反應(yīng)表明，反硝化細(xì)菌礦化生成碳酸鈣的過程分為兩個階段，即NO3-還原生成NO2-，以及NO2-進(jìn)一步還原生成N2(NO3-→NO2-→N2)[12]

在第一階段中，硝酸根被還原成亞硝酸根的同時生成了碳酸氫根（Eq.2），生成的亞硝酸根在第二反應(yīng)階段再與氫離子反應(yīng)生成氮?dú)獠⑶疑筛嗟奶妓釟涓‥q. 3）。過程中第二反應(yīng)階段中消耗了H+，提高了環(huán)境中的pH，更有利于碳酸鈣的形成，因此沉淀大多發(fā)生在第二階段，概念模型如圖1。

1.2 硫酸鹽還原

在富含有機(jī)物、鈣和硫酸鹽的厭氧環(huán)境中，硫酸鹽還原菌(SRB)通過異化硫酸鹽還原過程，可以誘導(dǎo)生成次生碳酸鈣礦物圖2。該反應(yīng)過程通常從石膏的溶解開始(CaSO4·2H2O/CaSO4)，釋放大量游離態(tài)的Ca2+（Eq. 4），環(huán)境中存在的SRB 消耗有機(jī)物，反應(yīng)生成硫化物和二氧化碳，使環(huán)境中pH 升高，進(jìn)而影響溶液飽和指數(shù)（SI，Eq. 5)。SRB 表面可以作為碳酸鹽的成核位點(diǎn)，兩個階段的反應(yīng)產(chǎn)物鈣離子和碳酸根離子在細(xì)菌表面結(jié)合生成了碳酸鈣(Eq. 6)[13-14]。概念模型如下：

此外，脫硫弧菌（Desulfovibrio）還可以通過溶解-沉淀和擴(kuò)散等過程形成碳酸鈣。細(xì)菌還原硫酸鹽時，石膏（CaSO4）釋放出的鈣離子與重碳酸根發(fā)生反應(yīng)，生成方解石沉淀（Eq. 7）[15]。

1.3 光合作用

光合作用是在水環(huán)境中生物誘導(dǎo)礦化生成碳酸鈣主要機(jī)理。在有氧環(huán)境中，藍(lán)藻和微藻是水環(huán)境中主要的光合微生物，這些光合微生物利用水環(huán)境中的CO2（Eq. 8）合成自身所需的營養(yǎng)物質(zhì)。光合微生物產(chǎn)生碳酸鈣沉淀主要機(jī)理是HCO3-和CO32-的平衡交換（Eq. 9），光合作用消耗CO2，促使HCO3-分解生成更多的CO32-（Eq. 9）。同時HCO3-也可以通過細(xì)胞膜擴(kuò)散，并經(jīng)細(xì)胞質(zhì)中碳酸酐酶(CA)催化分解成CO2以及OH-，生成的OH-通過細(xì)胞膜泵出細(xì)胞，導(dǎo)致pH 升高。較高的pH 進(jìn)一步促進(jìn)碳酸平衡向CO32-濃度增加的方向轉(zhuǎn)移，有利于CO32-與水環(huán)境中Ca2+結(jié)合生成碳酸鈣 (Eq. 11) (Eq. 12)[6,16-17]。

根據(jù)上述反應(yīng)過程構(gòu)建概念模型（圖3）[17]。由于水環(huán)境中呈現(xiàn)堿性，光合作用吸收碳發(fā)生在生物體的同一側(cè)，光合速率、水生化學(xué)和生物周圍邊界層內(nèi)的擴(kuò)散作用決定了CaCO3過飽和水平和鈣化速率。

在無氧條件下，反應(yīng)的電子受體為硫化氫時，反應(yīng)過程中不產(chǎn)生氧氣，而是生成了單質(zhì)硫（Eq. 13），反應(yīng)過程中消耗CO2，從而影響了碳酸根與碳酸氫根的平衡（Eq. 9），促進(jìn)碳酸鹽的沉淀（Eq. 11）。

1.4 甲烷氧化

在海洋和淡水沉積物中，無論是氧化環(huán)境還是還原環(huán)境，甲烷氧化菌都可以通過自身代謝過程誘導(dǎo)生成碳酸鹽礦物。

在好氧環(huán)境下，氧氣和甲烷在細(xì)胞膜上將甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇（Eq. 14），產(chǎn)生的甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛（Eq.15），并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲酸（Eq. 16），溶解的甲酸處于平衡狀態(tài)（Eq. 17），甲烷氧化菌再利用甲酸脫氫酶將甲酸氧化為CO2（Eq18），在堿性條件下，CO2轉(zhuǎn)化為CO32-并與環(huán)境中的Ca2+結(jié)合形成碳酸鹽沉淀（Eq. 19）[18-20]。

在厭氧的環(huán)境下，產(chǎn)甲烷菌將二氧化碳和氫氣轉(zhuǎn)化為甲烷，產(chǎn)生的甲烷以硫酸根離子為電子受體氧化產(chǎn)生碳酸根離子，生成HS-以及HCO3-（Eq. 20）。生成的碳酸氫根與水環(huán)境中的Ca2+結(jié)合生成碳酸鈣沉淀及CO2（Eq. 21)，其概念模型如圖4[21]。

1.5 尿素分解

相比于其它MICP 機(jī)理，尿素分解菌具有在短時間內(nèi)產(chǎn)生高濃度碳酸鈣的優(yōu)勢。在該過程中，1 mol尿素在尿素分解菌作用下水解成1 mol 氨基甲酸和1 mol 氨（Eq. 22），氨基甲酸可以自發(fā)分解產(chǎn)生氨和碳酸（Eq.23）。反應(yīng)中生成的氨發(fā)生水解，生成OH-，使水環(huán)境pH 升高，促使碳酸的水解平衡不斷的向生成碳酸根的方向移動（Eq. 24），產(chǎn)生大量的碳酸根離子，與環(huán)境中存在的鈣離子反應(yīng)，在過飽和狀態(tài)下形成碳酸鈣沉淀（Eq.28）[22]。此外，細(xì)菌表面存在的負(fù)離子有利于鈣離子的吸附，因此細(xì)胞表面以及其胞外聚合物可以作為碳酸鈣的沉淀位點(diǎn)（Eq. 29）[11,23-24]。尿素分解菌誘導(dǎo)生成碳酸鈣沉淀示意如圖5。

2 尿素分解菌誘導(dǎo)碳酸鹽沉淀的影響因素

如前所述，微生物可以通過多種途徑生成碳酸鈣。其中，尿素分解菌具有不依賴額外營養(yǎng)物質(zhì)快速生成CO32-的特點(diǎn)，得到了廣大科技工作者的廣泛關(guān)注。利用尿素分解菌修復(fù)環(huán)境已成為了當(dāng)前微生物地質(zhì)環(huán)境領(lǐng)域廣為應(yīng)用的技術(shù)之一，微生物礦化作用受到鈣源、溫度、pH 條件、離子濃度等多種關(guān)鍵因素的影響[22]。

2.1 鈣 源

微生物誘導(dǎo)沉淀的首要問題是生化沉積過程。由于這個過程涉及到將可溶性鈣源轉(zhuǎn)化為不溶性碳酸鈣，因此鈣源的類型至關(guān)重要。 鈣源不同，生物誘導(dǎo)碳酸鹽沉淀的形態(tài)，晶體尺寸、形貌以及沉積速率等方面都會有所不同。Xu 等人[25]研究了兩種不同類型的鈣源-乳酸鈣和硝酸鈣對尿素溶菌礦化沉淀的影響，利用X 射線衍射分析證實(shí)沉積的CaCO3都為方解石，但通過動力學(xué)研究表明，在沉積速率方面，有微生物參與的乳酸鈣的沉淀速率是硝酸鈣的兩倍以上。并且當(dāng)鈣源不同時，CaCO3晶體尺寸和形貌有所不同，硝酸鈣沉積物為球形、層狀顆粒，粒徑小于50 μm，乳酸鈣沉積物多為不規(guī)則致密的塊狀或菱形晶體，粒徑較大，晶體表面印跡長2～4 μm，寬0.7 μm。Achal 等[26]做了類似的研究，他們分析了四種不同的碳源(氯化鈣、氧化鈣、醋酸鈣和硝酸鈣）對MICP 過程中的影響，結(jié)果表明，當(dāng)用氯化鈣作為碳源時，礦物主要晶型為方解石，但同時含有少量文石和球霰石晶體。Amiri 等[27]認(rèn)為以硝酸鈣為鈣源時，生成的礦物晶型主要為文石而不是方解石，而以氯化鈣為鈣源時，則生成的主要以方解石為主。

2.2 環(huán)境溫度

溫度是影響尿素分解菌誘導(dǎo)生物碳酸鹽沉淀的關(guān)鍵因素[28-30]。尿素分解菌生成沉淀過程的最佳溫度主要取決于細(xì)菌生長和代謝的適宜溫度，通常都在20～40 ℃之間[31-34]。Armstrong 等[28]從巖石洞穴中分離出四株尿素分解菌（Sporosarcina pasteurii WJ-4、Sporosarcina pasteurii fwzy14、Sporosarcina pasteurii WJ-5、Sporosarcina pasteurii fwzy14），發(fā)現(xiàn)在25 ℃到30 ℃范圍內(nèi)時，脲酶活性最大。這一溫度范圍在自然環(huán)境中是很常見的，這也意味著優(yōu)化的MICP 工藝可以在自然環(huán)境中實(shí)現(xiàn)工程應(yīng)用。

2.3 pH 條件

微生物生長環(huán)境的pH 不僅在誘導(dǎo)微生物形態(tài)變化、激發(fā)其分泌酶、影響其穩(wěn)定性等方面起著重要作用，而且也影響著碳酸鈣的沉淀過程。pH 通過影響HCO3-、CO32-、NH4+等離子濃度從而改變沉淀速度，而沉淀速度直接決定了礦物晶體的大小，沉淀速度越快晶體越小[28]。雖然不同種類細(xì)菌的最佳活性所需的pH 各不相同，但尿素分解菌誘導(dǎo)碳酸鹽沉淀的最佳pH 范圍在中性到弱堿性之間，因此這也是生成碳酸鹽所需的pH 條件[32-33]。

2.4 離子濃度

在非生物環(huán)境碳酸鈣生長過程中，陽離子的存在可以改變碳酸鈣的晶型、晶貌、晶體大小以及沉淀量[35-37]。在生物成礦過程中亦存在類似的現(xiàn)象，如尿素分解誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀的過程中，低濃度的鎂離子顯著促進(jìn)了文石的形成，提高了碳酸鈣沉積率，且晶粒的平均直徑更大[38]。高濃度的Cr6+同樣促進(jìn)了文石以及球霰石的生長，抑制方解石的生成[34]。除了Mg2+、Cr6+之外，Andrew 等[39]發(fā)現(xiàn)Sr 離子通過對晶體生長位點(diǎn)的影響延緩了方解石的沉淀速率，進(jìn)而影響碳酸鈣晶體的大小。此外，Ni2+濃度顯著影響著尿素分解菌誘導(dǎo)生成碳酸鈣行為[40]，研究發(fā)現(xiàn)，在加入 Ni2+后生物成因碳酸鈣的沉淀量急劇增加，溶液中Ni2+濃度為100 umol·L-1時，沉淀量最高。隨著Ni2+濃度升高至 500 umol·L-1時，碳酸鈣沉淀量反而大幅降低，當(dāng)Ni2+濃度達(dá)到 1 mmol·L-1時，則沒有碳酸鈣沉淀生成。

3 MICP 的環(huán)境應(yīng)用及作用機(jī)制

尿素分解菌通過分解尿素來誘導(dǎo)生成碳酸鹽，具有過程簡單、容易控制、短時間內(nèi)就能產(chǎn)生大量碳酸鹽類沉淀等特點(diǎn)，在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。與傳統(tǒng)的處理方法相比，該過程降低了能源和材料消耗，副產(chǎn)物減少，提高了經(jīng)濟(jì)效益，更具環(huán)保性的特點(diǎn)[1,41]。在微生物誘導(dǎo)礦化沉淀的過程中，環(huán)境中的重金屬元素或直接與CO32-反應(yīng)形成碳酸鹽沉淀，或通過替換CO32-達(dá)到固定的效果。已有研究表明，在天然環(huán)境中，較高濃度的HCO3-會通過競爭性吸附影響沉積物中重金屬濃度[42]。目前，根據(jù)重金屬被固定的過程以及形成的產(chǎn)物，可以將重金屬的固定過程分為兩大類：共沉淀作用和置換作用[34,43]。

3.1 共沉淀作用

替換Ca2+等陽離子型礦化示意圖如圖6，尿素分解菌在脲酶的參與下分解尿素生成CO32-、OH-，創(chuàng)造了有利于碳酸鹽沉淀的環(huán)境和條件。細(xì)菌細(xì)胞通過其表面的負(fù)電荷吸附重金屬陽離子M。尿素分解產(chǎn)生的CO32-在微生物表面與被吸附的陽離子反應(yīng)生成礦物沉淀（MxCa1-x）CO3而被固定。

目前，該類型的重金屬元素主要包括Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 等（表1）。從表1 中數(shù)據(jù)可知，各重金屬的最高固定率分別可達(dá)97.15%、99%、98.80%、94.83%以及97%，同時，MICP 過程所用微生物以芽孢桿菌屬居多，該類細(xì)菌水解尿素速率相比于其它細(xì)菌效率更高。利用芽孢八疊球菌類細(xì)菌對Cd 元素以及Zn 元素的固定率分別達(dá)到了97.15%以及94.83%。Zhu 等[47]利用蠟樣芽孢桿菌NS4 固定某蓄電池廠工業(yè)土壤中的Ni2+，利用MICP 過程使土壤中總鎳含量由900 mg·kg-1降至38 mg·kg-1。同時，Li 等[48]利用分離出蠟樣芽孢桿菌對水體中的Ni 元素進(jìn)行固定實(shí)驗，固定效率都在88%～99%之間，證明蠟樣芽孢桿菌對土壤以及水體中的Ni 元素都具有較好的固定效果。

表1 尿素分解菌MICP 固定陽離子型重金屬表Table 1 Cationic heavy metals fixed by urea decomposing bacteria MICP

續(xù)表1

與單菌株培養(yǎng)相比，混合菌體表現(xiàn)出更高的生長速率、脲酶活性和對重金屬的抗性，同時也具有相當(dāng)高的重金屬生物修復(fù)能力。如Kang 等[50]利用綠芽胞桿菌、沙棘綠桿菌、陰溝腸桿菌混合菌種進(jìn)行Cd 元素的固定試驗，固定率達(dá)到了85%，這可能是在高重金屬水平下，細(xì)菌細(xì)胞密度較高所導(dǎo)致的。

除細(xì)菌外，具有尿素分解能力的真菌同樣可以通過MICP 過程來固定重金屬元素。Qian 等[52]從污泥中分離得到的真菌青霉菌（Chrysogenum CS1）對Pb 的固定率達(dá)到了98.8%。Dhami 等[53]從洞穴中分離出的真菌Fusarium sp. UF8.以及Aspergillus sp.UF3，對Pb 的固定率分別為48%以及34%。

3.2 置換作用

水環(huán)境中的部分重金屬元素可以形成絡(luò)合陰離子，如亞砷酸根等，會以類質(zhì)同像置換方式取代CaCO3中的CO32-，使得重金屬離子摻入礦物結(jié)構(gòu)而被固定（圖7）。

目前，通過該機(jī)制固定的重金屬元素主要為As、Cr 等（表2）。Yamamura 等[62]利用芽孢桿菌探究了As5+以及As3+的相互轉(zhuǎn)化機(jī)制，認(rèn)為尿素分解菌可用于砷污染土壤的生物修復(fù)。Tripti 等[57]從高砷地區(qū)分離出耐砷細(xì)菌地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis DAS-2，探究了不同價態(tài)砷和初始濃度下砷的生物礦化效率。Cr 元素與As 元素類似，在環(huán)境中通常以六價以及三價的形態(tài)存在，Qian 等[52]利用從污泥中分離的產(chǎn)黃青霉菌來固定土壤中的六價鉻，固定率最高可達(dá)到95.30%。同步輻射檢測表明，CrO42-主要是通過置換作用占據(jù)了方解石中的CO32-位置。

表2 MICP 固定陰離子型重金屬表Table 2 Table of anionic heavy metals fixed by MICP

4 總 結(jié)

利用生物礦物修復(fù)土壤或水體重金屬污染的生物礦化機(jī)理包括：生物控制礦化、生物介導(dǎo)礦化、生物誘導(dǎo)礦化。而微生物誘導(dǎo)礦化過程的成因機(jī)制包括細(xì)菌反硝化、硫酸鹽還原、尿素分解等。利用尿素分解誘導(dǎo)礦物沉淀具有能夠快速生成CO32-，并且只依賴于一種酶-脲酶，不需要額外的營養(yǎng)素用來長期維持細(xì)菌活性的特點(diǎn)而受到科研人員的廣泛關(guān)注。

微生物分解尿素誘導(dǎo)礦物沉淀過程很大程度上受到環(huán)境因素的影響，如pH、溫度、離子濃度等，已有大量研究表明通過控制（或改變）環(huán)境因素會對微生物的生長、固體沉淀速率、礦物類型等多方面產(chǎn)生影響。

在固定重金屬方面，主要通過共沉淀或置換作用達(dá)到固定重金屬的目的。利用MICP 過程修復(fù)環(huán)境重金屬對比傳統(tǒng)的修復(fù)方法具有明顯的優(yōu)勢，并且對環(huán)境中常見的重金屬污染元素，如砷、鎘、銅等，都有較好的固定轉(zhuǎn)化率，因此利用MICP 過程處理水體或土壤中的重金屬已經(jīng)成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。但微生物的生長代謝受環(huán)境條件限制，因此在應(yīng)用方面，對環(huán)境條件要求較為嚴(yán)苛，所以在今后的研究里，應(yīng)更多的關(guān)注環(huán)境條件對于微生物生長代謝以及對環(huán)境中重金屬的轉(zhuǎn)化率的影響，以便實(shí)現(xiàn)MICP 修復(fù)環(huán)境更廣泛的應(yīng)用。