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    高通量SNP芯片在牛體外早期胚胎染色體質量鑒定中的初步應用

    2022-11-29 13:20:06胡智輝鞏建飛王雅春趙善江朱化彬
    畜牧獸醫(yī)學報 2022年11期
    關鍵詞:滋養(yǎng)層染色體胚胎

    胡智輝,王 歡,衡 諾,鞏建飛,王 憶,王雅春,趙善江*,朱化彬*

    (1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室,北京 100193;2.中國農業(yè)大學,北京100193)

    牛胚胎生產與移植技術可以充分利用優(yōu)秀種公牛和優(yōu)秀母牛的遺傳資源[1-2],獲得大量具有高遺傳品質的牛體內、外胚胎,對于良種母牛繁殖潛力的挖掘、快速擴繁以及種質資源保護具有重要的價值。經過不斷的研究和完善,牛體外胚胎生產技術取得了巨大進步,并在生產中得到廣泛應用[3-4]。國際胚胎移植協(xié)會最新數據顯示,2020年全球共生產可移植牛體內胚胎約36萬枚,與2019年相比總體下降。然而生產的牛體外胚胎總數卻逐年攀升,2020年已超115萬枚[5]。隨著活體采卵-體外受精技術在我國乃至世界范圍的興起[6-7],體外胚胎生產正在成為牧場優(yōu)質種質資源擴繁的主要技術手段。但是,目前體外胚胎技術產業(yè)化應用還存在成本高、移植妊娠率低等問題[8-9]。在過去的15~20年里,體外胚胎移植妊娠率低這一現狀非但沒有得到改善甚至還在繼續(xù)下降[10-11]。

    胚胎質量是決定胚胎移植后妊娠率高低的關鍵[12-13],如果能在植入前對胚胎進行質量鑒定,在排除一些自身存在染色體問題的胚胎基礎上實現對胚胎生產性能的評估,那么將大大提高胚胎移植后的受胎率和犢牛的價值。研究發(fā)現,體外胚胎染色體異常導致的胚胎發(fā)育能力異常是影響體外胚胎妊娠率最根本的原因[5, 14]。染色體異常與胚胎質量、胚胎移植后妊娠率以及胎兒發(fā)育直接相關,同時也是導致早期胚胎死亡以及先天性缺陷疾病的主要原因[15]。當下,人類胚胎植入前檢測技術已經發(fā)展到了較高的水平,可以實現無創(chuàng)檢測,篩選優(yōu)質胚胎進行移植以保證受胎率和后代質量[16-17]。但是,牛胚胎遺傳價值或生產性能的測定還處于起步階段,相應的微創(chuàng)胚胎取樣技術、單細胞全基因組擴增和芯片檢測等相關工作尚未見在國內開展。因此,本研究以牛體內外胚胎為研究材料,探究利用胚胎微創(chuàng)取樣技術對胚胎進行生產性能測定的可行性,以期為進口遺傳物質監(jiān)管和胚胎質量鑒定提供一套可行的操作方案。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    本研究所用體內胚胎為實驗室自有胚胎,體外胚胎為實驗室利用離體卵巢通過體外受精所生產的胚胎,離體卵巢來自河北省廊坊市大廠屠宰場,精液來自山東奧克斯公司。

    1.2 主要試劑與儀器

    所有體外胚胎生產相關試劑均購自Sigma公司;MALBAC全基因組擴增試劑盒購自億康醫(yī)療;胚胎培養(yǎng)皿購自Thermo公司。CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司;體式顯微鏡購自Nikon公司;胚胎切割儀購自AB公司。

    1.3 體外胚胎生產

    1.3.1 卵母細胞采集及體外成熟 將屠宰場卵巢置于28~30 ℃滅菌生理鹽水中保存,2 h內送達實驗室。用加有雙抗的滅菌生理鹽水清洗3遍。用配有18號無菌針頭的真空蠕動泵抽取卵巢上3~6 mm 卵泡,在體視顯微鏡下用口吸管挑選胞質均勻、卵丘致密且包裹至少 3 層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體(COCs),置于 38.5 ℃,5% CO2,飽和濕度的 CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng) 22~24 h。

    1.3.2 體外受精 卵母細胞處理:將體外成熟 22~24 h 后的COCs用受精液洗滌3次后,移入受精液微滴中,準備進行體外受精。精液處理:將冷凍精液在 38 ℃ 左右的水浴鍋中解凍,用洗精液洗滌精液,然后1 800 r·min-1離心 8 min,棄上清,重復兩次;用洗精液重新懸浮精子沉淀;用血細胞計數器計算精子密度,調整精子密度至每毫升 2×106個。體外受精:將精液重懸液加入含有COCs的受精液中,置于 38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中精卵共孵育 8~18 h。

    1.3.3 體外胚胎培養(yǎng) 將受精后的受精卵脫去顆粒細胞后移入前期液中繼續(xù)培養(yǎng),48 h 后觀察并記錄受精卵的卵裂情況。之后移入后期液中繼續(xù)培養(yǎng),此后每 2 d 進行一次半量換液,體外培養(yǎng) 7~8 d 后,觀察并記錄囊胚的發(fā)育情況。

    1.4 胚胎切割取樣

    用不含鈣、鎂的DPBS在平皿中做3個洗滴,將胚胎在洗滴中洗滌兩次后移入最后一個洗滴,此時胚胎可牢固的貼在底部,將平皿置于胚胎切割儀的顯微鏡下,通過操作臂快速切取少量滋養(yǎng)層細胞。用口吸管將滋養(yǎng)層細胞吸出并移入提前配制好的胚胎裂解液中(注意吸取過程應盡可能少帶液),每切割一枚胚胎要重新?lián)Q洗液,同時用酒精擦拭切割刀片,裂解液可直接進行全基因組擴增或暫存于-80 ℃。切割后剩余的胚胎移入后期液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,觀察胚胎是否繼續(xù)發(fā)育并計算切割發(fā)育率。

    體外2細胞和8細胞切割取樣方法及注意事項與胚胎取樣基本一致,將胚胎透明帶切開,推出卵裂球,吸取卵裂球放入胚胎裂解液中。

    1.5 血液采集

    選取11頭母牛,使用含EDTA的采血管進行采血,全部采集牛尾根部血液,暫存于-20 ℃。

    1.6 DNA提取及全基因組擴增

    對于胚胎樣品,使用億康醫(yī)療的MALBAC全基因組擴增試劑盒。在 5 μL胚胎裂解產物中加入 30 μL 預擴增混合液,放入PCR 儀中進行預擴增。預擴增結束后在 35 μL 的預擴增產物中加入 30 μL 擴增混合液,放入PCR儀中進行指數式擴增。擴增結束后使用NanoDrop 核酸測定儀檢測擴增后DNA濃度及純度,將符合要求的DNA存于-80 ℃?zhèn)溆茫⒂嬎銛U增成功率,即擴增后的DNA量大于1 000 ng且OD值在1.7~2.1之間。

    對于血液樣品,使用磁珠法進行全血基因組DNA提取,簡單地說就是向全血中加入裂解液、異丙醇、磁珠懸浮液,將離心管放于磁力架上待磁珠完全吸附于離心管側壁后徹底棄去溶液,使用漂洗液進行兩次漂洗,使用洗脫液將DNA洗脫下來,存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.7 芯片檢測

    進行DNA擴增、酶促片段化、沉淀和重懸。隨后樣本過夜孵育的過程中與BeadChip雜交,DNA經退火得到位點特異性的50-mer探針,與某種Infinium微珠類型共價偶聯(lián)。Infinium XT工作流程繼續(xù)酶基延伸賦予等位基因特異性,然后進行熒光染色。iScan系統(tǒng)檢測微珠的熒光強度,llumina軟件自動執(zhí)行分析和基因型識別。

    1.8 芯片數據分析

    各組樣品命名如下:采集的牛全血樣品組命名為血液組(blood)、切取的半個體內胚胎組命名為1/2體內胚組(half-vivo),體內胚胎切取的滋養(yǎng)層組命名為體內滋養(yǎng)層組(vivo-tec)、體外胚胎切取的滋養(yǎng)層組命名為體外滋養(yǎng)層組(vitro-tec)、體外獲得的2細胞切取的單個卵裂球組命名為體外2細胞組(2-cell)、體外獲得的8細胞切取的單個卵裂球組命名為體外8細胞組(8-cell)。

    首先通過R語言將各組所有SNP缺失位點篩選出來,將至少3個連續(xù)SNPs缺失認為染色體片段缺失[18]。為進一步篩選各組在全基因組擴增前染色體缺失情況,同時減小全基因擴增隨機性導致的假片段缺失,試驗最終以連續(xù)7個SNPs(含7個)缺失認為染色體片段缺失。

    1.9 基因篩選、GO注釋和KEGG功能富集分析

    本研究使用ensembl數據庫(asia.ensembl.org)中的biomart 模塊將體內滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組中連續(xù)7個及以上SNPs缺失的片段中包含的基因篩選出來,將篩選出的基因使用R語言進行GO注釋和KEGG功能富集分析。

    1.10 芯片數據填充及生產性能預測

    本研究使用Beagle 5.1將Illumina 100K Bovine Bead chip芯片數據填充至Illumina 150K Bovine Bead chip。整合兩種不同密度芯片:100K芯片位點共計95 256個,150K芯片位點共計123 268個,根據位點名稱進行匹配,重合位點共計64 958個。使用Plink (https: //www.cog-genomics.org/plink2)處理軟件將原始文件轉化為VCF (variant call format)格式。使用Beagle 5.1軟件進行基因定向和填充過程,計算填充準確性。使用一步法進行基因組育種值預測,結果共有3項:產奶量、乳脂量以及乳蛋白量。

    1.11 統(tǒng)計分析

    試驗數據采用“平均值±標準差”表示,各組數據應用SAS 9.2進行單因素方差分析及多重比較,不同字母代表組間差異顯著。

    2 結 果

    2.1 胚胎切割及發(fā)育率

    試驗分別對體內囊胚、體外囊胚、體外2細胞和8細胞胚胎進行切割取樣,分別切取體內胚胎1/2(half-vivo)、一小部分滋養(yǎng)層(vivo-tec),體外胚胎一小部分滋養(yǎng)層(vitro-tec)、體外2和8細胞胚胎的單個卵裂球(2-cell和8-cell組),切割結果如圖1所示。本研究中,2-cell和8-cell組僅作為單細胞擴增組,用于驗證優(yōu)化擴增程序,其余各組切割取樣后均繼續(xù)培養(yǎng),觀察發(fā)育率。切割后發(fā)育率結果如圖2所示,vivo-tec組和vitro-tec組的切割發(fā)育率均大于90%((94.4±5.6)%vs.(90.5±6.6)%),half-vivo組切割后的發(fā)育率為(22.2±14.7)%(2/9)。這說明切取半個胚胎對胚胎的發(fā)育有較大影響,而切取少量滋養(yǎng)層細胞對胚胎繼續(xù)發(fā)育影響較小,符合胚胎微創(chuàng)取樣要求,可用于后續(xù)試驗。

    A.體內囊胚;B.切割后的體內囊胚;C.體內囊胚切割后培養(yǎng)24 h;D.體外囊胚;E.切割后的體外囊胚;F.體外囊胚切割后培養(yǎng)24 h

    圖2 各組胚胎切割后體外培養(yǎng)發(fā)育率

    2.2 全基因組擴增成功率

    胚胎切割后各組樣品通過MALBAC法進行全基因組擴增,當擴增后的DNA量大于1 000 ng且OD值在1.7~2.1之間時認為擴增成功。擴增成功率如圖3所示,1/2體內胚組和體外2細胞組DNA擴增成功率為100%,與上述兩組相比,體內滋養(yǎng)層組、體外滋養(yǎng)層組和體外8細胞組擴增成功率呈依次下降趨勢,其中體外8細胞組擴增成功率僅(60.0±24.5)%,為各組最低。這說明在相同的擴增條件下,全基因組擴增成功率可能與起始DNA含量正相關,切割獲取的起始DNA量越多,擴增成功率越高。

    圖3 不同組擴增成功率的差異

    2.3 全基因組擴增后DNA量

    全基因組擴增后各組DNA量如表1所示,1/2體內胚組DNA量最高(3 277.69±105.41),體外8細胞組最低(1 030.00±427.04)。與1/2體內胚組相比,體內滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組全基因組擴增后DNA量均顯著下降 (P<0.05),且體外滋養(yǎng)層組全基因組擴增后DNA量顯著低于體內滋養(yǎng)層組 (P<0.05),與體外2細胞組相比,體外8細胞組全基因組擴增后DNA量顯著下降 (P<0.05)。

    表1 各組全基因組擴增后DNA量

    2.4 芯片檢出率

    如圖4所示,與擴增后DNA量一致,各組芯片檢出率呈現相同的規(guī)律,1/2體內胚組的檢出率最高,可用于后續(xù)生產性能評估,其余各組依次下降。相較于1/2體內胚組,體內滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組的檢出率均顯著下降(P<0.05),且檢出率均低于90%,芯片檢出率無法滿足后續(xù)生產性能評估要求,需要進一步進行芯片填充才能預測胚胎價值。體外2細胞組和8細胞組的檢出率也均低于90%,且8細胞組檢出率顯著低于其余各組(P<0.05)。進一步對各組擴增后DNA量與芯片檢出率進行相關分析發(fā)現,兩者相關度為0.709 5(圖5),存在較高的相關性。綜上,起始DNA含量是影響DNA擴增和芯片檢出率的關鍵,起始DNA含量越高(切割取樣量越大),樣品全基因組擴增效率和芯片檢出率越高。

    圖4 不同組芯片檢出率的差異

    圖5 DNA量與芯片檢出率的關系圖

    2.5 不同組染色體片段缺失情況

    為分析各組SNP缺失情況,尤其是檢出率低于90%的各組缺失情況,進一步對各組30對染色體片段缺失情況進行量化統(tǒng)計。2細胞和8細胞在實際生產中不會用于胚胎取樣,故本節(jié)重點分析體內、外滋養(yǎng)層組的染色體片段缺失情況。此外,為更準確地分析體內、外滋養(yǎng)層組染色體片段缺失情況,試驗引入荷斯坦奶牛尾根血芯片數據(檢出率均大于90%)作為試驗對照組。對比分析1/2體內胚組、體內、外滋養(yǎng)層組與血液組在染色體片段缺失上的差異。

    片段缺失標準參考Turner 等[18]的方法,以至少3個連續(xù)SNPs缺失認為染色體片段缺失,統(tǒng)計各組染色體片段缺失情況。結果如表2所示,血液組染色體片段缺失量最低(34),體內滋養(yǎng)層組最高(5 982),與血液組相比,1/2體內胚組染色體片段缺失量增加了8.9倍,而與1/2體內胚組相比,體內滋養(yǎng)層組染色體片段缺失量增加了16.9倍,體外滋養(yǎng)層組染色體片段缺失量增加了14.5倍。這說明滋養(yǎng)層取樣會帶來較大量的染色體片段缺失,而這一缺失是否會影響后續(xù)生產性能測定需要進一步加大試驗研究量。

    表2 不同組染色體片段缺失情況

    為進一步篩選各組在全基因組擴增前染色體缺失情況,同時減小全基因擴增隨機性導致的假片段缺失,試驗進一步對染色體缺失片段所包含的連續(xù)SNPs數量進行了擴大統(tǒng)計,結果如表3所示,當連續(xù)缺失SNP≥7個時,1/2體內胚組不再存在片段缺失,故將染色體片段缺失所包含的SNPs數量擴大至7個用于后續(xù)試驗分析。

    表3 各組連續(xù)缺失7個及以上SNPs的片段數量

    2.6 基因篩選、GO注釋和KEGG功能富集分析

    進一步分析了體外和體內滋養(yǎng)層組連續(xù)缺失≥7個SNPs的染色體片段,分別在體外和體內滋養(yǎng)層組發(fā)現了188和388個缺失片段。隨后用ensembl數據庫(asia.ensembl.org)中的biomart對篩選到的缺失片段進行篩選,結果顯示在體外滋養(yǎng)層組發(fā)現46個基因,體內滋養(yǎng)層組發(fā)現48個基因。為了確定這些基因是否影響胚胎發(fā)育,對篩選到的基因進行GO和KEGG功能富集分析。GO富集分析結果顯示,在體外和體內滋養(yǎng)層組分別獲得340個和306個GO條目,其中排名前20的如圖6所示(按P值排序)。通過KEGG富集分析,在體外滋養(yǎng)層組發(fā)現了17條顯著的通路,在體內滋養(yǎng)層組發(fā)現了13條顯著富集的通路。圖7顯示了TOP20的通路。

    A.體內滋養(yǎng)層組;B.體外滋養(yǎng)層組

    A.體內滋養(yǎng)層組;B.體外滋養(yǎng)層組

    2.7 芯片填充準確性及育種值估計

    本研究填充準確性是按等位基因一致性比率計算的,也就是正確填充基因型所占百分比,由R2表示。填充準確性分布可見圖8,可以看出64 958個SNP填充位點中52 334個SNP填充位點的R2在0.99~1之間。本次填充的準確性為91%。填充后育種值見表4,表中可以看出體內滋養(yǎng)層組產奶量估計育種值最大值為203.94,最小值為61.69,平均值為127.68;乳脂量估計育種值最大值為3.36,最小值為0.88,平均值為2.39;乳蛋白量估計育種值最大值為1.13,最小值為-2.68,平均值為-0.84。體外滋養(yǎng)層組產奶量估計育種值最大值為55.59,最小值為-55.58,平均值為-6.07;乳脂量估計育種值最大值為9.04,最小值為-4.61,平均值為2.14;乳蛋白量估計育種值最大值為5.40,最小值為-3.75,平均值為0.47。從平均產奶量估計育種值看體內滋養(yǎng)層組遠高于體外滋養(yǎng)層組,可能是因為體內胚胎在生產時選擇的是產奶量較高的母本,而體外胚胎所選擇的屠宰場卵巢并不知道生產性能,而且生產性能差的更容易被屠宰,這也說明了為什么體外滋養(yǎng)層組的產奶量普遍偏低且有正有負。而1/2體內胚組的母本為試驗用牛且生產性能不高,所以獲得的3枚胚胎產奶量、乳脂量、乳蛋白量都偏低。

    圖8 填充準確性分布圖

    表4 不同組估計育種值

    3 討 論

    自2008年啟動奶牛群體遺傳改良計劃以來,我國奶牛群遺傳質量明顯提升,DHI測定群成年母牛平均單產水平逼近10噸。在新一輪的種業(yè)振興大背景下,良種是現代奶業(yè)生產和發(fā)展的基礎,而引進或者自產胚胎移植是培育種公牛和快速擴充生產群非常有效的技術手段[19-20]。因此,胚胎的質量直接決定著核心種源自主培育和奶牛良種快速擴繁的進程和速度。當下,人類胚胎植入前檢測技術已經發(fā)展到了較高的水平,可以實現無創(chuàng)檢測,篩選優(yōu)質胚胎進行移植以保證受胎率和后代質量[16-17,21-22]。但是,牛胚胎遺傳價值或生產性能的測定還處于起步階段,相應的取樣技術、微量DNA擴增和芯片檢測等相關工作均未在國內開展。因此,本研究以體內、外胚胎為研究材料,探究利用胚胎微創(chuàng)取樣技術對胚胎進行生產性能測定的可行性,以期為進口遺傳物質監(jiān)管和胚胎質量鑒定提供一套可行的操作方案。

    近年來,隨著活體采卵-體外受精技術在我國乃至世界范圍的興起[23-24],體外胚胎生產正在成為牧場優(yōu)質種質資源擴繁的主要技術手段,但是體外胚胎受胎率和活犢率低仍然是當前產業(yè)發(fā)展面臨的主要問題[5, 8]。如果能在植入前對胚胎進行質量鑒定,在排除一些自身存在染色體問題的胚胎基礎上實現對胚胎生產性能的評估,那么將大大提高胚胎移植后的受胎率和犢牛的價值。因此,本研究通過胚胎切割技術對比分析了不同切割取樣大小對取樣后胚胎存活率、DNA擴增等方面的影響,結果表明利用胚胎切割儀切取少量滋養(yǎng)層細胞后,90%以上的胚胎可以繼續(xù)發(fā)育孵化,提示這種取樣方法適用于胚胎微創(chuàng)取樣,這與Balvís等[25]的結果一致。

    全基因組選擇方法是通過檢測芯片上SNP位點來評測個體的生產性能[26-27],為保證芯片SNP檢測的準確性,芯片上機檢測和數據分析前分別對DNA量和芯片SNP檢出率都有明確規(guī)定,DNA量大于1 000 ng才能上機檢測,芯片檢出率高于90%才能進行芯片數據分析。微創(chuàng)取樣的目的是盡可能減少對胚胎的損傷,但相應的問題就是細胞量少導致DNA初始含量過低,以至于無法應用常規(guī)的全基因組擴增方法進行擴增。為更均勻、準確的獲得少量細胞的基因組結果,試驗與中國農業(yè)大學高帥課題組合作,使用MALBAC技術對切取的少量TE進行擴增,MALBAC是線性放大[28],可以將獲取的極少量胚胎細胞中的DNA均勻擴增上百萬倍以滿足基因分析的需求[29]。MALBAC擴增結果表明,各組擴增后DNA含量和OD值均符合要求,這其中1/2體內胚組和體外2細胞組DNA擴增成功率最高,體內滋養(yǎng)層組、體外滋養(yǎng)層組和8細胞組擴增成功率呈依次下降趨勢。擴增后各組DNA量與擴增成功率趨勢大體一致,起始細胞量越少,擴增后DNA量也越少。這說明在相同的擴增條件下,全基因組擴增成功率可能與起始DNA含量正相關,切割獲取的起始DNA量越多,擴增成功率越高,與此同時取樣細胞量與MALBAC擴增后DNA量也呈正相關。DNA擴增成功率與取樣后胚胎存活率呈負相關,1/2體內胚組DNA擴增成功率和DNA量均最高,說明此擴增方法適用于牛的全基因組擴增,但是切取1/2胚胎對胚胎本身有較大損傷。為了減少切割造成的損傷,試驗選擇切取體內、外胚胎少量的滋養(yǎng)層細胞進行全基因組擴增,從DNA擴增量水平分析,兩組擴增結果均符合芯片檢測要求。

    芯片檢出率是芯片數據分析質控的另外一個關鍵環(huán)節(jié)[30-31],以100K芯片為例,當芯片檢出率大于90%時,芯片檢測數據可以進行后續(xù)的生產性能預測??紤]到MALBAC技術的特殊性,試驗在胚胎樣品之外又引入了荷斯坦奶牛全血樣本的芯片數據作為陽性對照。與全血數據相比,胚胎各組芯片檢出率只有1/2體內胚組無顯著性差異,且檢出率大于90%,其余各組均顯著下降且檢出率均低于90%,無法用于后續(xù)生產性能測定。基于MALBAC擴增的原理,推測這可能是因為起始細胞量太少導致的,在低起始量的情況下[29],擴增容易出現偏差和非特異性擴增。因此使用現有擴增條件,在保證胚胎正常發(fā)育的前提下,需要增加取樣量。后續(xù)在取樣技術沒有突破之前,MALBAC技術的迭代尤其是針對牛的迭代更為重要。

    試驗進一步對檢出率低于90%各組SNP缺失情況進行統(tǒng)計分析,結果顯示體內、外滋養(yǎng)層組SNP缺失量比1/2體內胚組均高出了15倍以上,這說明微量取樣后通過MALBAC擴增會導致更多的SNP缺失,而這些缺失的SNP是因為擴增導致還是因為本身發(fā)育所致需要進一步分析。為減少因全基因組擴增隨機性導致的假片段缺失,試驗擴大了染色體片段缺失所包含的連續(xù)SNPs數量,以SNP連續(xù)缺失7個(含7個)以上作為篩選標準,并對篩選到的缺失片段進行染色體定位分析和富集分析。染色體定位分析結果發(fā)現,各組染色體發(fā)生片段缺失的情況均不相同,其中chr1在兩個試驗組中均片段缺失量最多,這說明胚胎發(fā)育過程中可能存在真實的染色體片段缺失情況,進而導致了chr1在兩個試驗組中染色體片段缺失量明顯上升。

    胚胎工程技術的快速發(fā)展和廣泛應用,極大提高了牧場中優(yōu)良個體的繁殖力[32],但體外生產的胚胎常出現發(fā)育阻滯、胚胎質量差等問題[33-34],Raudsepp和Chowdhary[15]研究發(fā)現,染色體異常與胚胎質量、胚胎移植后妊娠率以及胎兒發(fā)育直接相關。染色體片段缺失是染色體異常較為常見的情況之一,缺失可能發(fā)生于任何一條染色體的任何位置,其發(fā)生原因情況較多,尤其在體外胚胎生產過程中,培養(yǎng)液、培養(yǎng)環(huán)境、人為操作等均可能對其造成影響。而且細胞骨架與細胞分裂時紡錘體形成、染色體運動、胞質分裂等事件密切相關[35-38]。因此,本研究比較了體內、外滋養(yǎng)層組的染色體缺失情況,并對缺失片段中包含的基因進行功能富集分析。結果發(fā)現,體外滋養(yǎng)層組排名前5的條目中有3個條目intermediate filament(GO:0005882)、keratin filament(GO:0045095)、intermediate filament cytoskeleton(GO:0045111)均與微絲蛋白和細胞骨架相關,共包括MARK2、SBNO2、GJA1等15個相關的基因(圖9)。其中MARK2(microtubule affinity regulating kinase 2)編碼的有絲分裂著絲粒相關蛋白能夠調控有絲分裂微管的形成和長度[39],同時在間期和有絲分裂過程中,MARK2還能調控肌動蛋白和微管細胞骨架的變化,從而維持細胞的正常分裂[40]。值得注意的是,在體外滋養(yǎng)層組GO顯著富集排名前30的條目中發(fā)還現十余個與細胞分化相關的條目,如osteoclast differentiation(GO:0030316)、positive regulation of cell differentiation(GO:0045597)等。眾所周知,在胚胎發(fā)育過程中,調控細胞分化的任何一個環(huán)節(jié)出現問題,都有可能導致胚胎質量降低甚至直接導致胚胎發(fā)育異常[38]。本研究中,體外滋養(yǎng)層組染色體缺失片段中涉及到多個基因(如MYOD1、PRXL2A、FOXO3等)均可參與細胞分化(圖9)。此外,體外滋養(yǎng)層組顯著富集的KEGG通路中包含多條參與調控細胞分化的信號通路,如Hedgehog signaling pathway(bta04340)、cAMP signaling pathway(bta04024)、MAPK signaling pathway(bta04010)等。而體內滋養(yǎng)層組中發(fā)現的則更多的是調控細胞內離子通道等相關的通路,如p53 signaling pathway(bta04115)、Hippo signaling pathway(bta04390)、AMPK signaling pathway(bta04152)。這說明KEGG的富集結果與GO富集結果是相符的。鑒于在本研究中體外滋養(yǎng)層組的缺失基因顯著富集到多個與細胞骨架和細胞分化相關的條目,推測體外胚質量差可能是由于胚胎在體外培養(yǎng)的過程中受不利因素影響導致調控細胞骨架相關的基因異常表達,從而直接導致染色體出現片段缺失、基因拷貝數異常等現象,進而影響胚胎發(fā)育過程中細胞分化的有序進行,最終影響胚胎的正常發(fā)育。

    圖9 體外滋養(yǎng)層組GO分析結果示意圖

    由于體內滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組檢出率均小于90%,所以本研究對各組芯片數據進行了芯片填充,并估計其育種值。結果顯示,本研究使用芯片包含95 257個SNPs位點,共填充64 958個SNPs位點,其中填充準確性在0.99~1之間的SNP位點有52 334 個。同時計算本次填充的準確性為91%,說明芯片填充效果較好,可用于育種值估計。同時,芯片填充后育種值估計能夠很好的反映各組估計育種值的差異,以1/2體內胚組為例,樣本PTP57001的產奶量、乳脂量和乳蛋白量的育種值都是最高的,從而可以判定胚胎PTP57001生產性能良好,可以用來移植。此外,從產奶量來看,體外滋養(yǎng)層組低于體內滋養(yǎng)層組,并且組內差異大,這可能是因為體內胚胎生產過程中所選的父母本通常生產性能良好,而屠宰場的母本一般生產性能低且水平不同,進而導致估計育種值低。

    4 結 論

    本研究結果表明,利用胚胎切割、單細胞基因組擴增和基因組芯片可在微創(chuàng)的前提下,實現對植入前早期胚胎染色體質量和生產性能的評估;此外,通過對比分析體內、外胚胎染色體片段缺失結果發(fā)現,胚胎體外發(fā)育過程中細胞骨架等基因異常表達可能是導致體外胚胎質量差的原因之一。

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