鹿繁殖技術(shù)的研究進(jìn)展

魏倩倩，王巖，許保增，趙偉剛，常忠娟，楊乾龍，范冰峰，薛海龍，羅劍通，楊鎰峰，趙蒙※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.西豐縣鹿業(yè)發(fā)展局，遼寧 西豐 112400）

近年來，隨著科技的進(jìn)步和社會的發(fā)展，越來越多的人投身到養(yǎng)鹿產(chǎn)業(yè)中，盡管養(yǎng)鹿規(guī)模不斷擴(kuò)大，但集約化生產(chǎn)體系尚未完善。鹿繁殖力低下是制約養(yǎng)鹿業(yè)發(fā)展的主要瓶頸之一，影響鹿繁殖力低下的因素很多，除對鹿的生殖生理特點(diǎn)缺乏系統(tǒng)地研究之外, 自然環(huán)境條件、人工輔助繁殖方法、飼養(yǎng)管理以及其他技術(shù)水平都是重要的影響因素, 這些因素通過不同的途徑直接或間接地作用于鹿群繁殖過程中的各個環(huán)節(jié), 最終調(diào)控繁殖力。繁殖力低不僅導(dǎo)致鹿群擴(kuò)繁速度慢，還延長了新品種的培育周期。通過借助人工授精、超數(shù)排卵和胚胎移植等輔助繁殖技術(shù)不僅能提高母鹿繁殖能力，還能最大化利用優(yōu)秀種公鹿的精液，擴(kuò)大后代鹿群數(shù)量，延長種公鹿的使用年限。本文對國內(nèi)外鹿繁殖技術(shù)研究進(jìn)行系統(tǒng)綜述，為提高母鹿繁殖性能，促進(jìn)養(yǎng)鹿業(yè)高效發(fā)展提供參考。

1 人工授精

鹿是一種半馴化的野生動物，過去一直采用自然交配的方式配種，在自然交配條件下，1 只優(yōu)良種公鹿最多配種20 只母鹿，而1 只優(yōu)良種公鹿可產(chǎn)冷凍精液2 000 多管,如果用于人工授精，1 只母鹿使用2 管精液，可為1 000 只母鹿授精，是本交的50 倍[1]。人工授精技術(shù)的應(yīng)用，對提高優(yōu)良種公鹿的利用率意義重大，與傳統(tǒng)的配種方法相比，人工授精技術(shù)的應(yīng)用在減少種公鹿的飼養(yǎng)數(shù)量的同時，還增加了與配母鹿的數(shù)量，降低了種公鹿的養(yǎng)殖成本，加速了鹿的遺傳改良進(jìn)程。

精液采集方法是影響人工授精的重要因素，主要有假陰道法、附睪取精法和電刺激法。目前，安全收集精液并廣泛被接受的方法是在全身麻醉下使用電刺激法，雖然使用麻醉藥對動物有危害，但相較于自然交配精液收集的方法，它適用于所有個體而不是少數(shù)經(jīng)過特別訓(xùn)練的動物，并且耗時短、操作便利。精液冷凍保存技術(shù)是伴隨人工授精技術(shù)發(fā)展起來的新型輔助繁殖技術(shù)，是人工授精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有效解決了精液長期保存的問題[2]。精液冷凍包括顆粒冷凍、安瓶冷凍和細(xì)管冷凍等，目前，鹿精液冷凍多采用細(xì)管冷凍，細(xì)管凍精使精液在凍存的過程中不受細(xì)菌污染，而且冷凍后精子的活力和頂體的完整率基本不受影響。此外，人工授精技術(shù)中除了技術(shù)人員的操作手法以及熟練程度外，選擇適合的精液稀釋液對受胎率也有極大的影響，在以卵黃為基礎(chǔ)的稀釋液研究中，Haigh 等[3]在精液中通過加入卵黃和甘油作為冷凍保護(hù)劑，使精子降溫和冷凍過程中其穩(wěn)定性不受損害且復(fù)蘇后精子的活力不受影響。Zhang 等[4]研究表明，含有1.0% 蛋黃的冷卻劑可以較好地用于驢精液的冷卻保存，添加小蛋黃顆粒的冷卻劑也可以達(dá)到一定的效果，但Ferrante 等[5]說在冷卻劑中添加卵黃對膜功能和頂體狀態(tài)有一定的危害。而Stewart 等[6]撤去卵黃精液稀釋液在白尾鹿上取得成功，但收集和冷凍精液的最佳時間仍不確定。近年來，冷凍精液相關(guān)研究主要集中在冷凍保護(hù)劑和稀釋液配方的篩選、冷凍程序優(yōu)化和解凍液等環(huán)節(jié)，對精液冷凍保存進(jìn)行了深入的研究[7-9]，隨著冷凍方法和冷凍保護(hù)劑的不斷改良，精子存活率有了較大的提高，該技術(shù)對于精子的授精能力也有一定的影響[10]。

用冷凍精液進(jìn)行人工授精可以選擇和傳播優(yōu)良基因，但人們對整個發(fā)情期進(jìn)行精液冷凍保存的最佳時間知之甚少[11]。Stewart 等[12]在繁殖季節(jié)早期（9 月，n=6）、發(fā)情高峰期（12 月，n=8）和繁殖季節(jié)后期（3 月，n=7）采集白尾鹿精液，比較不同時期冷凍保存后精液質(zhì)量，研究結(jié)果表明精子整體活力、質(zhì)膜完整比例在發(fā)情高峰期最高。馬鹿在發(fā)情高峰期的高質(zhì)量精液被歸因于增加的抗氧化產(chǎn)物，這可以保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激[13]，低溫保存后氧化應(yīng)激與馬鹿低溫保存后染色質(zhì)損傷增加和頂體完整性喪失有關(guān)[14]，并已被證明對多種物種的生育能力產(chǎn)生不利影響。

除此之外，輸精技術(shù)是造成人工授精技術(shù)成功效率低下的另一個重要因素[15]，Oliveira等[16]、楊莉等[17]進(jìn)行了輸精部位對驢受胎率的影響的研究，發(fā)現(xiàn)子宮角深部輸精的受胎率均比子宮體內(nèi)輸精顯著提高。目前，馬鹿應(yīng)用最廣泛的是直腸把握法，梅花鹿常用開膣器或腹腔鏡輸精法在子宮頸陰道開口完成輸精[18]。而子宮內(nèi)輸精和子宮角深部輸精技術(shù)結(jié)合精液冷凍保存技術(shù)還需深入研究。

2 同期發(fā)情

目前，國內(nèi)對鹿的同期發(fā)情使用較多的為CIDR+PMSG法。2005 2006 年蔡志剛等[19]在繁殖季節(jié)前期對50只馬鹿用CIDR+PMSG 法進(jìn)行同期發(fā)情處理，結(jié)果表明，同期發(fā)情率分別為84.3%，88.5%。楊艷[20]在繁殖季節(jié)采用孕酮陰道海綿栓（CIDR）+孕馬血清促性腺素（PMSG)法對1 035 只塔里木馬鹿進(jìn)行同期發(fā)情處理，取栓后注射400~500 IU PMSG，其中有921 只發(fā)情，同期發(fā)情率為89%，定時輸精受胎率為44%。高慶華等[21]對140 只天山馬鹿采用CIDR+PMSG+PG 方法進(jìn)行同期發(fā)情處理，同期發(fā)情率達(dá)85%，情期受胎率達(dá)50%。魏海軍等[22]將梅花鹿分成2組，采用CIDR ＋PMSG 法進(jìn)行同期發(fā)情處理，1 組注射200 IU，2 組注射150 IU，兩組的同期發(fā)情率分別為86%（18/21）和92%（22/24），對發(fā)情母鹿進(jìn)行腹腔鏡人工輸精，兩組母鹿產(chǎn)仔率分別為50%和38%。向振博等[23]用CIDR+PMSG對梅花鹿進(jìn)行同期發(fā)情試驗(yàn)，受胎率為71.8%。

3 胚胎移植

胚胎移植技術(shù)最早應(yīng)用于牛的繁育，鹿的胚胎移植發(fā)展較慢，公開報道顯示鹿的胚胎移植的首次應(yīng)用是由Waldhalm 等[24]完成。隨著胚胎移植技術(shù)的不斷發(fā)展，在黇鹿、赤鹿、馬鹿和麋鹿等進(jìn)行胚胎移植并取得了成功[25,26]，我國也陸續(xù)開始了鹿胚胎移植技術(shù)方面的研究，李樹靜等[27]在馬鹿的胚胎移植中用自然發(fā)情的馬鹿進(jìn)行鮮胚移植并成功產(chǎn)下2 個后代。高慶華等[28]將天山馬鹿超數(shù)排卵得到的胚胎移植給13 只受體，其中7 只馬鹿受胎。王梁等[29]通過對胚胎移植技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，建立了梅花鹿胚胎移植技術(shù)體系，并首次成功應(yīng)用胚胎玻璃化冷凍技術(shù)，這一技術(shù)的改進(jìn)將有利于梅花鹿胚胎移植的發(fā)展。趙列平等[30]以不同處理方式對馬鹿移植效果進(jìn)行比較，其中同期發(fā)情鮮胚移植成功率52.8%，自然發(fā)情鮮胚移植成功率72.2%，同期發(fā)情凍胚移植成功率40.0%，自然發(fā)情凍胚移植成功率42.9%。研究結(jié)果表明，馬鹿胚胎移植比自然發(fā)情鮮胚移植效果好。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所對梅花鹿進(jìn)行鮮胚移植，獲得3 只胚胎后代，這是我國首次獲得梅花鹿胚胎移植后代[31]。

4 胚胎冷凍

胚胎冷凍不僅是保存、傳遞遺傳信息行之有效的的方法，也是人工授精、胚胎移植和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)密不可分的一部分。鹿胚胎冷凍技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了從慢速冷凍到玻璃化冷凍過程。Dixon 等[32]以甘油作主要冷凍保護(hù)劑，首次用慢速冷凍法對馬鹿胚胎進(jìn)行冷凍，但慢速冷凍需要高精密的自動控溫設(shè)備和長時間的平衡冷卻過程，操作步驟較為復(fù)雜，因此在某些實(shí)驗(yàn)過程中會受到一定的限制，這種相對耗時的技術(shù)已被其他技術(shù)所取代，而后就出現(xiàn)不需要經(jīng)稀釋和冷凍儀器的乙二醇慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。Soler 等[33]在馬鹿胚胎冷凍試驗(yàn)中，OPS 法冷凍、解凍胚胎和細(xì)管法玻璃化冷凍，解凍后胚胎移植的妊娠率分別為53.3%和70.0%，可見，在馬鹿胚胎冷凍保存過程中，玻璃化冷凍方法具有顯著優(yōu)勢。王梁等[29]在梅花鹿上應(yīng)用胚胎玻璃化冷凍技術(shù)成功獲得受體妊娠率為61.54%，產(chǎn)仔率為53.85%，與鮮胚移植的妊娠率和產(chǎn)仔率沒有顯著性差異。玻璃化冷凍法能夠避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，使得樣品在冷凍保護(hù)溶液中形成玻璃化。玻璃化冷凍技術(shù)因其簡便、快速、低成本以及更好地保護(hù)胚胎避免受到冷凍帶來的細(xì)胞損傷而被人采用[34]。

5 性別控制

在自然繁殖情況下，鹿繁殖得到雌雄鹿的概率相同，而雄鹿的經(jīng)濟(jì)價值遠(yuǎn)高于雌鹿，如果能對后代的性別進(jìn)行干預(yù)，就能擴(kuò)大雄鹿數(shù)量，從而提高產(chǎn)茸量。使用性別控制技術(shù)加速繁殖優(yōu)良公鹿，解決制約養(yǎng)鹿業(yè)發(fā)展的瓶頸問題——優(yōu)良種公鹿缺乏，推動我國養(yǎng)鹿業(yè)發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。目前，性別控制可以通過精子分離或早期胚胎性別鑒別來實(shí)現(xiàn)，在實(shí)踐應(yīng)用中PCR 早期胚胎鑒定還有諸多弊端，利用流式細(xì)胞術(shù)對具有X 染色體和Y 染色體的精子進(jìn)行性別分選是確定后代性別最實(shí)用和有效的方法[35]，該技術(shù)已成功應(yīng)用于梅花鹿和馬鹿以產(chǎn)生所需性別的后代[36]。趙列平等[37]對469 只馬鹿、79 只梅花鹿進(jìn)行分離Y 精子性別控制研究，X、Y 精子的性別準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。董云祥等[38]對馬鹿性控凍精人工授精試驗(yàn)，經(jīng)過3 年的研究實(shí)現(xiàn)了總受胎率為95%，性控準(zhǔn)確率為100%。目前我國已經(jīng)建立了茸鹿精子性控冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)流程，并收集了國內(nèi)5 個優(yōu)秀的種馬鹿細(xì)胞系。

6 妊娠診斷

最早使用的早期妊娠診斷方法是外部觀察法，但此種方法不十分準(zhǔn)確，隨后應(yīng)用直腸檢查方法，雖然直腸檢查已成為一項重要而常規(guī)的繁殖技術(shù)，但該方法需要準(zhǔn)確把握發(fā)情周期中卵巢上黃體、卵泡及子宮中胎膜發(fā)育早期的精細(xì)變化，操作繁瑣，技術(shù)要求較高，操作不當(dāng)易造成胚胎損失等。此外，妊娠診斷還有血液黃體酮測定技術(shù)、糞便中類固醇激素代謝物測定技術(shù)和PSPB 技術(shù)[39]，刁曉平等[40]在對海南坡鹿生殖狀況與糞便中孕酮含量研究的試驗(yàn)中，測定3 只坡鹿糞便中孕酮含量，結(jié)果表明懷孕后孕酮含量明顯上升，分娩后孕酮含量迅速降至低濃度水平，通過分析糞便中孕酮含量變化反映坡鹿的生理狀況并作為早期胚胎診斷的依據(jù)。國外資料記載對圈養(yǎng)的駝鹿利用糞中孕酮含量和盲區(qū)檢查，其中26 只懷孕鹿中診斷出22 只，診斷準(zhǔn)確率為84.62%，而利用糞便中雌二醇含量診斷準(zhǔn)確率為57.7%。這種方法雖然準(zhǔn)確靈敏，但操作繁瑣不宜在現(xiàn)場進(jìn)行。B 超是繼直腸觸診和激素測定之后在鹿生殖領(lǐng)域最有深遠(yuǎn)意義的診斷技術(shù)，B 超診斷為在活體狀態(tài)下研究鹿的生殖和生理機(jī)能提供了一個便利的窗口。王梁等[41]采用超聲波技術(shù)對14 只鮮胚移植和13 只凍胚移植的梅花鹿進(jìn)行妊娠診斷，妊娠診斷率分別為85.71%和61.54%。

7 克隆

綿羊Dolly 是世界克隆的第1 個哺乳動物，它的誕生為克隆技術(shù)在其他哺乳動物的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，而后克隆出鼠、牛、山羊、豬和猴等動物，鹿的克隆技術(shù)在國外也有報道。2003 年美國克隆出名叫“杜威”的白尾鹿，這是首次成功克隆鹿科動物。Berg等[42]利用84只馬鹿的鹿茸干細(xì)胞及其分化的細(xì)胞成功克隆了8 只馬鹿，克隆率為10%，并且后代的遺傳物質(zhì)基本與供體一致。隨著克隆技術(shù)的不斷發(fā)展，我國也開始嘗試鹿的克隆技術(shù)，2009 年內(nèi)蒙古大學(xué)與赤峰健元鹿業(yè)和蒙牛繁育生物技術(shù)有限公司合作，成功克隆出3 只馬鹿。利用同種動物體細(xì)胞核移植技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)比較成熟。徐靜等[43]突破傳統(tǒng)克隆的束縛開始了對梅花鹿同種和梅花鹿-牛異種克隆進(jìn)行探索，分別獲得同種核移植重組胚胎54枚，梅花鹿-牛異種核移植重組胚胎49枚，同種重組胚4 枚，融合率分別為44%、32.65%和75%，將獲得的重組胚胎移植給經(jīng)同期發(fā)情處理的梅花鹿，受體均無受胎。作者認(rèn)為失敗的原因可能與受體的免疫系統(tǒng)對移入的胚胎發(fā)生排斥所致，因此要進(jìn)一步探索減少或消除受體排斥的方法，從而提高異種胚胎妊娠率。鹿克隆技術(shù)的意義深遠(yuǎn)，但其應(yīng)用研究進(jìn)展相對緩慢，相關(guān)技術(shù)仍很不完善，基礎(chǔ)理論研究也相對薄弱，對一些早期胚胎發(fā)生和發(fā)育機(jī)制缺乏深入了解。

8 結(jié)語和展望

通過利用鹿的繁殖技術(shù)雖然培育了一些優(yōu)良種公鹿，但鹿的繁殖技術(shù)與其他動物相比發(fā)展仍較落后。目前，鹿的人工授精、同期發(fā)情技術(shù)和性別控制技術(shù)已經(jīng)趨于成熟，但鹿的胚胎移植、胚胎冷凍后的妊娠率仍較低，我們還應(yīng)借鑒家畜的一些相關(guān)成果繼續(xù)深入研究，根據(jù)鹿的生殖生理特性找到優(yōu)秀種群的擴(kuò)繁技術(shù)和新品種的選育方式，促使茸鹿產(chǎn)業(yè)給人類帶來最大化的利益。