紙芯片法快速檢測(cè)ρ(黃酮類化合物)*

張 劍,鄭志鴻,張 博,張寧寧,唐新萍,李一冰,夏敏珠,劉春葉

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物,具有多種生物活性,如抗炎、減壓、保肝、降脂、抗氧化、抗腫瘤等[1-2]。因此,黃酮類物質(zhì)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)方法近年來(lái)受到研究人員的廣泛關(guān)注。

黃酮類化合物的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法、紅外光譜法、熒光分析法、毛細(xì)管電泳法等。這些方法準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好,但均需要大型分析儀器,對(duì)設(shè)備和操作要求較高,試劑消耗量大,分析時(shí)間長(zhǎng),不能及時(shí)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[3-5]。微流控紙芯片技術(shù)是近幾十年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù),旨在把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、分離檢測(cè)、生物與化學(xué)反應(yīng)等基本操作集成到紙芯片上,用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過(guò)程,并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析[6-9]。該方法在紙芯片上實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣、檢測(cè)等全部實(shí)驗(yàn)流程,是一個(gè)集分析檢測(cè)于一體的微型實(shí)驗(yàn)分析平臺(tái)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比,微流控紙芯片無(wú)需依賴附加大型檢測(cè)儀器,操作簡(jiǎn)便、成本低廉、攜帶方便,能使檢測(cè)更經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、便捷[10-13]。目前,技術(shù)尚未用于黃酮類化合物的檢測(cè)分析。作者旨在建立一種基于紙芯片的黃酮類化合物快速測(cè)定方法,為中藥成分含量測(cè)定提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

蘆丁:純度≥98.0%,上海源葉生物科技有限公司;甲醇、氫氧化鈉:分析純,天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;硝酸鋁、亞硝酸鈉:分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑廠;蒺藜葉和果實(shí):均來(lái)源于陜西省陜北地區(qū),經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院張寒教授鑒定。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):UV-6000T,上海元析儀器有限公司;十萬(wàn)分之一電子天平:Precise Gravimetrics AG Dietikon,Switzerlang;噴臘打印機(jī):Xerox Phaser8570,美國(guó)富士施樂(lè)集團(tuán);手機(jī):iphone7,蘋(píng)果公司;不同規(guī)格移液器:大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司;紙芯片:Whatman No.1,濾紙實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中相鄰的羰基與羥基,如5-羥基和4-羰基、3-羥基和4-羰基、4′-羥基和5′-羥基,可與Al3＋在堿性條件下生成紅色絡(luò)合物。以蘆丁為對(duì)照品,分析待測(cè)物質(zhì)總黃酮的含量[14]。將顯色劑鋪滿紙芯片,再將待測(cè)物溶液滴加到紙芯片的中心,兩者在紙芯片上發(fā)生顯色反應(yīng),通過(guò)手機(jī)拍照記錄結(jié)果,用PhSp_CS2軟件分析圖片色度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

精密移取50μLρ(蘆丁)＝0.294 0 mg/m L標(biāo)準(zhǔn)溶 液 于0.5 m L離心管中,加 入5.0μLw(Na NO2)＝4%溶液,靜置反應(yīng)6 min,再加入5.0μLw[Al(NO3)3]＝10%溶液;靜置反應(yīng)6 min。分別精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液7.6、7.8、8.0、8.2、8.4μL,依次同4.0μLw(NaOH)＝10%溶液在紙芯片上進(jìn)行反應(yīng),考察蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣量對(duì)顯色結(jié)果的影響,見(jiàn)圖1。

由圖1可知,上樣量為7.8μL時(shí),液體可完全鋪滿紙芯片,呈規(guī)則圓形且顯色均勻,上樣量為8.0、8.2和8.4μL時(shí)溶液有部分溢出,故選取7.8 μL為最佳蘆丁溶液上樣量。

考察顯色時(shí)間對(duì)顯色強(qiáng)度的影響,見(jiàn)圖2。

圖1 蘆丁溶液上樣量對(duì)顯色強(qiáng)度的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色強(qiáng)度的影響

由圖2可知,顯色3 min和4 min時(shí)所得顏色鋪展不均勻,出現(xiàn)顏色堆積現(xiàn)象從而影響分析結(jié)果。

反應(yīng)時(shí)間對(duì)顏色強(qiáng)度最大值(PhSp_CS2軟件分析RGB通道即紅、綠、藍(lán)三疊加通道m(xù)ean值,簡(jiǎn)稱RGB值)的影響見(jiàn)表1。

表1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)RGB值的影響

由表1可知,顯色2 min時(shí)顏色最均勻且RGB值最大,因此選擇顯色2 min。

w(NaOH)、w[Al(NO3)3]和w(Na NO2)均會(huì)對(duì)顯色強(qiáng)度產(chǎn)生影響,見(jiàn)表2~表4。

表2 w(NaOH)對(duì)RGB值的影響

表3 w[AI(NO3)3]對(duì)RGB值的影響

表4 w(NaNO2)對(duì)RGB值的影響

由表2~表4可知,NaNO2溶液和Al(NO3)3溶液體積為5.0μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%和10%,NaOH體積為4.0μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)RGB值最大;NaNO2和NaOH體積分別為5.0μL和4.0μL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%和10%,Al(NO3)3體積為5.0μL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)RGB值最大;NaOH和Al(NO3)3溶液體積分別為4.0μL和5.0μL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,NaNO2體積為5.0μL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)RGB值最大。因此選擇w(NaOH)＝10%、w[Al(NO3)3]＝10%,和w(NaNO2)＝4%進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以RGB值對(duì)ρ(蘆丁)進(jìn)行線性擬合見(jiàn)圖3。

圖3 RGB值對(duì)ρ(蘆丁)線性擬合

配制ρ(蘆丁)＝0.058 8、0.117 6、0.176 4、0.235 2、0.294 0 mg/m L溶液,精密移取50μL至離心管中,加入5.0μLw(NaNO2)＝4%溶液,反應(yīng)6 min,再加入5.0μLw[Al(NO3)3]＝10%溶液,反應(yīng)6 min。精密移取4.0μLw(NaOH)＝10%溶液滴于紙芯片中心,待溶液鋪滿紙芯片后,取上述蘆丁溶液7.8μL滴加到紙芯片中心位置,反應(yīng)2 min后用手機(jī)拍照,PhSp_CS2進(jìn)行分析,得出RGB值。

由圖3可 知,ρ(蘆 丁)＝0.058 80~0.294 0 mg/m L,線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

取用0.176 4 mg/m L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按照最佳檢測(cè)條件在紙芯片上與Na NO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系反應(yīng),手機(jī)拍照,用PhSp_CS2軟件分析蘆丁與空白的RGB值,見(jiàn)表5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程換算檢測(cè)濃度,得紙芯片法日內(nèi)重復(fù)性為1.44%(n＝6);以上步驟重復(fù)操作6 d,得日間重復(fù)性為1.71%;日內(nèi)和日間重復(fù)性結(jié)果均小于5%,說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

表5 紙芯片方法的日內(nèi)重復(fù)性和日間重復(fù)性

取用0.235 2 mg/m L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按照最佳實(shí)驗(yàn)條件在紙芯片上與NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯 色 體 系 反 應(yīng),分 別 于2、4、6、8、10、12 min拍照,得到6組圖像,提取6組圖像的RGB值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程得到檢測(cè)質(zhì)量濃度,見(jiàn)表6。

表6 紙芯片方法的穩(wěn)定性

由表6可知,紙芯片檢測(cè)方法在12 min內(nèi)保持穩(wěn)定,RSD值為0.76%,穩(wěn)定性良好。

2.4 蒺藜樣品中總黃酮含量測(cè)定

蒺藜果實(shí)和葉中黃酮提取方法參照文獻(xiàn)[15],取干燥的刺蒺藜果實(shí)和葉細(xì)粉各3 g,倒入250 m L圓底燒瓶中,加60 m L體積分?jǐn)?shù)80%乙醇,于超聲儀上加熱回流并超聲40 min,抽濾2次,濾液轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶,用乙醇定容。采用紙芯片法,測(cè)得刺蒺藜果實(shí)和葉子提取液中ρ(黃酮)＝28.89、109.5μg/m L。在最大吸收波長(zhǎng)為506 nm時(shí)采用分光光度法測(cè)得上述提取液ρ(黃酮)＝28.71、108.7μg/m L。2種方法檢測(cè)結(jié)果符合較好,相對(duì)誤差分別為0.62%和0.76%。

取3份刺蒺藜果實(shí)提取液,分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),見(jiàn)表7。

由表7可知,提取液的加標(biāo)回收率分別為97.93%、98.69%、101.75%,均 在95.00%~105.00%,說(shuō)明紙芯片檢測(cè)法加標(biāo)回收率良好。

表7 紙芯片檢測(cè)法的加標(biāo)回收率結(jié)果

3 結(jié) 論

作者建立了一種基于紙芯片技術(shù)快速檢測(cè)黃酮類化合物的新方法。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,無(wú)需借助分光光度計(jì)等大型儀器,即可對(duì)未知樣品中黃酮類化合物含量進(jìn)行定量檢測(cè),為含有黃酮物質(zhì)的藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù),在黃酮類化合物的定量檢測(cè)方法學(xué)領(lǐng)域具有十分良好的發(fā)展前景。