不同濃度褪黑素對甜菜種子的引發(fā)影響

楊 然，興 旺，劉大麗，吳則東，王茂芊

（黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜作為一種糖料作物，是最為重要的一種糖類的來源之一，目前已經(jīng)遍布在中國極大多數(shù)地區(qū)，尤其是在黑、吉、遼所在的東北地區(qū)，甜菜的種植規(guī)模十分巨大，占到全國甜菜總種植面積的65%以上，內(nèi)蒙古，新疆等地，也是甜菜種植的高產(chǎn)地區(qū)。雖然甜菜的種植規(guī)模龐大，但是甜菜對其生長過程的要求卻相對嚴苛，即使它具有優(yōu)異的耐寒性和喜溫作物，卻仍然存在著發(fā)芽速度慢，抗逆性差等缺點。因此，通過調(diào)節(jié)種子播種前吸水速度的快慢，為其種子萌發(fā)做好充足的各項生理準備后再緩慢回干的播前種子引發(fā)技術，就顯得尤為重要[1]。中國雖說是糧食生產(chǎn)大國，但是與國外的種子引發(fā)和加工技術相比，中國在甜菜種子引發(fā)技術上，起步較晚，發(fā)展也較緩慢。因此，要想迅速加強中國甜菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，就必須要加強甜菜種子的引發(fā)和加工技術的研發(fā)力度[2]。

之所以研究甜菜種子引發(fā)技術，是由于在甜菜種子經(jīng)過引發(fā)后，可以顯著提高種子的發(fā)芽率，并明顯改善了其抗逆性。這就可以起到節(jié)約甜菜種子，降低種子生產(chǎn)成本，提高種子綜合效益的作用[3]。

隨著農(nóng)業(yè)領域發(fā)展和時代的不斷更新進步，中國相關的農(nóng)業(yè)科研工作者緊跟時事，越來越重視甜菜種子引發(fā)劑的研究。王宇光等[4]利用不同的鈉離子濃度，在鹽脅迫的條件下，對甜菜幼苗前期的生理特性進行了分析。白占兵等[5]研究種子引發(fā)劑對辣椒種子發(fā)芽的影響。宋子葉等[6]研究水、50 μmol/L氯化鈉、0.05 μmol/L水楊酸和20%聚乙二醇4種完全不同的引發(fā)劑對小麥種子發(fā)芽的影響程度，結果顯示，這4種引發(fā)劑均能明顯地促進重度老化種子發(fā)芽。狄文偉等[7]對茄子種子進行引發(fā)效果的研究，結果表明：使用引發(fā)種子不但能夠增強茄子種子的抗逆性，還能夠減少茄子種子的發(fā)芽時間[8]。種子引發(fā)處理主要由以下幾個因素所決定，即引發(fā)劑的種類選擇、引發(fā)時所控制的溫度、引發(fā)時間的長短等[9]。張麗等[10]用雜交玉米‘農(nóng)大108’種子研究了不同濃度的PEG引發(fā)對玉米種子萌發(fā)及活力的影響。吳凌云等[11]研究了種子引發(fā)結合殺菌劑包衣處理對西瓜種子萌發(fā)和幼苗素質(zhì)的影響。

經(jīng)過國內(nèi)外各種研究人員的探索和發(fā)現(xiàn)，種子引發(fā)的種類根據(jù)基質(zhì)的不同，其方法也不止一種。具體方法包括滾筒引發(fā)、基質(zhì)引發(fā)和膜引發(fā)。國內(nèi)外的科研工作者對于種子引發(fā)的實驗探索也越來越為深入和成熟，比如TARIQ等[12]就以赤霉素為例，探討了它在低溫脅迫的條件下，對鷹嘴豆幼苗的保護效果。LIU等[13]研究發(fā)現(xiàn)過氧化氫影響種子吸脹過程中ABA分解代謝和GA生物合成的調(diào)控，從而對種子休眠和萌發(fā)產(chǎn)生調(diào)控作用；較為普遍應用于部分蔬菜和花卉種子播種前的處理當中，在其他多種經(jīng)濟作物育種研究中也較為常見[14-15]。種子引發(fā)重新模擬了部分種子發(fā)育過程，在隨后理想的回干過程中，完成種子活力的恢復或提升[16]。在引發(fā)過程中，同一物種或品種的引發(fā)效果可能會因為不同引發(fā)方法造成差異，甚至會因為引發(fā)方法的不同而得到截然不同的引發(fā)效果[17]。

迄今為止，國內(nèi)外對于利用不同引發(fā)劑引發(fā)甜菜種子的研究數(shù)量少之又少，因此，本次研究實驗配制了不同濃度的褪黑素溶液，褪黑素浸泡的時間分別為8、12、24 h。本實驗旨在探討在不同處理時期，不同濃度的褪黑素對甜菜種子發(fā)芽的作用，通過對發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的調(diào)查研究不同種子是否對同一引發(fā)劑有不同表現(xiàn)，從而也為選擇優(yōu)良的甜菜種子包衣劑提供有效的參考。

在甜菜種子的實際生產(chǎn)中，使用具有明顯的引發(fā)作用的引發(fā)劑，為今后的甜菜種子引發(fā)劑的選用研究打下了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2021年09月—2021年12月在黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院甜菜遺傳育種重點實驗室進行。

1.2 試驗材料

供試材料選用甜菜單粒種STm1619，由新疆石河子農(nóng)業(yè)科學院甜菜所提供。

1.3 試驗方法

本研究選用的引發(fā)劑為褪黑素（表1），共設置了9個處理，在23℃條件下，褪黑素的濃度分別設置為50、100、200 μmol/L，處理的時間分別為8、12、24 h；其中在不同的處理時間之下，9組處理試驗的對照均為沒有經(jīng)過任何處理的原STm1619干種子。

表1 不同濃度的褪黑素的9個處理

本研究的引發(fā)處理試驗在黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院的甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心進行。本實驗的試驗方法總結如下：（1）將實驗室內(nèi)準備好的純凈蒸餾水與0.1%濃度的次氯酸鈉溶液一同倒入消毒滅菌后的桶中充分攪拌均勻，再將適當數(shù)量的發(fā)芽盒放入桶中進行清洗消毒、晾干，同時將消過毒保證無菌的50格發(fā)芽紙平坦鋪在處理過后的發(fā)芽盒里，每個紙格放2粒種子，擺放均勻后使用注射器將34 mL的蒸餾水均勻噴進發(fā)芽盒里，且要求保證發(fā)芽盒里每個STm1619甜菜種子都濕潤。每個處理進行3次重復，溫箱培養(yǎng)溫度設置為23℃，濕度為70%，光照時間為12 h。每天檢測發(fā)芽種子數(shù)，調(diào)查統(tǒng)計出盒內(nèi)處理過的STm1619甜菜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率，通過測量甜菜發(fā)芽種子的胚根及肧軸的總長度，可以充分得到各處理的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)數(shù)值。

1.4 測定指標

通過公式測定引發(fā)劑處理后的甜菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[式(1)～(4)]。利用Excel軟件數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 50 μmol/L褪黑素不同時間處理STm1619甜菜種子的結果

結果（表2）顯示，褪黑素溶液濃度為50 μmol/L，STm1619甜菜種子的處理時間分別為8、12、24 h，種子經(jīng)過處理后，其發(fā)芽勢分別為47.67%、59.33%和44.67%，均高于對照(17.00%)，分別高出了30.67%、42.33%和27.67%。發(fā)芽率分別為47.67%、60.33%和48.67%，均高于對照(19.00%)，分別高出了28.67%、41.33%和29.67%。由種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)結果可見，50 μmol/L濃度的褪黑素溶液在不同的3個時間下，其種子處理的發(fā)芽指數(shù)分別為18.32、25.47和21.57，均高于對照(7.07)，分別高出 11.25、18.40 和14.50。種子的活力指數(shù)分別為159.51、189.38和142.57，均高于對照(52.79)，分別高出106.72、136.59和89.78。試驗結果顯示，在50 μmol/L濃度的褪黑素條件下，3個時期的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標都比對照組顯著增高，顯而易見，50 μmol/L濃度的褪黑素在8、12、24 h三個不同時間下處理STm1619甜菜種子時的引發(fā)作用效果顯著。

表2 50 μmol/L濃度褪黑素處理STm1619甜菜種子萌發(fā)調(diào)查表

2.2 100 μmol/L褪黑素不同時間處理STm1619甜菜種子的結果

結果（表3）顯示，褪黑素溶液濃度為100 μmol/L，STm1619甜菜種子的處理時間分別為8、12、24 h，種子處理后的發(fā)芽勢分別為50.67%、54.33%和55.00%，均高于對照(41.00%)，分別高出了9.67%、13.33%和14.00%。發(fā)芽率分別為47.67%、57.33%、和56.00%，均高于對照(41.00%)，分別高出了6.67%、44.33%和15.00%。由發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)結果可見，100 μmol/L濃度的褪黑素在不同的3個時間下，處理的發(fā)芽指數(shù)分別為19.25、22.54和24.52，均高于對照(13.17)，分別高出6.08、9.37和11.35?；盍χ笖?shù)分別為142.14、178.78和154.72，均高于對照(114.02)，分別高出了28.12、64.76和40.70。綜合結果可知，在100 μmol/L濃度的褪黑素條件之下，3個時期的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都要略高于對照。綜上所述，100 μmol/L濃度的褪黑素溶液在8、12、24 h三個不同時間下，處理STm1619甜菜種子時的引發(fā)效果都有一定的促進作用。

表3 100 μmol/L濃度褪黑素處理STm1619甜菜種子萌發(fā)調(diào)查表

2.3 200 μmol/L褪黑素不同時間處理STm1619甜菜種子的結果

結果（表4）顯示，褪黑素溶液濃度為200 μmol/L，STm1619甜菜種子的處理時間分別為8、12、24 h，種子處理后的發(fā)芽勢分別為42.00%、56.33%和53.00%，都要高于對照(25.00%)，分別高出了17.00%、31.33%和28.00%。發(fā)芽率分別為42.67%、56.67%和54.00%，均高于對照(26.00%)，分別高出了16.67%、30.67%和28.00%。從種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)數(shù)值的兩方面分析可以看出來，在200 μmol/L濃度的褪黑素溶液處理中，3個時期的發(fā)芽指數(shù)分別為17.40、20.57和23.17，其數(shù)值均大于CK(8.26)，分別大了9.14、12.31和14.91?；盍χ笖?shù)分別為110.08、121.77和136.51，均高于對照(74.67)，分別高出35.41、47.10和61.84。結果顯示，200 μmol/L濃度的褪黑素在不同的3個時期處理甜菜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)對于對照種子略有提高。從結果分析亦可看出，200 μmol/L濃度的褪黑素在8、12、24 h三個不同時間下處理STm1619甜菜種子時的引發(fā)效果都有顯著的促進作用。

表4 200 μmol/L濃度褪黑素處理STm1619甜菜種子萌發(fā)調(diào)查表

2.4 不同濃度褪黑素不同時間處理比對

通過9個處理后的STm1619甜菜種子發(fā)芽勢比較結果看出（圖1），9個處理試驗的發(fā)芽勢數(shù)值相對于對照而言都高，以處理2的發(fā)芽勢最高，高達59.33%。除CK組以外，發(fā)芽勢最低的一組是處理7。由發(fā)芽率比較的結果又可以看出（圖2），9個處理試驗的發(fā)芽率較CK而言都高，以處理2的發(fā)芽率數(shù)值為最大，高達60.33%，發(fā)芽率數(shù)值最小的處理7，僅為42.47%。由發(fā)芽指數(shù)比較結果可以看出（圖3），9種不同處理的發(fā)芽指數(shù)數(shù)值都明顯大于CK組。結果表示，僅有處理2的發(fā)芽指數(shù)數(shù)值高于25，而處理1、4、7的發(fā)芽指數(shù)的數(shù)值都在20以下。從活力指數(shù)的比較結果可以清晰的看出（圖4），9個處理的活力指數(shù)數(shù)值都要比對照高，處理1、2、5這3組的活力指數(shù)數(shù)值較高，從結果能夠明顯看出，處理2的種子活力指數(shù)數(shù)值最高，高達189.38，而處理7最低，僅為110.08。綜合結果對比表明，褪黑素濃度不管是 50 μmol/L，100 μmol/L 還是200 μmol/L，其 在 8、12、24 h 的 處 理 時 間 下 對STm1619甜菜種子都有一定的引發(fā)作用。當褪黑素濃度為 50 μmol/L、處理時間為 12 h情況下，對STm1619甜菜種子的引發(fā)效果最好，可以大大提高甜菜種子的活力。

圖1 不同濃度褪黑素發(fā)芽勢比對

圖2 不同濃度褪黑素發(fā)芽率比對

圖3 不同濃度褪黑素發(fā)芽指數(shù)比對

圖4 不同濃度褪黑素活力指數(shù)比對

2.5 STm1619甜菜種子活力的電導率測定

由于甜菜種子種類各不相同，其種子活力也有高低之分。一般來說，高活力種子相對于低活力種子而言，不僅它的細胞膜的損傷程度要小，而且重新構建細胞膜的速度快于低活力種子，其修復細胞膜的損傷程度也要遠遠優(yōu)于低活力的種子。根據(jù)國內(nèi)外的研究人員的探索發(fā)現(xiàn)，電導率就可以清晰地測定出甜菜種子活力的高低，它可以為試驗所需要的甜菜種子提供一個較為精確的數(shù)值和指標。由于上述分析可知，往往高活力的甜菜種子所浸泡的溶液，它的電導率要低于低活力的甜菜種子。由于甜菜種子在所浸泡液中含有各種溶解鹽類且以離子的形式存在，且隨著其浸泡液中離子濃度大小的變化程度，可以清晰看出所需甜菜種子電導率大小以及與其種子活力的相關性。因此，為了更準確測定出實驗所需的STm1619甜菜種子的活力大小，需要做一項關于種子活力電導率測定的實驗。

甜菜種子電導率實驗所需要的主要材料是若干顆STm1619甜菜干種子。實驗的主要器具有：數(shù)值顯示清晰且準確的電導率儀、250 mL規(guī)格的玻璃燒杯、純凈的蒸餾水、保鮮膜、玻璃棒、標簽紙等。

電導率測定實驗步驟如下（表5）：（1）首先準備好4個250 mL規(guī)格的玻璃燒杯，將其用純凈的蒸餾水沖洗干凈后備用，取出約200顆左右的STm1619甜菜干種子并將其平均分為4組，每組約50顆。（2）將清潔完畢的玻璃燒杯中分別放置200 mL的蒸餾水并用準備好的標簽紙在3個燒杯上分別貼上8、12、24 h和CK的標簽（。3）按照上述實驗步驟配置好濃度分別為50μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的3組褪黑素溶液，另一燒杯放入200 mL的純凈蒸餾水作為對照。（4）將4組STm1619甜菜干種子放入配置好的3種不同濃度梯度的溶液和蒸餾水的燒杯之中，經(jīng)過充分攪拌均勻后，用保鮮膜將玻璃杯封口，再分別靜置浸泡8、12、24 h。（5）4組燒杯分別在8、12、24 h后揭開封口的保鮮膜，用數(shù)值顯示清晰且精確的電導率儀測出浸泡液的電導率值，為了防止讀數(shù)或其他因素產(chǎn)生的誤差，每個時間段重復測定3次電導率值，最終取平均值計入數(shù)據(jù)。

表5 不同濃度褪黑素溶液電導率測定的處理

經(jīng)過對實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析，結果（表5）表明：50 μmol/L濃度的褪黑素溶液在經(jīng)過8、12、24 h的時間下，電導率的數(shù)值為109.97、140.33和99.03，均高于對照(86.28)；100 μmol/L濃度的褪黑素溶液在經(jīng)過8、12、24 h的時間下，電導率的數(shù)值為130.93、134.80、98.03，均高于對照(125.63)；200 μmol/L濃度的褪黑素溶液在經(jīng)過8、12、24 h的時間下，電導率的數(shù)值為125.53、140.77、100.70，均高于對照(77.93)；總體看來，3組浸泡在褪黑素溶液中的電導率數(shù)值在8、12、24 h的處理時間下都要高于對照。STm1619甜菜種子在褪黑素溶液浸泡12 h的條件之下，其整體的電導率值最高，而在24 h的處理時間下其電導率的數(shù)值要低于8 h和12 h的處理時間，且最接近于對照。經(jīng)過電導率測定的實驗可以得出以下結論：褪黑素這一引發(fā)劑可以提高STm1619甜菜種子的活力，在不同時間的處理之下，種子的活力程度也各不相同。因此，種子經(jīng)過適宜的時間和濃度處理，能夠有效提高其活力，才能最終提高種子萌發(fā)的程度。

3 討論

在種子引發(fā)過程中，常用的方法不僅有液體引發(fā)、固體基質(zhì)引發(fā)、水引發(fā)，還有生物引發(fā)和膜引發(fā)等處理技術[18]。上述方法雖各有千秋，但其基本的原理都是：在一定的條件下使種子慢慢吸收水分，并在初期進行恰當?shù)奶幚?，從而達到發(fā)芽的目的[19]。液體引發(fā)劑因其使用簡便、快速、容易使用等優(yōu)點，在種子引發(fā)的過程中得以廣泛應用[20-21]。目前很多作物種子采用液體引發(fā)的引發(fā)方法，如GIAVENO等[22]采用NaCl對14份玉米雜交種進行了耐鹽性研究；HABIBI[23]研究鹽脅迫下向日葵幼苗對外源硒的生理、光化學和離子響應。

褪黑素是一種吲哚類色胺，它參與了動物的晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)褪黑素這一引發(fā)劑雖然廣泛存在且已經(jīng)被大量應用于各種高等作物中，但目前有關褪黑素在植物中的研究仍是少數(shù)[24]。HERNàNDEZRUIZ[25]在多種植物上做了實驗，提出褪黑素可能有類似于植物生長調(diào)節(jié)劑IAA的作用方式。國海燕[26]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素種子引發(fā)可以增加小麥的根冠比，提高地下部分的生長。袁志剛[27]以陸地棉的2個耐鹽性較強和2個耐鹽性較弱的品種為材料，研究褪黑素的引發(fā)處理對棉花種子萌發(fā)和出苗的影響。

種子的品種類型、原始生活力、處理劑量的多少、處理的時間和溫度、種子含水量的多少和處理的方式方法等都是影響種子引發(fā)處理效果的重要因素[28]。引發(fā)后的種子，其活力提高、抗性增強、發(fā)芽迅速、出苗整齊、成苗率高[29]。

實驗所研究的結果與以往文獻論著相同點主要在于：所選取的試劑相對于水引發(fā)（對照）而言，對甜菜種子有明顯的引發(fā)效果，且不同濃度或是不同處理時間的引發(fā)劑對于種子的萌發(fā)效果也各不相同。此外，本實驗褪黑素所選取的不同濃度與前人研究所選取的濃度梯度基本保持一致；與前人所研究的不同之處除了所選取的褪黑素試劑在甜菜種子萌發(fā)領域的應用鮮有之外，主要的創(chuàng)新點在于為了測定在不同的引發(fā)劑濃度和不同的處理時間下甜菜種子活力的高低，為實驗提供出更加精確的數(shù)值和指標。本實驗增加了測定STm1619甜菜種子活力的電導率實驗，且電導率實驗的結果顯示：不同濃度的褪黑素對于甜菜種子的萌發(fā)有顯著的效果。

實驗過程中，由于試劑稱取質(zhì)量的多少和試劑溶液損耗等情況會引起實驗數(shù)據(jù)的部分誤差。實驗所選取的部分STm1619甜菜干種子不夠飽滿或是死亡，以上特殊情況對實驗的最終數(shù)據(jù)和結果都會有些許影響。

本實驗雖然經(jīng)過仔細的設計和實踐操作，但是仍會存在些許不足，主要的不足之處總結如下：（1）對于褪黑素引發(fā)劑而言，實驗所選取的濃度梯度過少，可以進一步細化溶液的濃度和增加時間梯度的變化，這樣能夠尋找出更為適合褪黑素的濃度和處理時間；（2）本實驗的限制因素除了實驗中褪黑素質(zhì)量的稱取和溶液消耗等產(chǎn)生的誤差外，還有所選取的種子出現(xiàn)死亡、培養(yǎng)箱水箱里的濕度和溫度過高或者過低等因素；（3）因甜菜種子引發(fā)的研究仍處于初始階段，引發(fā)劑組合、種類還在摸索階段。因此，可以篩選出更多有利于甜菜種子萌發(fā)的引發(fā)劑種類和處理時間，從而為提高甜菜種子發(fā)芽率和塊根產(chǎn)量和質(zhì)量奠定一定的理論基礎。

國內(nèi)有關甜菜種子引發(fā)的研究極為少數(shù)。但隨著甜菜育種近年來在中國東北部部分地區(qū)不斷發(fā)展，我們更應該加強在選育甜菜種子抗病性以及引發(fā)活力等各方面的選育研究，使選取的甜菜種子更具有優(yōu)良性。實驗進行多種試劑引發(fā)研究從而可以篩選出更為適合甜菜種子引發(fā)的試劑，這樣才能使實驗結果更具備科學性和廣泛性。此外，中國應該開括渠道，加強與國際相關引發(fā)研究的交流與聯(lián)系，多途徑引進更利于種子引發(fā)的資源，由種子引發(fā)理論到科學實踐才能更好地展望種子引發(fā)的課題前景。

4 結論

本研究試驗設置在溫度為23℃、濕度為70%的條件之下，褪黑素濃度分別設置為50、100、200 μmol/L，處理時間分別為8、12、24 h。實驗結果充分證明了在不同的處理時間內(nèi)，不同濃度的褪黑素對甜菜種子發(fā)芽的影響會有很大的差異。實驗設置的50、100、200 μmol/L三種不同梯度濃度處理，在8、12、24 h的處理時間之下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)都比對照高，而50 μmol/L濃度的處理在12 h時的發(fā)芽率和活力指數(shù)數(shù)值均比其他的8個處理高；在200 μmol/L濃度、8 h的處理時間下，引發(fā)效果極為不明顯，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)均與對照相近?？傮w看來，經(jīng)過褪黑素引發(fā)劑處理過的STm1619甜菜種子，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都高于對照。研究結果表明，褪黑素有利于甜菜種子的萌發(fā)，但是要擇優(yōu)選擇出甜菜種子里，最適宜生長的褪黑素濃度和引發(fā)處理的時間梯度。