產(chǎn)油單針藻的最適培養(yǎng)基篩選及產(chǎn)油特性提升

馬思琦，李 暢，樊 陽，孫 瑩，尹紫良，林宜萌，葛菁萍

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

隨著世界經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和世界人口的不斷膨脹，人們對(duì)能源的需求量日益增加，有研究預(yù)計(jì)人類對(duì)能源的需求到2030年將會(huì)增加50%[1]。目前全球能源主要由化石能源如煤、石油、天然氣等供應(yīng)，化石能源屬于不可再生能源，其儲(chǔ)存量有限，無法滿足人類對(duì)能源的長期使用需求。為緩解人類社會(huì)面臨的能源危機(jī)，人們需要尋找清潔的可再生能源來代替化石能源的使用，生物柴油是一個(gè)可選擇的替代方案。生物柴油即來源于生物體的燃料，其使用能夠減少二氧化碳及碳?xì)浠衔锏呐欧?，有利于減緩溫室效應(yīng)，但目前的生物柴油原料主要基于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的食品及資源，如大豆油、玉米油等，這類生物柴油的生產(chǎn)需要占用大量耕地資源，產(chǎn)出效率低[2]。近年來，微藻作為第三代生物柴油的潛在生產(chǎn)者表現(xiàn)出諸多優(yōu)勢。微藻在代謝過程中能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為三酰基甘油酯，用于生物柴油的生產(chǎn)[3-4]。微藻光合效率高，生長周期短，不與農(nóng)作物爭地。除了生產(chǎn)生物柴油外，微藻還能生產(chǎn)多不飽和脂肪酸、色素、抗氧化劑等高價(jià)值副產(chǎn)物[5-9]。

利用微藻生產(chǎn)生物柴油尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，主要障礙在于微藻生物柴油的生產(chǎn)成本較高。為了降低微藻產(chǎn)油成本，需要在開發(fā)新藻種、提高藻株產(chǎn)油潛能、采用新的培養(yǎng)技術(shù)、減少采收過程中的能源消耗等各環(huán)節(jié)加大研究力度[10]。在上述環(huán)節(jié)中，對(duì)藻株培養(yǎng)條件的探索與優(yōu)化是分離新藻株后的必要流程。不同藻株在分離生境上的差異往往導(dǎo)致了其生理代謝特征的特殊性，進(jìn)一步體現(xiàn)在藻株生長對(duì)培養(yǎng)基營養(yǎng)的獨(dú)特需求上。因此，選擇合適的培養(yǎng)基并對(duì)培養(yǎng)基中的重要成分做系統(tǒng)性優(yōu)化是提升藻株產(chǎn)油指標(biāo)的重要步驟，也是挖掘藻株產(chǎn)油潛能的最直接和有效的方法[11]。目前已有研究利用培養(yǎng)基篩選[12]及營養(yǎng)條件優(yōu)化[13]，顯著提升微藻藻株的生物量及油脂含量。

本研究以前期分離自黑龍江省大慶地區(qū)鹽堿湖泊的單針藻(Monoraphidium sp.)HDMA-11為供試藻株[14]，篩選其適合生長及產(chǎn)油的培養(yǎng)基，并對(duì)其培養(yǎng)條件做了進(jìn)一步的優(yōu)化，以期進(jìn)一步提升藻株的產(chǎn)油潛能，為進(jìn)一步應(yīng)用于生物柴油生產(chǎn)領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試藻株與培養(yǎng)基

1.1.1 供試藻株 供試藻株單針藻(Monoraphidium sp.)HDMA-11由黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[12,15-16]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 以培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長末期的藻液作為種子液，以10%(v/v)的接種量接種于新鮮的培養(yǎng)基中，裝液量200 mL/500 mL（三角瓶）。在光照搖床中，每天光照16 h、黑暗8 h培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000 lux，恒溫25℃。每天以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)液3次，每次10 min，培養(yǎng)周期為6～22天。

1.2.2 藻株生長曲線的測定 利用光學(xué)顯微鏡及血球計(jì)數(shù)板來計(jì)算微藻細(xì)胞個(gè)體數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的藻細(xì)胞密度為縱軸，繪制藻株生長曲線，用于藻株生長狀況和生長速度的比較。

1.2.3 藻株生物量的測定 取穩(wěn)定期的微藻培養(yǎng)液70 mL于已稱重的100 mL的離心管中(W1)，以轉(zhuǎn)速3800 r/min離心20 min，倒去上清液，再以ddH2O洗滌2次后，分別離心并倒去上清液，將離心得到的微藻藻泥放在50℃的烘箱中烘干至恒重(W2)。藻細(xì)胞的生物量(DCW)的計(jì)算見公式(1)。

1.2.4 藻株油脂含量的測定 微藻油脂的含量利用尼羅紅染色熒光光譜法測定，參照方法Greenspan等[17]的方法，在培養(yǎng)周期相應(yīng)時(shí)間(T)取藻液，調(diào)整藻液OD680值為0.8。取調(diào)整OD值后藻液4 mL，加入1 mL DSMO，使用50 μL 100 μg/mL的尼羅紅溶液對(duì)藻液染色5 min，使用熒光光度計(jì)測定相對(duì)熒光強(qiáng)度(Relative Fluorescence Units,RFU)，激發(fā)波波長為480 nm，檢測波波長為570 nm。油脂生產(chǎn)率的計(jì)算見公式(2)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件（20.0版本）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基種類對(duì)HDMA-11生長速度的影響

使用培養(yǎng)微藻常用的培養(yǎng)基（BBM培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基、D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基）對(duì)HDMA-11進(jìn)行培養(yǎng)，以HDMA-11使用BG-11培養(yǎng)基的生長為參照，篩選適合HDMA-11生長的培養(yǎng)基。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，藻液的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制藻株的生長曲線（圖1）。HDMA-11在這幾種培養(yǎng)基中均可生長，未觀察到明顯的生長延滯期，但生長速度區(qū)別較大。在BBM培養(yǎng)基中，HDMA-11的生長情況與在BG-11培養(yǎng)基中類似，細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定增加，在培養(yǎng)末期細(xì)胞數(shù)達(dá)到8.0×107/mL，與在BG-11培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)(8.4×107/mL)相似。使用D1培養(yǎng)基、SE培養(yǎng)基時(shí)HDMA-11的生長較慢，培養(yǎng)末期細(xì)胞數(shù)僅為BG-11培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)的一半。在TAP培養(yǎng)基中HDMA-11的生長最快，培養(yǎng)第6天即可達(dá)到穩(wěn)定期，雖然HDMA-11在TAP培養(yǎng)基中生長至培養(yǎng)末期時(shí)，細(xì)胞數(shù)(6.5×107/mL)有所降低，略低于BG-11培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)，但考慮到HDMA-11在TAP中生長時(shí)在較短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到穩(wěn)定期，極大縮短了培養(yǎng)周期，生長效率最高。

圖1 Monoraphidium sp.HDMA-11在不同培養(yǎng)基中的生長曲線

2.2 培養(yǎng)基種類對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

對(duì)于產(chǎn)油藻株來說，藻細(xì)胞的生物量、含油量是藻株產(chǎn)油能力的基礎(chǔ)指標(biāo)。本研究檢測了HDMA-11在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后期的生物量和油脂含量，結(jié)果如圖2所示。在BG-11培養(yǎng)基中，HDMA-11可達(dá)到較高生物量，為(490±6)mg/L。在BBM培養(yǎng)基中，HDMA-11的生物量為(480±14)mg/L，與HDMA-11在BG-11培養(yǎng)基中的生物量相比差異不顯著。在TAP培養(yǎng)基中，HDMA-11的生物量有所降低，為(301±4)mg/L。在D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基中，藻細(xì)胞的生物量較低，僅為226～230 mg/L。與生物量的差異相比，HDMA-11的油脂含量在BG-11、BBM和TAP培養(yǎng)基中沒有顯著差異。而在D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基中，HDMA-11的油脂含量較低。綜合考慮HDMA-11在D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基中較慢的生長速度（圖1）和較低的生物量和油脂含量（圖2），D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基不適合該藻株的生長和產(chǎn)油。因?yàn)樵寮?xì)胞在不同培養(yǎng)基中達(dá)到穩(wěn)定期的培養(yǎng)天數(shù)不同，油脂生產(chǎn)率更能反應(yīng)藻細(xì)胞的產(chǎn)油能力。計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，雖然藻株在TAP培養(yǎng)基中生物量略有降低，但藻株在TAP培養(yǎng)基中生長速度快，同時(shí)油脂含量未下降，最終藻株在TAP培養(yǎng)基中的相對(duì)油脂生產(chǎn)率最高，達(dá)256 RFU/(L·d)，比在BG-11培養(yǎng)基中的相對(duì)油脂生產(chǎn)率增加117%。因此，選擇TAP培養(yǎng)基作為HDMA-11的培養(yǎng)基，進(jìn)行進(jìn)一步的生長優(yōu)化。

圖2 Monoraphidium sp.HDMA-11在不同培養(yǎng)基中的生物量、油脂含量

2.3 碳源種類對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

以TAP培養(yǎng)基為起始培養(yǎng)基，選擇微藻培養(yǎng)常用的8種碳源（果糖、甘露醇、麥芽糖、乙酸、甘油、乙酸鈉、葡萄糖和蔗糖），以培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)HDMA-11的生物量和油脂含量為檢測指標(biāo)，檢測HDMA-11可利用的碳源種類（圖3）。HDMA-11幾乎不能利用甘油生長，對(duì)甘露醇、乙酸鈉和葡萄糖的利用效率也很低，只能達(dá)到79～130 mg/L的生物量。果糖或蔗糖作為碳源時(shí)，HDMA-11的生物量略有增加，達(dá)到222～230 mg/L。藻細(xì)胞利用麥芽糖生長時(shí)，生物量進(jìn)一步增加至為294 mg/L。在檢測的八種碳源中，乙酸為HDMA-11最適生長碳源，在培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，HDMA-11的生物量為(351±19)mg/L（圖3A）。進(jìn)一步檢測HDMA-11利用各碳源生長至穩(wěn)定期的油脂含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以甘露醇、甘油、乙酸鈉、葡萄糖或蔗糖為碳源時(shí)，藻細(xì)胞積累油脂的能力也受到了影響。果糖或乙酸作為碳源時(shí)，HDMA-11的油脂含量較高?？紤]到乙酸作為碳源時(shí)更有利于HDMA-11生物量的積累，并綜合考慮碳源成本和藻株生長狀態(tài)，之后的實(shí)驗(yàn)均以乙酸作為HDMA-11培養(yǎng)的添加碳源。

圖3 碳源種類對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

2.4 氮源種類對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

分別用硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、酵母提取物和尿素作為氮源，考察HDMA-11利用不同氮源的生長情況。以培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)HDMA-11的生物量和油脂含量為檢測指標(biāo)，檢測HDMA-11可利用的碳源種類。由圖4A可知，6種氮源均可被HDMA-11利用，使用不同氮源所獲得的最終生物量數(shù)值差異不顯著。使用硝酸銨、硝酸鈉和氯化銨作為氮源時(shí)HDMA-11的油脂相對(duì)含量高于使用蛋白胨、酵母提取物和尿素作為氮源時(shí)的水平（圖4B）。從生長情況來看，使用氯化銨作為氮源時(shí)藻細(xì)胞生長的狀態(tài)最好，藻液較綠，最終OD680達(dá)到了2.8（圖5），因此之后的實(shí)驗(yàn)中選擇氯化銨作為氮源。

圖4 氮源種類對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

圖5 氮源種類對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生長中OD680的影響

2.5 乙酸添加量對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

為了進(jìn)一步優(yōu)化HDMA-11的產(chǎn)油特性，檢測了乙酸添加量對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響。設(shè)置了0、1、2、4、8 mL/L共5個(gè)乙酸添加量，為了避免乙酸對(duì)培養(yǎng)體系pH的影響，在加入乙酸后，將培養(yǎng)基初始pH統(tǒng)一調(diào)整為7.0。如圖6A所示，當(dāng)乙酸含量為0～2 mL/L，藻細(xì)胞的生物量隨著乙酸增加而增加，最高生物量為(406±10)mg/L。但隨著乙酸濃度進(jìn)一步增加，藻細(xì)胞生長受到抑制，以8 mL/L乙酸對(duì)藻細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。高濃度的乙酸極大影響藻細(xì)胞生物量的積累，在8 mL/L乙酸濃度下，HDMA-11的生物量僅為(126±6)mg/L。藻細(xì)胞的油脂積累特性也與乙酸濃度密切相關(guān)（圖6B），不添加乙酸的實(shí)驗(yàn)組，油脂積累受到的影響最大，僅為1.3 RFU。1 mL/L乙酸和2 mL/L乙酸最有利于藻細(xì)胞的油脂積累，而較高濃度的乙酸(4～8 mL/L)不利于藻細(xì)胞產(chǎn)油。當(dāng)乙酸濃度從1 mL/L升至2 mL/L，HDMA-11的生物量顯著增加，油脂含量下降不顯著，因此選擇2 mL/L為本研究添加乙酸的濃度。

圖6 乙酸濃度對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

2.6 氯化銨濃度對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

在優(yōu)化乙酸添加量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測不同的氯化銨濃度(125、375、750、1500、3000 mg/L)對(duì)藻株HDMA-11生長的影響。在培養(yǎng)期結(jié)束后檢測藻細(xì)胞的生物量和油脂含量，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)氯化銨濃度在從125 mg/L升至750 mg/L時(shí)，藻細(xì)胞的生物量由350 mg/L增加至419 mg/L，但當(dāng)氯化銨濃度進(jìn)一步增加，藻細(xì)胞的生長受到抑制，生物量顯著降低（圖7A）。相比之下，藻株的含油量在不同氯化銨濃度下差異不顯著。考慮到氯化銨對(duì)HDMA-11生物量的影響，將氯化銨濃度確定為750 mg/L。

圖7 氯化銨濃度對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

經(jīng)過了培養(yǎng)基的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，HDMA-11的產(chǎn)油指標(biāo)提升情況見表1。將培養(yǎng)基由BG-11替換為TAP后，藻株生物量有所降低，但因培養(yǎng)周期極大縮短，藻株的生物量生產(chǎn)率提升了127%，油脂生產(chǎn)率提升了117%。又進(jìn)一步對(duì)HDMA-11可利用的碳源種類、氮源種類進(jìn)行摸索，優(yōu)化了碳源添加量和氮源添加量，優(yōu)化后的HDMA-11生物量生產(chǎn)率提升了40%，較本研究初始培養(yǎng)條件提升218%，優(yōu)化后的HDMA-11油脂生產(chǎn)率提升23%，較本研究初始培養(yǎng)條件提升了116%。

表1 HDMA-11在優(yōu)化培養(yǎng)條件前后的生物量、生物量生產(chǎn)率、油脂含量和油脂生產(chǎn)率

3 討論

培養(yǎng)基是影響微藻類生長的重要因素。ZHAO等[12]研究了4種培養(yǎng)基對(duì)雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)LUGU生長的影響，發(fā)現(xiàn)LUGU在BBM培養(yǎng)基中生長可獲得較高生物量。對(duì)于單針藻M.sp.NTAI02來說，BG-11培養(yǎng)基并不適合它生長[18]，而卷曲纖維藻(Ankistrodesmus falcatus)在BG-11培養(yǎng)基中的生長速度遠(yuǎn)超另外3種培養(yǎng)基[19]。對(duì)于不同的微藻藻種或者藻株來說，由于生理特性及利用營養(yǎng)素的效率不同，最適培養(yǎng)基可能非常不同。為了提升藻株的生長速度、生物量積累水平和產(chǎn)油效率，有必要篩選合適的培養(yǎng)基。以往研究對(duì)于單針藻的生理特性及適用培養(yǎng)基研究較為有限，本研究選擇5種微藻常用的培養(yǎng)基，檢測HDMA-11對(duì)這幾種培養(yǎng)基的適用性（圖1）及HDMA-11產(chǎn)油指標(biāo)的變化（圖2）。從達(dá)到穩(wěn)定期的細(xì)胞數(shù)來看，使用BG-11和BBM培養(yǎng)基的結(jié)果較為類似，使用TAP培養(yǎng)基時(shí)藻株細(xì)胞數(shù)略低。但當(dāng)藻株在TAP培養(yǎng)基中生長時(shí)，藻株可以在極短時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定期，生長速度快，再結(jié)合生物量與油脂含量的指標(biāo)，確定藻株使用TAP培養(yǎng)基兼具生長速度和產(chǎn)油效率的優(yōu)勢。TAP培養(yǎng)基常用于衣藻屬(Chlamydomonas)藻株的培養(yǎng)，較少用于單針藻屬的培養(yǎng)[20]。本研究供試藻株分離自大慶地區(qū)鹽堿湖泊的特殊生境，它所適用培養(yǎng)基的特殊性也說明它在生理代謝上的特殊性。

碳源是微藻生長繁殖需要的重要物質(zhì)，篩選適合且成本較低的碳源對(duì)于進(jìn)一步降低微藻培養(yǎng)成本具有重要意義，對(duì)于新分離的藻株尤其如此。微藻常用碳源包括糖類、有機(jī)酸、醇類等。YEE[21]發(fā)現(xiàn)，Monoraphidium griffithii NS16可利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、乙酸鈉和甘露醇生長，其中0.05%的甘露醇和0.1%的果糖可使藻細(xì)胞生物量增加0.1～1倍。葡萄糖是微藻培養(yǎng)常用的碳源，但HDMA-11不能利用葡萄糖生長，向微藻培養(yǎng)體系中加入葡萄糖后，大部分藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，不能正常生長繁殖。推測該藻株在進(jìn)化過程中主要以自養(yǎng)方式生長，不能以葡萄糖代謝作為中心代謝途徑，且葡萄糖的存在對(duì)藻細(xì)胞生長有一定的毒性作用。蔗糖在酸性條件下可水解為葡萄糖和果糖，麥芽糖在酸性條件下可水解為葡萄糖，考慮到本研究所用培養(yǎng)基的初始pH值為7.0，且微藻在培養(yǎng)過程中pH逐漸增加，未能達(dá)到蔗糖和麥芽糖的水解條件，這可能是HDMA-11在蔗糖或麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長狀況優(yōu)于葡萄糖為碳源培養(yǎng)基的原因之一。在碳源利用特征上，HDMA-11能夠高效利用乙酸（圖3），在一定濃度范圍內(nèi)增加乙酸添加量可促進(jìn)藻株的生長，但當(dāng)乙酸添加量高于4 mL/L，藻株的生長受到較大抑制（圖6），且這種生長抑制與乙酸降低培養(yǎng)體系pH值并無關(guān)系。

本研究還篩選了HDMA-11可利用的氮源，發(fā)現(xiàn)該藻株可利用6種氮源，這其中包含了硝酸鹽和銨鹽（圖4）。基于現(xiàn)有大部分研究，硝酸鹽是單針藻屬常用的氮源。Wu等曾檢測Monoraphidium sp.SB2可利用的氮源種類，發(fā)現(xiàn)SB2利用硝酸鉀的效率最高，可獲得較高生物量[22]。而銨鹽若濃度過高，可能導(dǎo)致植物光合作用的破壞[23-26]，這可能是本研究中增加氯化銨濃度抑制HDMA-11生長的原因（圖7）。本研究僅對(duì)HDMA-11的碳源種類、氮源種類做了初步探索，對(duì)HDMA-11的乙酸添加量和氯化銨濃度做了初步優(yōu)化，后續(xù)工作將進(jìn)一步檢測環(huán)境條件如初始pH、培養(yǎng)溫度對(duì)藻株產(chǎn)油指標(biāo)的影響。另外，培養(yǎng)基中其他成分對(duì)藻株的影響也值得進(jìn)一步探究，以進(jìn)一步提升該藻株的產(chǎn)油能力。

4 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離的單針藻(Monoraphidium sp.)HDMA-11作為出發(fā)藻株，篩選其最適培養(yǎng)基并優(yōu)化了培養(yǎng)基成分。當(dāng)使用TAP培養(yǎng)基，乙酸添加量為2 mL/L，氯化銨濃度為750 mg/L時(shí)，藻株的產(chǎn)油性能最佳，生物量生產(chǎn)率和油脂生產(chǎn)率分別為70 mg/(L·d)和315 RFU/(L·d)。說明培養(yǎng)基類型及成分的優(yōu)化可提升藻株產(chǎn)油指標(biāo)，是改善藻株產(chǎn)油潛能的重要方法。