聚偏氟乙烯（PVDF）膜的漆酶固定化及其應(yīng)用研究進(jìn)展

周東銳，張獻(xiàn)坤，張佳琦

（沈陽建筑大學(xué)，遼寧 沈陽 110168）

漆酶作為一種常見的氧化還原酶，由于其易獲取、催化效率高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于污水處理中，目前國(guó)內(nèi)漆酶的應(yīng)用主要集中在含酚廢水處理、染料廢水脫色、降解有毒物質(zhì)等方面。特別是其反應(yīng)產(chǎn)物是水，不產(chǎn)生二次污染，因此其本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素。

1 漆酶簡(jiǎn)介

漆酶，又稱對(duì)苯二酚氧化酶，屬于多銅氧化酶類，具有高效的氧化性和穩(wěn)定性。漆酶來源廣泛，主要分布于動(dòng)物、植物、微生物中，大致分為漆樹漆酶和真菌漆酶兩類。真菌漆酶屬于胞外蛋白，可以通過生物工程、微生物培養(yǎng)等方式大量獲取，因此成為眾多學(xué)者的研究對(duì)象。漆樹漆酶又稱為生漆，主要從漆樹上獲取，雖然我國(guó)生漆資源豐富，但目前對(duì)于漆樹漆酶仍缺乏深入的研究[1-2]。

漆酶氧化還原電位各不相同，可以氧化多種化合物，甚至包括二價(jià)錳以及多種脂在內(nèi)[3-4]。漆酶氧化還原電位主要受相對(duì)分子質(zhì)量和銅離子周圍氨基酸的空間位阻的影響，相對(duì)分子質(zhì)量或銅離子周圍氨基酸的空間位阻越大，漆酶的氧化還原電位越高。漆酶對(duì)底物的氧化機(jī)制大致可分為3種：漆酶將底物直接氧化成激發(fā)態(tài)分子；漆酶利用介導(dǎo)介質(zhì)的激發(fā)態(tài)氧化氧化還原電位較高的底物；漆酶通過加入黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔酶促進(jìn)催化底物。雖然漆酶的氧化范圍廣，但游離態(tài)漆酶的熱和酸堿穩(wěn)定性較差，且難以重復(fù)使用，因此，它的應(yīng)用價(jià)值有限。將漆酶固定化不僅可以有效地解決這些問題，還可以解決游離態(tài)漆酶漏失的問題，減少外部環(huán)境對(duì)漆酶的影響，擴(kuò)大其應(yīng)用前景。

2 漆酶固定化技術(shù)

對(duì)幾種固定化方法的特點(diǎn)及常用載體進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表1所示。

表1 固定化技術(shù)常用方法

目前漆酶的固定化技術(shù)有共價(jià)結(jié)合法、吸附法、交聯(lián)法、包埋法等[5-8]，每種技術(shù)都離不開載體，因此，載體的選擇顯得尤為重要，直接影響了漆酶的固定化效果和利用率[9-12]。研究者們通過對(duì)比不同的載體材料進(jìn)行固定化研究，對(duì)酶固定化技術(shù)不斷創(chuàng)新。

3 PVDF膜表面的漆酶固定化方法研究

高分子膜材料是材料領(lǐng)域的后起之秀，具有選擇透過性和結(jié)構(gòu)伸縮性，在催化過程中實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離[13]。PVDF膜更是由于其較高的機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性成為理想的固定化載體材料。但是目前在漆酶的膜固定化方面仍缺少詳盡的介紹。按漆酶的加入時(shí)間可分為成膜前固定和成膜后固定兩種，但是大部分方法都需要對(duì)膜載體進(jìn)行改性處理，通過物理、化學(xué)等手段引入大量易于漆酶結(jié)合的官能團(tuán)，提高漆酶的固定化效果[14-15]。

3.1 成膜前漆酶固定化方法

成膜前固定漆酶就是將漆酶與鑄膜液混合均勻，然后利用相轉(zhuǎn)化法制備多孔膜，從而將漆酶包埋于聚合物基質(zhì)中形成納米顆粒，這是唯一一種不需要對(duì)膜表面進(jìn)行修飾的方法，而且固定化后的漆酶不易脫落，因此，可大大減少成本。劉瑞紅[16]等采用靜電紡絲技術(shù)，根據(jù)自制的裝置在生成 PVDF中空纖維膜的同時(shí)原位固定漆酶。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高達(dá)81.3%的漆酶成功固定在膜片表面，且固定化漆酶可保持游離態(tài)漆酶80%的活性，在經(jīng)過7天儲(chǔ)存后，其相對(duì)活性僅降低了18%。這有力地說明膜前固定在平衡酶活性和固定效率兩方面具有較大的優(yōu)勢(shì)。

但目前膜前固定存在兩大難點(diǎn)：第一，由于漆酶存活的最適溫度為 25～40 ℃，而制膜時(shí)鑄膜液溫度較高，通常高于漆酶最適合存活溫度，因此成膜前固定化漆酶，首先要解決漆酶在高溫下的存活和熱穩(wěn)定性問題；第二，漆酶溶液中存在水分，在與鑄膜液混合時(shí)易團(tuán)聚成團(tuán)，無法成膜。

現(xiàn)有的提高漆酶熱穩(wěn)定性的方法有蛋白質(zhì)工程、固定化、化學(xué)修飾、非共價(jià)修飾等。蛋白質(zhì)工程最常見的是基因誘變，但由于該技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，目前對(duì)這方面的研究相對(duì)較少，鑒于國(guó)內(nèi)目前已掌握了超過300個(gè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及其規(guī)律性認(rèn)識(shí)，蛋白質(zhì)工程因其可以定向地賦予酶蛋白學(xué)者們想要的功能，必將成為未來新的研究方向。由于其化學(xué)修飾是通過“切割”或“剪接”主鏈和“化學(xué)修飾”側(cè)鏈來改造蛋白質(zhì)分子，這種方法使酶結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，極大程度地改變了酶的性能。非共價(jià)修飾可有效地保護(hù)酶的天然構(gòu)象，使酶形成更準(zhǔn)確的催化部位，使其更易與底物相結(jié)合。張全升[17]等用二氧化硫脲和 L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)漆酶進(jìn)行改性處理，并在 72 ℃高溫下考察改性后的漆酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改性漆酶活性分別提高1.3%和56.9%。這種方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短，是所有改性方法中最溫和的一種，在酶改性領(lǐng)域應(yīng)用廣泛?；ㄐ惴騕18]等在二甲基亞砜和鄰苯二甲酸酐溶液中對(duì)漆酶進(jìn)行修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)修飾漆酶與天然漆酶光學(xué)特性相似，在 55 ℃時(shí)修飾漆酶的半衰期較天然漆酶長(zhǎng)，適宜的pH范圍從5.9～7.8變?yōu)?.5～8.4。這表明該種方法有效地提高了漆酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。何小勇[19-20]等采用添加多羥基化合物的方法提高漆酶熱穩(wěn)定性，分別考察肌醇、葡萄糖、甘露醇、甘油、山梨醇等 5種物質(zhì)在 20、30、40、50、60、70 ℃下漆酶的活力。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)在 20～60 ℃范圍內(nèi)漆酶活力均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但酶活均高于天然漆酶，且在 70 ℃高溫下改性漆酶的半衰期遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然漆酶。這表明多羥基化合物的加入可有效提高漆酶熱穩(wěn)定性，且對(duì)改性劑添加量的不斷優(yōu)化可進(jìn)一步加強(qiáng)漆酶活力。

綜上，提高漆酶的存活溫度和熱穩(wěn)定性是可行的，但目前尚沒有將其應(yīng)用到漆酶的膜固定化中，未來可通過以上幾種方法對(duì)漆酶進(jìn)行改性處理，或者可以將在高溫下存活下的漆酶進(jìn)行富集培養(yǎng)，提高漆酶在高溫下的存活率，然后將改性后的漆酶加入到N,N-二甲基酰胺（DMF）溶液中，攪拌均勻后混入鑄膜液中，調(diào)整溫度后進(jìn)行刮膜處理，從而實(shí)現(xiàn)在成膜前固定漆酶。

3.2 成膜后漆酶固定化方法

成膜后固定漆酶就基于酶固定化的幾種方法（吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法）將漆酶固定在載體表面。相比于成膜前固定的方法，在成膜后對(duì)漆酶進(jìn)行固定是目前的研究重點(diǎn)。

吸附法可以將制備好的PVDF膜浸泡在以一定比例配置的漆酶溶液中，利用漆酶與膜載體間的氫鍵、疏水鍵、離子鍵合力、靜電作用將漆酶固定在膜上。但這種作用力通常較小，因此需要引入不同的添加劑對(duì)膜片進(jìn)行改性處理。通過對(duì)各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)的調(diào)整亦可將固定效果達(dá)到最佳。FAN[21]等采用聚多巴胺（PDA）涂覆PVDF膜片，然后在PDA涂層表面接枝聚乙烯亞胺（PEI），使其表面帶正電。采用正向過濾的方式利用靜電作用吸附漆酶。測(cè)試發(fā)現(xiàn)漆酶固定化純度高達(dá) 92.2%，漆酶表達(dá)活性僅為 19.6%左右，這表明漆酶固定效率更高，但同時(shí)使酶結(jié)構(gòu)的靈活性受限，因此酶表現(xiàn)活力較低。在4 ℃、pH為4.5的條件下，經(jīng)儲(chǔ)存45天后漆酶活性僅損失了13%，而游離態(tài)漆酶則幾乎完全喪失活性。這表明固定化使漆酶的穩(wěn)定性得到了較大提高。

利用交聯(lián)法將漆酶固定在膜上，通常需要添加帶有雙官能團(tuán)或多官能團(tuán)的交聯(lián)劑（例如戊二醛、二羧酸），但是這種方法獲得的交聯(lián)結(jié)構(gòu)機(jī)械性能差，因此常常與其他固定方法聯(lián)合使用。何洋[22]等采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）法制備聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PVDF-g-PGMA）共聚物，使膜表面引入可固定漆酶的官能團(tuán)，利用共價(jià)結(jié)合的方法固定漆酶，最后利用聚醚酰亞胺（PEI）交聯(lián)漆酶固定化 PVDF-g-PGMA膜。經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)未經(jīng)交聯(lián)的漆酶固定化膜在8 h的降解效率為71.3%，而交聯(lián)后的漆酶表現(xiàn)出更佳的降解效率，在8 h的降解效率可高達(dá)93.5%。在經(jīng)過4次循環(huán)使用后未經(jīng)交聯(lián)與交聯(lián)后的漆酶均能保持高于90%的活性，但當(dāng)重復(fù)使用10次時(shí)，交聯(lián)后的漆酶可保留高于80%的活性，而未經(jīng)交聯(lián)的漆酶僅剩65%的活性。

包埋法就是將配好的漆酶溶液濾過聚合物膜，在過濾過程中實(shí)現(xiàn)漆酶的固定。這種方法通常不需要添加交聯(lián)劑，對(duì)酶結(jié)構(gòu)影響最小，但較少應(yīng)用于PVDF膜上。近五年來尚未有基于PVDF膜的包埋法固定漆酶的論述。羅建泉[23]等基于“膜污染思維”采用逆向過濾的方式將漆酶包埋固定，該固定化方法較為完善，膜載體的選擇主要集中在纖維素超濾膜和聚酰胺納濾膜等方面，尚未應(yīng)用于PVDF膜上，但同時(shí)也為后期PVDF膜的酶固定方法研究提供一定的理論依據(jù)。

經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同類型的酶固定化方法各有千秋，目前還不能明確哪種就是最佳的固定化方法。這需要根據(jù)漆酶種類、聚合膜的性能等因素來具體分析。上述幾種方法雖然都不同程度地對(duì)酶活性造成了影響。但可以肯定的是，大部分固定化技術(shù)都可以有效地提高漆酶的穩(wěn)定性。如何在保證漆酶活性的同時(shí)提高漆酶的穩(wěn)定性將會(huì)是酶的膜固定化領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

4 漆酶固定化的PVDF膜在水處理中的應(yīng)用

酶固定技術(shù)可大幅度延長(zhǎng)漆酶使用壽命，提高漆酶的耐受性和穩(wěn)定性，在有毒廢水中亦可保持較高活性，在多次處理后可通過化學(xué)手段進(jìn)行酶清洗，實(shí)現(xiàn)酶的重裝載。針對(duì)不同污水應(yīng)采用不同的載體及固定化方法，該機(jī)制可有效地降低成本并減少廢水中有毒組分對(duì)酶活性的影響。在酶催化氧化過程中底物通常被氧化成自由基或活性中間體，并在自偶聯(lián)反應(yīng)下形成二聚體、三聚體，甚至是高聚體[24]，進(jìn)而通過簡(jiǎn)單的純化過濾技術(shù)去除。該技術(shù)以高效、無二次污染、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)在污水處理領(lǐng)域具有較好的發(fā)展前景。

4.1 在含酚廢水處理中的應(yīng)用

酚類化合物污染范圍極廣，對(duì)人體、農(nóng)作物、水生物等危害極大。目前，含酚廢水的處理方法大致分為生物降解、光催化、電催化等3種。酶固定化技術(shù)作為一種新型的微生物技術(shù)[25-26]在污水處理中備受矚目。微生物法與傳統(tǒng)的物理化學(xué)法相比具有催化效率高、簡(jiǎn)單易控制、不會(huì)造成二次污染等優(yōu)勢(shì)。而固定化漆酶由于生物密集性高，相比游離態(tài)漆酶來說，處理效果更佳。

XU[27]等采用共價(jià)鍵合法將漆酶固定到納米銅改性的PVDF膜上，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在pH等于4時(shí)，漆酶的固定化效率最佳，可達(dá)588 mg·g-1，這種生物催化膜對(duì) 2,4,6-三氯苯酚的去除率可達(dá) 95.4%。究其原因，可能是漆酶活性中心的電子傳遞發(fā)生氧化還原反應(yīng)從而將有機(jī)污染物降解成自由基，納米銅的加入加快了氧化還原反應(yīng)速率，從而提高了有機(jī)污染物降解效率。

景偉侯[28]等開發(fā)了一種新型的低溫水熱（LTH）溶膠-凝膠涂層技術(shù)，在PVDF膜表面形成薄而堅(jiān)固的二氧化鈦（TIO2）涂層。隨后將固定有TIO2的膜片浸泡在配好的漆酶溶液中，使漆酶共價(jià)固定在TIO2上。對(duì)該制備好的生物催化膜進(jìn)行BPA（雙酚A）去除率檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未包覆 TIO2的生物催化膜對(duì)BPA去除率為64%左右，在經(jīng)過3層包覆后去除率可高達(dá)85%以上。且經(jīng)包覆TIO2后的膜在4次降解循環(huán)中監(jiān)測(cè)跨膜壓力（TMP）沒有明顯增加，表明經(jīng) TIO2包覆的新型生物催化膜對(duì)染料廢水具有更高降解效率和良好的防污性能。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)TIO2上存在羥基，使漆酶更加牢固地固定在膜片表面，較高的載酶率與酶活性使該膜片表現(xiàn)出更高的BPA降解效率。

4.2 在微量有機(jī)污染物去除中的應(yīng)用

微量有機(jī)污染物是指含量少、有毒、難降解的有機(jī)污染物。這種污染物來自于地面徑流、生活污水以及工業(yè)廢水的排放，主要分為人工合成有機(jī)物（SOC）和天然有機(jī)物（NOM）兩類，對(duì)人體健康有較大的威脅[29-30]?，F(xiàn)有的去除辦法去除率均較低，難以滿足排放標(biāo)準(zhǔn)。

MASJOUDI[31]等采用相位反轉(zhuǎn)法制備了一種PVDF/MWCNT（多壁碳納米管）納米復(fù)合膜，并利用化學(xué)吸附法將漆酶固定。MWCNTs中羧基的存在有效提高了漆酶固定化效率，但漆酶活性有所降低，這可能與固定化過程中漆酶的變性有關(guān)。在兩種有機(jī)農(nóng)藥（卡馬西平和雙氯芬酸）的去除實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在4 h內(nèi)去除27%馬西平，48 h內(nèi)去除95%雙氯芬酸。這表明基于PVDF/MWCNT膜固定的漆酶是一種高效的污水處理催化劑。

5 結(jié) 論

近年來，酶固定化技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為環(huán)境治理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外的研究學(xué)者開發(fā)出一系列的新型酶固定技術(shù)，極具應(yīng)用前景。與此同時(shí)，膜分離技術(shù)作為一個(gè)古老但新興的技術(shù)，經(jīng)過不斷的創(chuàng)新發(fā)展，已經(jīng)被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。膜材料由于其結(jié)構(gòu)的可調(diào)性和較高的機(jī)械性能，成為備受關(guān)注的固定化載體材料。二者的有效結(jié)合在環(huán)境治理領(lǐng)域有著深遠(yuǎn)的意義。但該項(xiàng)技術(shù)仍存在較大發(fā)展空間：

1）目前對(duì)于膜前固定漆酶的研究尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，如何提高漆酶的存活溫度以及找到適宜的溶劑在不形成凝固浴的同時(shí)溶解漆酶將成為未來需攻克的難題，同時(shí)目前對(duì)加入添加劑的非共價(jià)修飾研究較為廣泛，但是蛋白質(zhì)工程的定向性與新穎性不可忽視，這將成為未來新的發(fā)展方向。

2）現(xiàn)有的幾種固定化方法各有利弊，且不同種類的漆酶，不同種類的膜材料，有著不同的固定化方法，這就需要基于大量的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，無法進(jìn)行普遍的總結(jié)和廣泛的應(yīng)用，或許在今后的研究中可以建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行收集對(duì)比，以便找出最佳固定方案。

3）在幾種酶固定化技術(shù)中都不可避免地造成酶活性的降低，如何在保證酶活性的同時(shí)提高漆酶穩(wěn)定性將會(huì)是未來創(chuàng)新酶固定技術(shù)的主要研究方向。

4）目前，漆酶直接固定在PVDF膜上在水處理方面應(yīng)用較少，但可以采用二次改性的方式對(duì)漆酶進(jìn)行固定，利用納米銅、TIO2、碳納米管等新型材料，通過更牢固的化學(xué)鍵合力將漆酶固定，從而提高降解效率。尤其是TIO2的光催化和自凈能力亦不容忽視，將其與聚偏乙烯膜結(jié)合或許可以制備出一種新型自清潔型生物催化膜。