刺五加多糖的提取工藝及活性研究進展

高世勇，唐博琪，石佳，魏新瑞，譚慧心

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150001）

刺五加[Acanthopanax senticosus (Rupr.Maxim.)Harms]屬于五加科五加屬植物，主要分布于黑龍江、吉林、河北和山西等地，在中國東北部地區(qū)較為常見，也分布于俄羅斯、日本以及朝鮮地區(qū)。其性溫，味辛，有益氣健脾、補腎安神的功效?，F(xiàn)有的研究報道顯示，刺五加含有皂苷類、黃酮類、多糖類、香豆素類和木脂素類等多種活性成分。近期查閱文獻發(fā)現(xiàn)粟杰等[1]首次從刺五加中提取到異落葉松脂醇和異落葉松脂醇等11種新的化合物[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)顯示刺五加具有調(diào)節(jié)免疫、治療心血管系統(tǒng)疾病、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等藥理學(xué)作用。目前，對于刺五加的研究主要集中在刺五加成分的分離和提取等方面，但對刺五加多糖的工藝研究和藥理作用等方面的研究報道較少。因此，探究刺五加多糖的提取工藝以及藥理學(xué)作用具有廣闊的前景。

多糖是維持機體正常運轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)物質(zhì)，其分子量較大，化學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。近年來，研究人員對植物多糖抗腫瘤方向的研究較多，與此同時，還發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和腸道保護等多種生物活性，因此對其進行深入地研究對人類的生命健康以及未來保健食品與藥品的開發(fā)具有重要意義。多糖是刺五加所含的主要化學(xué)成分之一。本文對刺五加多糖的化學(xué)成分、提取工藝和藥理學(xué)作用等研究現(xiàn)狀進行了綜述，并且其未來發(fā)展進行展望，旨在為刺五加多糖的深入研究以及應(yīng)用提供一定科技支撐。

1 刺五加多糖的理化性質(zhì)

刺五加多糖為深灰色固體粉末，質(zhì)地較輕，易溶于水[2]。刺五加不同部位的多糖含量有較大差異，胡勇超等[3]發(fā)現(xiàn)刺五加果實中多糖含量最高，其次為莖、葉、根。刺五加多糖也是刺五加活性成分中含量較高且分布較廣的成分之一。從刺五加中分離出5 種水溶性多糖和2 種堿溶性多糖，分別占刺五加總量的2%~6%和2.3%~5.7%[4,5]。我國學(xué)者從刺五加中提取到了刺五加多糖PES、ASPB、ASPF、ALP-1、中性糖ASPN 和酸性糖ASPA 等[4,6]。研究顯示，刺五加多糖的分子量較小，尤其是在刺五加根莖中分離純化后得到的多糖，分子量在100kDa 以下。從酸性糖ASPA 純化得到的多糖ASPA-1-A 和ASPA-1-B 都含有RG-I、AG 和XGA型果膠結(jié)構(gòu)域。ASPF 中提取的多糖結(jié)構(gòu)也是類似于果膠類。

多糖中的單糖組成決定其空間結(jié)構(gòu)以及生物活性。分析刺五加多糖中的單糖組成，常采用高效液相法或氣相色譜法。白也明[2]通過水提醇沉法從刺五加根莖中提取刺五加多糖，高效液相色譜法分析其單糖組成，結(jié)果顯示刺五加多糖主要是由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸及鼠李糖組成。佟瀟禹[7]采用相同的方法檢測刺五加果實中提取的多糖中的單糖組成，得出單糖組成與白也明的結(jié)果相同，單糖的摩爾比為0.56:1.5:3.62:1:4.45:3.9。李利紅等[8]采用柱前衍生化GC-MS 法測定刺五加多糖的單糖組成，結(jié)果顯示主要是由木糖、阿拉伯糖、半乳糖以及葡萄糖組成，且在刺五加多糖中木糖以及半乳糖的含量遠遠高于阿拉伯糖和葡萄糖。Meng等[9]研究發(fā)現(xiàn)刺五加多糖是由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖以及甘露糖組成的。雖然文獻報道對刺五加多糖中單糖的組成以及組成比例不統(tǒng)一，但是總體表明刺五加多糖是由木糖、半乳糖、阿拉伯糖以及葡萄糖組成，不同文獻報道結(jié)果不一致可能是由于刺五加產(chǎn)地不同、多糖提取方法不同以及純化和檢測方法不同所導(dǎo)致的。

2 刺五加多糖的提取工藝

2.1 回流提取法

由于多糖具有極強的親水性，因此回流提取方法常采用水作為溶劑。于淼等[10]采用水提醇沉法對刺五加根廢棄物中的多糖進行提取，在單因素實驗基礎(chǔ)上結(jié)合了響應(yīng)面法對提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，刺五加根廢棄物中多糖的最佳提取工藝為在80℃時，料液比為1:21 條件下提取1.5 h，在此工藝下提取3 次的平均得率為10.14%，與理論最優(yōu)方法得率相近，提示該提取方法可靠。

2.2 煎煮法

李利紅等[8]通過煎煮法比較了水提取法以及堿水提取法得到的多糖提取率以及總糖的含量，實驗結(jié)果顯示，水提取法多糖得率較堿水提取法高，但總糖含量低于堿水提取法，最終確立了刺五加多糖的最佳煎煮方法為堿水提取法。

2.3 超聲輔助提取法

與傳統(tǒng)的回流法及煎煮法相比，超聲提取法具有提取效率高和提取時間短等優(yōu)點。李俊萍等[11]采用超聲提取法對17 個不同產(chǎn)地的刺五加進行了多糖的提取，最終建立了刺五加多糖的最佳提取工藝：在料液比1:10 的條件下，55℃提取30 min，17 個不同產(chǎn)地的刺五加多糖的提取平均產(chǎn)率可以達到4.36%，結(jié)果提示該提取工藝方法可行。

現(xiàn)有文獻報道對刺五加多糖的超聲波輔助提取法的提取條件不同，所得到的多糖提取率相差較大。劉冉等[12]采用超聲波輔助提取法對刺五加多糖的提取方法進行單因素與正交實驗，實驗結(jié)果表明，在料液比為1:40、80%的甲醇濃度下提取60 min，所得的刺五加多糖的提取率高達16.35%。

在不同的超聲輔助提取法條件下，刺五加多糖的提取率有很大的差異，這除了與刺五加的產(chǎn)地不同有關(guān)，還與刺五加多糖的提取工藝路線有關(guān)，日后的研究可以關(guān)注提取工藝的優(yōu)化方面，與此同時建立完善的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)也很重要。

2.4 微波提取法

與傳統(tǒng)的回流以及煎煮法相比，微波提取法具有縮短提取時間、節(jié)省提取溶劑和提高多糖提取率的優(yōu)點。張小飛等[13]采用微波提取法對刺五加中的多糖進行提取，在單因素實驗的基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法對刺五加的多糖提取工藝影響較大的微波提取時間、微波功率以及料液比因素進行了考察，結(jié)果顯示，料液比為1:25 時，450 W 的微波功率下提取22.5 min為刺五加多糖的最佳提取工藝，平均提取率為1.52%。

傳統(tǒng)方法提取刺五加多糖是采用煎煮法，但是該方法耗時，并且提取率較低。目前，回流提取法是最常見的刺五加多糖提取方法，該方法簡單方便、提取條件溫和，但是不適用于含纖維素較多的植物。微波提取法以及超聲輔助提取法提取刺五加多糖具有耗時低、效率高、節(jié)約能源和不破壞有效成分的優(yōu)點，逐漸成為工業(yè)生產(chǎn)上常用的刺五加多糖提取方法。

3 刺五加多糖的分離純化

從植物中獲得的多糖帶有的電荷和化學(xué)性質(zhì)等均有差異性，對于植物多糖的純化是通過多糖級分的不同，最終分離得到相對均一的級分。經(jīng)過上述提取方法得到的為刺五加粗多糖，含有蛋白質(zhì)、無機鹽和色素等雜質(zhì)，為了不影響刺五加多糖的純度以及后續(xù)相關(guān)結(jié)構(gòu)的分析研究，應(yīng)該將刺五加粗多糖進行分離純化，主要進行去蛋白及去色素分離純化。刺五加多糖除蛋白法常采用Sevag 法，該方法條件較溫和，并且對多糖結(jié)構(gòu)的影響較小，但是純化時需要反復(fù)處理，影響最后得率。李天金等[14]發(fā)現(xiàn)用雙氧水處理刺五加粗多糖時，可能會和多糖中的成分發(fā)生反應(yīng)，最終造成多糖的得率較低，用5 種不同樹脂純化刺五加粗多糖，用去色素、去蛋白以及多糖的保留率指標(biāo)作為參考，最終認(rèn)為D941 樹脂對刺五加多糖的去色素及去蛋白的效果較好。目前，對于刺五加多糖的純化常根據(jù)多糖所帶電荷的不同，采用離子交換層析法對其純化。Hu 等[15]人將提取到的刺五加多糖ABPS 在纖維素DEAE-52 柱進行純化，得到ABPS-1 和ABPS-2 兩個級分；將刺五加多糖ALP在纖維素DEAE-52 柱進行純化，得到ALP-1級分[5]。

4 刺五加多糖的生物活性

4.1 抗腫瘤作用

目前，很多研究報道顯示天然植物中的多糖具有抗腫瘤作用，如三葉青多糖[16]、半枝蓮多糖[17]和車前子多糖[18]等。通過查閱文獻可發(fā)現(xiàn)，刺五加多糖也被證實具有抗腫瘤作用，具體機制如下。

4.1.1 誘導(dǎo)細胞凋亡 Bcl-2 作為檢測腫瘤細胞凋亡水平的重要蛋白，它的表達對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要意義。陳靖昀等[19]研究發(fā)現(xiàn)刺五加多糖可以抑制CD133陽性腫瘤干細胞的增殖，通過Western Blot 法發(fā)現(xiàn)該作用可能與刺五加多糖影響細胞存活促進因子Bcl-2以及程序性死亡受體PD-L1 的表達有關(guān)；靳祎等[20]研究發(fā)現(xiàn)刺五加多糖對宮頸癌HeLa 細胞增殖具有抑制作用，通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，HeLa 細胞給予刺五加多糖干預(yù)后，早期凋亡率提升，免疫組化法檢測結(jié)果顯示存活素（Survivin）蛋白表達量下降，提示刺五加多糖可能通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，影響Survivin 蛋白表達實現(xiàn)抗腫瘤作用。

4.1.2 誘導(dǎo)細胞周期阻滯 細胞的順利增殖是依靠細胞從細胞周期的上一階段進入到下一階段實現(xiàn)的，阻滯細胞周期，可以抑制腫瘤細胞的增殖，對抑制腫瘤的生長及發(fā)展有重要意義。閆永鑫等[21]研究發(fā)現(xiàn)，刺五加多糖可以阻滯人小細胞肺癌細胞NCI-446 細胞的G2/M 周期，且可能是通過激活ERK1/2 來實現(xiàn)的，但具體機制還需要進行深入研究。

4.1.3 抑制細胞侵襲遷移 Wnt/ catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤細胞的增殖分化、侵襲及轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮重要的作用，參與腫瘤細胞的生存及發(fā)展。SUN等[6]研究發(fā)現(xiàn)刺五加多糖對人非小細胞肺癌細胞NCIH520 具有增殖抑制作用，并可抑制NCI-H520 細胞的侵襲及遷移，影響Wnt 3a及E-cadherin等Wnt/ catenin信號通路蛋白的表達。結(jié)果提示刺五加多糖抑制腫瘤細胞的侵襲以及遷移可能是通過影響Wnt/ catenin信號通路實現(xiàn)的，但目前對于其他侵襲遷移通路研究較少，這也提示可探究刺五加多糖對于其他侵襲遷移通路是否有影響。

4.1.4 其他抗腫瘤的作用機制 周麗菁等[22]研究發(fā)現(xiàn)將刺五加多糖灌胃給予Lewis 肺癌實體瘤模型小鼠后，小鼠的胸腺以及脾臟指數(shù)均有上升，并且刺激IL-6、TNF- 和IL-1 的分泌，通過實時定量PCR 以及Western blot 法對TLR4 信號通路的關(guān)鍵蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)刺五加多糖可通過影響TLR4 信號通路抑制Lewis 肺癌實體瘤小鼠的腫瘤生長；Mend 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將刺五加多糖給予S180 移植瘤小鼠后，小鼠體內(nèi)的IL-2、IL-12 水平顯著降低，給予H22 移植瘤小鼠后，小鼠體內(nèi)INF- 水平顯著上升。刺五加多糖的抑制腫瘤作用可能是通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)蛋白、免疫因子以及相關(guān)炎性因子實現(xiàn)的。

刺五加多糖抗腫瘤的機制主要集中在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、影響機體免疫及腫瘤細胞周期和抑制腫瘤細胞侵襲及遷移等方面，但更深入的機制研究較少，且多數(shù)都是體外研究，缺乏動物體內(nèi)實驗驗證。

4.2 抗炎作用

孟慶龍等[23]將小鼠作為實驗對象，對其進行耳廓腫脹、足趾腫脹以及肉芽腫實驗?zāi)Ｐ偷脑炷?，給予刺五加多糖進行治療，通過腫脹抑制率以及體內(nèi)炎性因子水平來評估刺五加多糖抗炎的效果，實驗結(jié)果表明刺五加多糖高（200 mg/kg）、中（100 mg/kg）劑量組可以顯著降低小鼠耳廓的腫脹程度，刺五加多糖高劑量組（200 mg/kg）可以顯著降低小鼠足趾的腫脹程度，刺五加多糖高（200 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（50 mg/kg）劑量組均可顯著改善肉芽的濕重及干重，刺五加多糖高、中和低劑量組模型小鼠體內(nèi)的炎性因子（TNF- 、IL-6 等）水平均有下降，實驗結(jié)果提示刺五加多糖具有抗炎作用。張娜等[24]用小鼠作為載體，建立免疫性肝損傷的模型，觀察其體內(nèi)及組織內(nèi)的炎性因子水平，實驗結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)的炎性因子活性顯著降低，炎性因子分泌減少，刺五加多糖發(fā)揮抗炎作用可能是通過調(diào)節(jié)NF- B 信號通路實現(xiàn)的。

4.3 其他藥理學(xué)作用

4.3.1 改善糖尿病作用 張海燕等[25]研究結(jié)果顯示刺五加多糖對2 型糖尿病具有一定的改善作用。將刺五加多糖給予2 型糖尿病模型的大鼠后，高（240mg/kg）、中（120 mg/kg）劑量組大鼠的多飲、多尿、多食的狀況以及氧化應(yīng)激、糖脂代謝指標(biāo)得到了明顯的改善，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4、胰島素受體底物2、過氧化物酶體增殖物激活受體、磷脂酰肌醇3-激酶和磷酸化Akt 蛋白表達水平顯著上升，實驗結(jié)果提示刺五加多糖可以改善氧化應(yīng)激以及糖脂代謝水平，并且高、中劑量組能充分激活胰島素信號通路，最終達到治療糖尿病的效果。

4.3.2 抗疲勞作用 盛瑜等[26]研究發(fā)現(xiàn)北蟲草和刺五加的組合物質(zhì)具有抗疲勞作用，該組合物質(zhì)提高機體的糖原儲備以及抗氧化活力，降低體內(nèi)的無氧酵解、分解蛋白質(zhì)供能，這可能是通過激活蛋白激酶B/糖原合成酶激酶/葡萄糖轉(zhuǎn)運子4 信號通路實現(xiàn)的。

4.3.3 抗氧化作用 Xia 等[27]從刺五加葉中提取出ASP-B2、ASP-B3 兩種果膠多糖，通過測定兩種多糖對DPPH、羥基自由基的清除能力以及還原能力，評估兩種多糖的抗氧化活性，實驗結(jié)果顯示在0.5~2 mg/mL的濃度下，二者均表現(xiàn)出較強的DPPH 自由基清除活性，在2 mg/mL濃度下，活性接近于抗壞血酸（VC）；在0.5~8 mg/mL濃度下，ASP-B3 對羥基自由基的清除能力高于ASP-B2，在8 mg/mL 濃度下，二者的活性接近于VC；通過還原能力檢測，發(fā)現(xiàn)二者的還原能力較弱。Hu 等[4]發(fā)現(xiàn)，刺五加果實中提取的多糖其抗氧化活性，與取代基的官能團類型有很大的關(guān)系，通過引入供氫或供電子能力強的官能團，可以大大提高其在體內(nèi)的抗氧化活性。結(jié)果提示刺五加多糖可能具有抗氧化作用，未來可以作為一種新型的抗氧化劑，作為新型的食品添加劑或藥品原料，應(yīng)用于疾病的預(yù)防與治療。

4.3.4 免疫調(diào)節(jié)作用 孫守坤[28]將ICR 小鼠作為載體，采用環(huán)磷酰胺制造免疫抑制模型，給予刺五加酸性多糖，通過檢測與免疫相關(guān)指標(biāo)來評估刺五加酸性多糖的免疫調(diào)節(jié)作用，實驗結(jié)果顯示，刺五加多糖可以提高免疫因子水平和抑制淋巴細胞凋亡，這可能是刺五加多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制。

5 展望

對于刺五加多糖的提取、純化，研究人員進行了相關(guān)的基礎(chǔ)研究，但是查閱文獻發(fā)現(xiàn)從刺五加內(nèi)提取純化出的多糖種類較少。近年來，隨著刺五加的藥理作用被挖掘，刺五加多糖未來在抗腫瘤等方面具有巨大的潛力而進入大眾的視野。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，刺五加多糖具有一定的抗氧化作用，未來刺五加多糖可作為一種新型的天然抗氧化劑來使用。但是，就目前的研究現(xiàn)狀來看，還有值得我們研究的方面。首先，從刺五加中提取出了多糖成分，但是對于多糖的構(gòu)效關(guān)系方面缺乏實驗研究；其次，刺五加生物活性實驗，有些還是需要進行體內(nèi)實驗的；最后，刺五加屬于藥食同源類的天然產(chǎn)物，怎樣合理地開發(fā)利用、是否需要進行保護以及如何保護也是值得我們思考的問題。因此，未來我們可以針對上述問題開展進一步的研究。目前，對刺五加的研究主要集中于其根、莖和葉，對于漿果的開發(fā)及利用較少，而研究顯示刺五加果實是含多糖類成分最多的部位，這就提示我們要重視刺五加果實的利用。隨著生活水平的提高，人們開始注重養(yǎng)生保健，刺五加多糖的藥理學(xué)作用有很多，然而刺五加多糖的保健制劑卻很少，未來可以開發(fā)關(guān)于刺五加多糖類的相關(guān)保健制劑。