涼山油橄欖主栽品種葉中營養(yǎng)物質(zhì)和酚類含量的季節(jié)性變化

王碧霞，杜小奇，鄧 燕，蔡曉梅，蘇光燦

(1.西華師范大學環(huán)境科學與工程學院，四川 南充 637002；2.涼山州中澤新技術開發(fā)有限責任公司，四川 西昌 615000)

油橄欖(Oleaeuropaea)為木樨科(Oleaceae)木樨欖屬(Olea)常綠喬木，原產(chǎn)于地中海沿岸[1]，是我國成功引種的優(yōu)良木本油料作物。經(jīng)過50多年的引種栽培，油橄欖對我國的生態(tài)環(huán)境表現(xiàn)出極大的適應性。四川涼山州是我國油橄欖種植的一級適生區(qū)，位于川西高原的安寧河平原腹地，其油橄欖產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，種植面積達3 330 多公頃[2]。但涼山的生態(tài)條件與油橄欖原產(chǎn)地不盡相同，主要呈現(xiàn)出夏雨冬干、干雨季分明的氣候特征[3]。盡管我國引種油橄欖已近60 a，關于油橄欖的深度研究仍集中在地中海原產(chǎn)地少數(shù)種植國家，對我國獨特氣候條件下油橄欖的相關研究比較欠缺。最近的研究發(fā)現(xiàn)，涼山油橄欖果實中的酚類化合物在果實生長早期增加迅速，然后隨著果實成熟開始減少。與來自地中海的油橄欖相比，該地區(qū)油橄欖果的水分含量較高，而不飽和脂肪酸和油含量相對較低[4]。油橄欖葉中含有大量的生物活性成分，具有多種藥理功效。據(jù)文獻記載，油橄欖葉在地中海地區(qū)用于民間醫(yī)藥歷史悠久，能直接用于治療發(fā)燒或瘧疾，可預防高血壓、高血脂、心血管和糖尿病等[5]。用油橄欖葉研制的茶含有維生素、氨基酸、多酚等活性成分，是國內(nèi)茶葉中的新興種類[6]。有證據(jù)表明，油橄欖葉的健康益處和潛在的藥理作用被歸因于其含有的酚類成分[5,7]。但油橄欖葉的酚類成分受品種、氣候條件、采樣時間、遺傳和地理來源等因素的顯著影響[8-12]。劉紅梅等[6]通過探究油橄欖茶中總多酚、總黃酮和橄欖苦苷的季節(jié)變化規(guī)律，確定油橄欖茶的最佳采收季節(jié)為春季。雖然涼山州的油橄欖葉已被研發(fā)成為保健茶，但關于不同品種油橄欖葉片中游離氨基酸、可溶性蛋白、可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)和酚類成分季節(jié)變化的相關研究鮮見報道。因此，本研究針對涼山州6個主栽油橄欖品種老葉和嫩葉中的主要營養(yǎng)物質(zhì)及7種酚類成分，運用高效液相色譜法(HPLC)定性和定量分析酚類成分在全年中的季節(jié)以及品種間變化，以期獲得涼山油橄欖葉的最佳采摘時間和最優(yōu)品種，為油橄欖葉在藥品、保健品和功能性食品等方面的高值化開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2020年1—12月每月中旬，在四川涼山西昌北河油橄欖基地(102.27°E，27.72°N)采集6個主栽品種葉片，供試油橄欖品種及其種源地分別為：‘卡林’(‘Kalinjot’),阿爾巴尼亞Albania;‘阿斯’(‘Ascolana tenera’)，阿爾巴尼亞Albania;‘皮削利’(‘Picholine’)，法國France;‘戈達爾’(‘Gordal’)，西班牙Spain;‘科拉蒂’(‘Coratina’)，意大利China;‘鄂植’(‘Ezhi’)，中國China。參考Ranalli 等[13]的方法，隨機選擇每個油橄欖品種12 a樹齡的樣樹3株，在樣樹不同方位和部位選取2年生枝條，并在同一枝條上采集嫩葉和老葉(嫩葉為枝條新梢頂端嫩綠色的第3～5片發(fā)育葉，老葉主要來自靠近枝的分支位置且呈墨綠色的半硬化葉)，另選擇‘張林’(‘Zhanglin’)品種的測定數(shù)據(jù)用于分析季節(jié)變化。老葉和嫩葉含水率分別為4.68%和5.51%，將采集的鮮葉用純水清洗，在45 ℃下干燥至質(zhì)量恒定，研磨成粉，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣樹葉片特征如圖 1 所示。

1.2 樣品制備及指標測定

1.2.1 酚類及營養(yǎng)物質(zhì)的提取

酚類成分提?。悍Q取1 g油橄欖葉片粉末，以30 mL乙醇(體積分數(shù)50%)為溶劑，在50 ℃的條件下240 W超聲提取20 min。超聲輔助提取后，在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液待用。

營養(yǎng)成分提?。悍Q取0.1 g 油橄欖葉粉加入5 mL水，80 ℃水浴15 min后，5 000 r/min條件下離心 5 min，取上清液用于檢測游離氨基酸和可溶性糖含量。然后，制備由 10 mmol/L NaCO3和 10 mmol/L NaHCO3組成的提取液，再配備考馬斯亮藍G-250(CBB)染色液，將10 g CBB溶于5 mL 乙醇(體積分數(shù)95%)和10 mL磷酸(體積分數(shù)85%)混合液后稀釋至100 mL；稱取0.25 g 油橄欖葉粉末加入5 mL提取液，超聲(240 W、20 ℃)輔助提取 15 min，8 000 r/min條件下離心 5 min，取0.1 mL上清液與0.5 mL CBB染色液反應5 min后用于可溶性蛋白含量的測定。

1.2.2 高效液相色譜(HPLC)分析

根據(jù)文獻[14-15]的方法，利用高效液相色譜(HPLC)法定性和定量分析油橄欖葉酚類化合物，7種酚類物質(zhì)分別為橄欖苦苷、蘆丁、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、槲皮素和芹菜素。使用Agilent 1260 HPLC與350 nm的UV-Vis DAD檢測器偶聯(lián)，C18反相柱(5.0 μm，150 mm×4.6 mm)，溫度30 ℃，流速0.8 mL/min，注射體積10 μL。橄欖苦苷的檢測波長為254 nm，分別以水(75%)和乙腈(25%)作為流動相A和流動相B。其余6種物質(zhì)檢測流動相包含0.2%磷酸水溶液(A)和乙腈(B)?？傔\行時間33 min，流動相梯度變化為：[A(84%)+ B(16%)]0～3 min；[A(70%)+ B(30%)]3～20 min；[A(60%)+ B(40%)]20～25 min；[A(84%)+ B(16%)]25～30 min；[A(84%)+B(16%)]30～33 min。酚類成分含量(mg/g)=[(C×V)/W]/1 000，其中：C為通過校準曲線計算的每種溶劑中分析物質(zhì)量濃度,mg/mL；V為樣液體積，mL；W為干物質(zhì)量，g；1 000為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 營養(yǎng)成分的測定

1)游離氨基酸含量(FAAC)采用茚三酮顯色法[15-16]測定。首先，取待測樣液0.5 mL置于5 mL離心管，加入1.5 mL茚三酮溶液和0.5 mL蒸餾水后，再加入0.05 mL抗壞血酸溶液；將混合液在100 ℃下水浴15 min，立即在冰浴冷卻20 min，并在570 nm處測量吸光度。根據(jù)標準曲線y=0.046 2x-0.004 9(R2=0.999 6)計算游離氨基酸含量(mg/g)。

2)可溶性糖含量(SSC)采用硫酸苯酚法[16-17]測定。取待測樣液100 μL置于5 mL離心管，加入100 μL苯酚溶液和500 μL濃硫酸，將混合物搖勻冷卻，室溫放置20 min后，于490 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線y=10.110 0x+0.060 8(R2=0.998 2)計算可溶性糖含量(mg/g)。

3)可溶性蛋白含量(SPC)采用考馬斯亮藍法測定[17-18]。取待測樣液0.1 mL加入0.5 mL CBB溶液(10 mg考馬斯亮藍G-250溶入5 mL 90%乙醇，再與10 mL 85%磷酸混合，最后用蒸餾水定容至100 mL)，將混合物搖勻放置2 min后于595 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線y=0.296 7x+0.099 2(R2=0.999 6)計算可溶性蛋白含量(mg/g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2020和SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理，不同季節(jié)和品種間的差異分析采用單因素方差分析方法(One-way ANOVA)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準偏差(mean±SD)，顯著性水平設定為α=0.05。所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 油橄欖葉中主要酚類成分的變化

2.1.1 油橄欖葉中的主要酚類成分

根據(jù)混合標準品的HPLC色譜圖(圖2A)，對比確定油橄欖葉中主要酚類成分為橄欖苦苷、蘆丁、木犀草素-4′-O-葡糖苷、芹菜素-7-O-葡糖苷酶、木犀草素、槲皮素和芹菜素，圖2B為典型月份樣品的HPLC圖。根據(jù)表1中的線性校準范圍、相應的校準方程、保留時間和回歸系數(shù)進行油橄欖葉中酚類化合物的定量分析。

表1 油橄欖葉中酚類成分分析

2.1.2 不同葉齡油橄欖葉中酚類成分的季節(jié)變化

油橄欖葉主要酚類成分中，橄欖苦苷和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷含量最高，其變化范圍分別為4.44～116.87和1.41～51.19 mg/g(表2)，嫩葉中的含量普遍高于老葉，并在春季(1—3月)呈穩(wěn)定的上升趨勢，均在2—3月達到較高值；而進入夏秋季節(jié)(4—9月)后，總體含量較低；到冬季(10—12月)時二者又逐漸回升，并在11月的嫩葉中達到較高值。

與橄欖苦苷和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷相比，油橄欖葉中蘆丁和芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量較低，其值變化在0.01～3.82和0.41～3.19 mg/g的范圍內(nèi)。與老葉相比，嫩葉中芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量在初春時較高，而在春末(3月)時較低，其相對較低的含量一直持續(xù)到夏秋季節(jié)，直至秋末(9月)開始比老葉的高，并在11月達到極值(3.19 mg/g)。但蘆丁含量在冬春季升高，并在1月呈現(xiàn)峰值，除老葉在2、6、12月中含量較高外，老葉和嫩葉在其余月份間含量均無顯著差異，并在夏秋季中含量水平同時降低，且波動幅度較小。在所測的主要酚類成分中，槲皮素和木犀草素含量最少，全年含量均低于0.20 mg/g，芹菜素更是低出檢測限(表2未列出)。木犀草素含量除5月以嫩葉的高于老葉的外，其余月份中葉齡間的差異不顯著,且該化合物在嫩葉中極不穩(wěn)定，于8月和12月中低于檢測限。槲皮素在春季時含量穩(wěn)定，且嫩葉中的含量普遍高于老葉，但在4—5月和9月未檢測到該化合物。由此可見，油橄欖葉中酚類成分受季節(jié)和葉齡的顯著影響，在不同月份呈現(xiàn)不同的變化趨勢，且大多數(shù)化合物含量在夏秋季節(jié)波動幅度大，而在冬春季節(jié)更穩(wěn)定，且嫩葉中含量相對更高。

表2 不同葉齡油橄欖葉中主要酚類成分含量的季節(jié)變化

2.1.3 不同品種油橄欖葉中主要酚類成分的變化

不同油橄欖品種兩個葉齡葉片中的酚類化合物含量有差異?！帧ⅰ赀_爾’和‘科拉蒂’3個品種嫩葉中的橄欖苦苷含量分別為94.38、85.56和65.40 mg/g，不僅高于老葉，也高于其他品種(表3)?！⑺埂廴~中芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量較高(2.58 mg/g)，老葉中較低(1.55 mg/g)，而蘆丁、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、木犀草素和槲皮素在葉齡間的差異不顯著，其總體水平也較低?！评佟廴~中芹菜素-7-O-葡萄糖苷(2.69 mg/g)、蘆丁(3.71 mg/g)和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷(52.57 mg/g)含量均較高，但木犀草素和槲皮素水平卻很低；‘皮削利’與之相反，嫩葉中木犀草素和槲皮素相對較高，老葉中橄欖苦苷水平極低。對于‘鄂植’品種嫩葉而言，木犀草素和槲皮素含量均較高，蘆丁含量也達到最大值(4.38 mg/g)。

表3 不同品種及葉齡油橄欖葉中主要酚類成分含量分析

在‘卡林’品種酚類成分的季節(jié)變化中，沒有檢測到芹菜素，但在‘鄂植’品種葉片中出現(xiàn)，同時還在‘卡林’和‘阿斯’品種的嫩葉中檢測到該化合物。與其他品種相比，‘卡林’嫩葉中蘆丁含量較高(4.02 mg/g)，但其他成分則相對較少。木犀草素-4′-O-葡萄糖苷在老葉中較為穩(wěn)定，尤其在‘鄂植’和‘戈達爾’品種中分別為38.15和49.94 mg/g(表3)。橄欖苦苷在‘戈達爾’嫩葉中極為豐富(85.56 mg/g)，但其他化合物含量居中。從總體上看，雖然‘科拉蒂’、‘鄂植’和‘卡林’的酚類化合物相對豐富且較為穩(wěn)定，但與老葉相比，嫩葉含量較高。因此，獲得豐富酚類成分的較佳品種分別為‘科拉蒂’、‘鄂植’和‘卡林’，可將其嫩葉作為高值化利用的潛在來源。

2.2 油橄欖葉中主要營養(yǎng)物質(zhì)的變化

2.2.1 不同葉齡油橄欖葉中主要營養(yǎng)物質(zhì)的季節(jié)變化

油橄欖葉片中FAAC、SSC和SPC在1—12月的含量變化見表4，其波動范圍(包括老葉和嫩葉)分別為2.92～27.25、4.11～21.23 mg/g和1.43～5.97 mg/g。春季(1—3月)油橄欖葉中3種主要營養(yǎng)成分含量均較高，F(xiàn)AAC含量在2月嫩葉中達到峰值(27.25 mg/g)，SPC含量也在此季節(jié)持續(xù)增長(3.57～4.62 mg/g)。進入4月后，3種營養(yǎng)物質(zhì)同時驟降，尤其是FAAC含量降至谷底，但盛夏5—6月卻大幅度增加，嫩葉中FAAC含量和SSC含量在6月升至26.80和21.23 mg/g；與之同時，老葉中SPC含量在5月也顯著上升(5.97 mg/g)(表4)。進入秋冬季后，油橄欖老葉和嫩葉中營養(yǎng)成分含量逐漸降低，直至12月時，F(xiàn)AAC和SPC含量開始回升。

表4 不同葉齡油橄欖葉主要營養(yǎng)物質(zhì)含量的季節(jié)變化

從全年的變化情況來看，3種營養(yǎng)物質(zhì)含量均在嫩葉中更高，但在夏季5月時，SPC在老葉的含量比嫩葉上升更顯著。由此可見，季節(jié)變化對涼山油橄欖老葉和嫩葉中FAAC、SSC和SPC含量的影響極其顯著，且獲得較多這3種營養(yǎng)物質(zhì)的采樣季節(jié)為2—3月和5—6月。另外，油橄欖嫩葉中的營養(yǎng)物質(zhì)比老葉中更豐富。

2.2.2 不同品種油橄欖葉中主要營養(yǎng)物質(zhì)組成的變化

6個主栽品種中，‘戈達爾’嫩葉中的FAAC和SPC含量比其他品種的更高，其含量高達47.67和7.34 mg/g，SSC含量則低至8.34 mg/g；‘卡林’嫩葉中含有豐富的SSC和SPC，且FAAC含量也高達42.64 mg/g(表5)。

表5 不同品種及葉齡油橄欖葉主要營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

而‘鄂植’品種老葉中SPC含量比嫩葉中高19.77%，老葉的SSC和FAAC含量與嫩葉的接近?！评佟贩N的情況相似，即與老葉相比，嫩葉中SPC含量下降12.35%，SSC在葉齡間的差異不顯著，但FAAC在嫩葉中更高?！⑺埂贩N老葉的變化較為有趣，SSC含量是嫩葉中的2.09倍，SPC含量卻比嫩葉低11.34%，F(xiàn)AAC含量低至18.94 mg/g。‘皮削利’品種葉片中的3種營養(yǎng)成分均以嫩葉更豐富，但整體水平較低?？傮w而言，涼山油橄欖6個主栽品種葉片中的FAAC、SSC和SPC含量具有品種間和葉齡間的顯著差異，其中‘卡林’、‘戈達爾’和‘鄂植’3個品種的嫩葉營養(yǎng)成分相對穩(wěn)定且含量較高，可作為油橄欖葉茶的最佳材料來源。

3 討 論

3.1 季節(jié)和葉齡對涼山油橄欖主栽品種葉中酚類含量的影響

油橄欖葉中的活性成分主要受遺傳、種源地、采樣時間、生長狀況和營養(yǎng)狀況等多種因素的影響[5,18-19]。Savournin等[20]分析了油橄欖葉中橄欖苦苷、毛蕊花苷、木犀草素7-O-葡萄糖苷等酚類物質(zhì)含量，結果發(fā)現(xiàn)油橄欖葉中4種酚類物質(zhì)含量在夏季比春季更低。本研究通過HPLC法檢測涼山油橄欖老葉和嫩葉中7種酚類化合物，發(fā)現(xiàn)具有顯著的季節(jié)性差異；其中橄欖苦苷和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷在春季也呈穩(wěn)定的上升趨勢，而夏秋季節(jié)時，橄欖苦苷、蘆丁、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷均在4月和9月顯著下降，這與Diab等[11]和Wang等[12]的研究結果相吻合。Wu等[2]認為4、6和9月是涼山油橄欖春芽、夏芽和秋芽的發(fā)育時期，而1月和11月時葉片接近休眠狀態(tài)，生長非常緩慢，這將是影響這些化合物含量的重要因素。同時，嫩葉擁有更豐富的酚類成分，如橄欖苦苷在‘卡林’、‘戈達爾’和‘科拉蒂’品種的嫩葉中含量最高，芹菜素-7-O-葡萄糖苷在‘阿斯’品種嫩葉中較高，芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁(3.71 mg/g)和木犀草素-4′-O-葡萄糖苷(52.57 mg/g)在‘科拉蒂’品種嫩葉中增加，而‘皮削利’老葉中橄欖苦苷水平極低，表明涼山油橄欖葉中酚類成分具有品種和葉齡差異，這與Savournin等[20]的報道也一致。他們發(fā)現(xiàn)蘆丁在‘Cayon’和‘Verdale-Picholinehybid’品種中含量最多(≥0.26%)，毛蕊花糖苷含量在‘Aglandau’和‘Lucques’品種中較高(≥0.50%)，芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量在兩個品種中都非常高。Ranalli等[13]還報道了油橄欖衰老葉片中主要活性成分的變化，并強調(diào)葉片顏色、葉齡和遺傳因素顯著影響橄欖苦苷的含量，認為可能與遺傳特征、種源地等因素有關[21]。

3.2 季節(jié)和葉齡對涼山油橄欖主栽品種葉中營養(yǎng)物質(zhì)的影響

游離氨基酸常用于反映植物體內(nèi)的氮素代謝情況和植物對氮素的吸收、轉(zhuǎn)運、同化等狀況，是蛋白質(zhì)等含氮化合物合成與分解過程的中介物質(zhì)[22]。可溶性糖則反映植株的碳素營養(yǎng)代謝狀況，是碳水化合物代謝和暫時貯藏的主要形式[23]。本研究通過檢測涼山油橄欖葉中FAAC、SSC和SPC含量在全年(1—12月)的含量變化，發(fā)現(xiàn)3種營養(yǎng)成分在2—3月和5—6月均顯著增加，這可能是植株為更好地抽出新梢和發(fā)出新芽，葉片中營養(yǎng)物質(zhì)增加；也或許是由于春季溫度較低，有利于葉片中含氮化合物的合成與積累，其中游離氨基酸和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量升高[24]。然而，油橄欖在4月進入花芽萌動期后，3種營養(yǎng)物質(zhì)均顯著下降。同時，6個油橄欖品種葉中FAAC、SSC和 SPC含量差異顯著，如‘戈達爾’品種嫩葉中擁有較多的游離氨基酸和可溶性蛋白，SSC含量較低，而‘鄂植’和‘科拉蒂’品種老葉中SPC比嫩葉高。另一方面，不同品種葉齡中的營養(yǎng)物質(zhì)分布也不均勻，如與老葉相比，‘卡林’品種嫩葉中3種營養(yǎng)成分含量都較高。此外，相同品種不同葉齡時其營養(yǎng)成分也不相同。如‘阿斯’品種老葉中SSC含量是嫩葉的2.09倍，SPC含量卻比嫩葉低11.34%，F(xiàn)AAC含量低至18.94 mg/g。這表明油橄欖葉中營養(yǎng)物質(zhì)受到了季節(jié)和品種的顯著影響，該現(xiàn)象不僅與油橄欖遺傳基因有關，還可能與油橄欖樹花、芽、果的生長和營養(yǎng)循環(huán)緊密相關[9]。

綜上所述，涼山地區(qū)油橄欖6個主栽品種葉片的FAAC、SSC和 SPC和7種酚類成分在全年不同季節(jié)呈不均勻分布狀態(tài)，其含量在不同品種葉片中波動幅度大，尤其是在老葉和嫩葉中含量差異顯著?？傮w上看，從油橄欖葉中獲得豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和穩(wěn)定的酚類成分的較佳季節(jié)為春季，其中3月最為合適；6個主栽品種中，‘鄂植’和‘卡林’葉片中擁有較多的營養(yǎng)成分和酚類化合物，其嫩葉可作為潛在的高值化材料來源加以開發(fā)。