基于高通量測(cè)序技術(shù)的松材線蟲研究進(jìn)展

丁曉磊，張 悅，林司曦，葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

林業(yè)有害生物危害已成為當(dāng)前制約我國(guó)林業(yè)建設(shè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要障礙[1]。松材線蟲病(pine wilt disease)作為林業(yè)毀滅性病害之一，具有傳播迅速、防治困難，以及一旦染病全株迅速枯死且不可逆轉(zhuǎn)等特點(diǎn)。松樹感病后最快40 d即可枯死，如不及時(shí)除治，從單棵松樹發(fā)病到數(shù)百公頃的松林毀滅僅需3～5 a的時(shí)間。正是由于該病的嚴(yán)重性，其病原松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)已成為國(guó)際上公認(rèn)的重要檢疫性有害生物。松材線蟲原產(chǎn)于北美，對(duì)鄉(xiāng)土松種并未造成明顯的損失[2]。但從20世紀(jì)初起，松材線蟲先后傳入日本、中國(guó)和韓國(guó)等東亞地區(qū)，給該地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)破壞[3]，并于1999年傳入葡萄牙，隨后擴(kuò)散至西班牙，危害歐洲大片松林[4-5]。1982年我國(guó)首次在南京發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，并在隨后的40年內(nèi)迅速擴(kuò)展蔓延，至2021年底，我國(guó)有19個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)的728個(gè)縣級(jí)行政區(qū)被劃分為疫區(qū)，防控形勢(shì)異常嚴(yán)峻[6]。

各國(guó)學(xué)者一直試圖通過闡明松材線蟲的致病機(jī)制來推進(jìn)病害防控，研究者們圍繞該病害已經(jīng)開展了許多研究也取得了諸多成果，但其致病機(jī)制目前尚無定論[7-16]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，松材線蟲致病的分子機(jī)制研究不斷取得突破。近20年來，纖維素酶、果膠裂解酶、細(xì)胞色素酶等松材線蟲致病關(guān)鍵基因及其潛在調(diào)控功能研究已見報(bào)道[14-17]，而高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和普及為研究該病提供了新的方法。首代短讀長(zhǎng)測(cè)序組裝的松材線蟲基因組草圖在2011年發(fā)布[18]，為后續(xù)分子致病機(jī)理的研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。此后關(guān)于該病害的致病機(jī)理研究主要聚焦在致病基因、非編碼RNA和種群變異等方面[8, 19-22]，但大多以解析具有潛在調(diào)控作用的基因?yàn)橹鱗20-24]。近年來，三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序和染色體空間結(jié)構(gòu)測(cè)序技術(shù)將分子生物學(xué)研究帶入了新的階段，使高質(zhì)量染色體級(jí)別基因組的組裝變得切實(shí)可行，越來越多物種的基因組也同步得到了更新[25-27]。日本學(xué)者和筆者所在研究團(tuán)隊(duì)分別在2021年、2022年公布了2個(gè)版本的松材線蟲染色體級(jí)別基因組，為開展松材線蟲的分子生物學(xué)研究奠定了重要基礎(chǔ)[28-29]。在此，筆者對(duì)近年來松材線蟲高通量測(cè)序相關(guān)研究進(jìn)行綜述，全面概括利用該技術(shù)在松材線蟲分子致病研究中取得的重要進(jìn)展，以期為后續(xù)開展松材線蟲致病的相關(guān)分子生物學(xué)研究提供借鑒。

1 早期松材線蟲病相關(guān)致病基因研究

在高通量測(cè)序技術(shù)問世之前，松材線蟲致病相關(guān)分子機(jī)制主要采用基因同源克隆、抑制消減雜交文庫(kù)和基因芯片等手段進(jìn)行相關(guān)基因功能研究[14-17, 30]。如2006年Kikuchi等[14]對(duì)松材線蟲2個(gè)果膠裂解酶基因進(jìn)行了同源克隆，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因主要在松材線蟲的食道中特異表達(dá)，證明了它們?cè)诰€蟲侵入寄主過程中發(fā)揮著重要作用。Kang等[15]和Hirao等[17]分別于2009年和2012年對(duì)不同齡期的松材線蟲進(jìn)行了差減文庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)了19個(gè)特異表達(dá)的基因，其中半胱氨酸蛋白酶、毒液過敏原相關(guān)基因等與致病性密切相關(guān)；Qiu等[30]通過基因芯片技術(shù)對(duì)接種前后的松材線蟲進(jìn)行基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)1 310個(gè)基因中，633個(gè)基因上調(diào)、677個(gè)基因下調(diào)。這些差異基因中包含大量致病相關(guān)基因(如果膠裂解酶基因、細(xì)胞色素P450、UGTs、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等)，注釋結(jié)果表明這些致病相關(guān)基因主要參與了細(xì)胞壁降解和生殖過程。以上研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與松材線蟲致病相關(guān)的關(guān)鍵基因,為闡明松材線蟲致病機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)，但由于當(dāng)時(shí)缺少基因組數(shù)據(jù)，學(xué)者們難以深入挖掘松材線蟲特有或未知基因，阻礙了對(duì)該病致病機(jī)理的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

2 基于初代基因組的相關(guān)致病基因研究

日本學(xué)者在2011年公布了首個(gè)基于短讀長(zhǎng)測(cè)序的松材線蟲基因組草圖，為廣大研究者提供了約75 Mb、5 527個(gè)scaffolds和12 568個(gè)注釋基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[18]。自此，松材線蟲的分子生物學(xué)相關(guān)研究進(jìn)入了有參基因組時(shí)代，極大地方便了研究人員的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對(duì)關(guān)鍵致病基因的挖掘。

2011年Li等[31]在松材線蟲基因組中挖掘到了1個(gè)新的2-半胱氨酸過氧化物酶BRP-RX，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在BRP-RX的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有1個(gè)由23個(gè)連續(xù)疏水氨基酸組成的跨膜α-螺旋，推測(cè)其可能在線蟲抵御寄主植物 ROS 防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，是一個(gè)潛在的促進(jìn)松材線蟲侵染松樹的遺傳因子。2012年Wang等[32]對(duì)松材線蟲精氨酸激酶BxAK1進(jìn)行了克隆和RNA干擾驗(yàn)證，結(jié)果表明沉默該基因可以顯著提升松材線蟲的死亡率并降低其繁殖率，揭示了其作為防控靶標(biāo)的潛在可能性。2015年Xu等[33]對(duì)3個(gè)松材線蟲致病相關(guān)細(xì)胞色素酶P450基因進(jìn)行了克隆，相關(guān)功能分析表明上述基因與松材線蟲傳播、繁殖和致病力相關(guān)。2020年Liu等[34]開展了松材線蟲自噬基因相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)松材線蟲自噬基因與宿主體內(nèi)活性氧代謝密切相關(guān)，且在氧脅迫下能夠誘導(dǎo)自噬基因的表達(dá)，明確了自噬基因在松材線蟲致病過程中可能發(fā)揮的作用。除了以上研究成果，越來越多關(guān)于松材線蟲分子生物學(xué)探索中開始使用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平的差異基因挖掘和基因組水平的遺傳變異研究?；趨⒖蓟蚪M和海量測(cè)序數(shù)據(jù)的幫助，松材線蟲分子生物學(xué)相關(guān)研究在近10年來取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。

3 松材線蟲高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相關(guān)研究

3.1 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的松材線蟲功能基因挖掘

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠在海量數(shù)據(jù)的支持下揭示松材線蟲致病相關(guān)基因的表達(dá)模式，以及預(yù)測(cè)基因功能和發(fā)現(xiàn)未知基因，達(dá)到對(duì)轉(zhuǎn)錄水平變化的高覆蓋度分析。2012年Yan等[35]對(duì)松材線蟲與擬松材線蟲的轉(zhuǎn)錄組(RNA-seq)進(jìn)行de-novo組裝的嘗試，基于松材線蟲與擬松材線蟲分別獲得了23 765和21 782個(gè)轉(zhuǎn)錄本片段，并發(fā)現(xiàn)了6個(gè)尚未報(bào)道的類毒液過敏原蛋白(VAPs)基因，認(rèn)為松材線蟲與擬松材線蟲可能在進(jìn)化過程中形成了相似的分子機(jī)制以適應(yīng)在宿主體內(nèi)的生活。2016年Tsai等[8]利用RNA-seq分析了松材線蟲在接種48 h后基因轉(zhuǎn)錄的變化，發(fā)現(xiàn)有60個(gè)與解毒物質(zhì)相關(guān)的基因在接種后明顯上調(diào)表達(dá)，而下調(diào)表達(dá)的基因則主要屬于膠原蛋白家族，并且雌性松材線蟲的尾尖突在接種后產(chǎn)生了較為明顯的表型變化。因此，作者認(rèn)為松材線蟲在侵染松樹的過程中可能會(huì)通過自身表型的變化來適應(yīng)外界環(huán)境的變化。2016年，Ding等[36]對(duì)不同毒力的4個(gè)松材線蟲蟲株進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的238個(gè)轉(zhuǎn)錄本和84個(gè)外顯子。差異基因功能分析發(fā)現(xiàn)，不同毒力蟲株表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)、繁殖特征和氧化還原酶活性，明確了以上基因與獨(dú)立分化之間的關(guān)系。Espada等[9]在2016年利用RNA-seq對(duì)松材線蟲早期侵染階段進(jìn)行效應(yīng)子的篩選，發(fā)現(xiàn)多個(gè)在感染早期高表達(dá)的效應(yīng)子并進(jìn)行了初步的功能研究，這也是松材線蟲效應(yīng)子相關(guān)研究的首次報(bào)道。Hu等[37]和Zhao等[38]分別于2019年和2020年通過RNA-seq成功鑒定了松材線蟲中的BxSapB1和BxSapB2等2個(gè)效應(yīng)子。其中BxSapB1可以導(dǎo)致本氏煙草細(xì)胞死亡，并對(duì)松材線蟲毒力有一定的影響；BxSapB2是一種分泌蛋白，在松材線蟲的食管腺細(xì)胞和化感器中高表達(dá)，且在松材線蟲與寄主的互作中扮演重要角色。2019年日本研究者Tanaka等[7]對(duì)松材線蟲不同發(fā)育階段進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，發(fā)現(xiàn)超過9 000個(gè)基因在不同發(fā)育階段有差異表達(dá)，其中與線蟲生物學(xué)有關(guān)的基因多涉及生殖和蛻皮方面。2019年Wang等[39]通過RNA-seq測(cè)序來研究松材線蟲在低溫下的分子反應(yīng)模式，分析了6個(gè)低溫相關(guān)BxGPCR基因的轉(zhuǎn)錄豐度后發(fā)現(xiàn)，BxGPCR基因在低溫下轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而BxGPCR17454基因沉默后的松材線蟲其低溫存活率顯著下降。這一研究結(jié)果部分揭示了松材線蟲的低溫適應(yīng)分子機(jī)制。2021年，Chen等[40]對(duì)擴(kuò)散性階段的松材線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其主要功能富集在細(xì)胞自噬和壽命相關(guān)通路。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，松材線蟲中海藻糖相關(guān)基因的協(xié)同表達(dá)促進(jìn)了3齡幼蟲的形成，并幫助其在-20 ℃下存活。其他轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究還包括石榴苷、甲維鹽和蒎烯處理對(duì)松材線蟲相關(guān)基因表達(dá)量的影響[41-43]。為了闡明細(xì)菌在松材線蟲病中可能發(fā)揮的作用，陳陽(yáng)雪等[44]采用對(duì)野生型和含有馬尾松內(nèi)生細(xì)菌GD2的松材線蟲分別進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，對(duì)接種后松材線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較了不同處理后篩選出的143個(gè)差異表達(dá)基因，其后續(xù)功能分析表明菌株GD2可以通過提高松材線蟲的免疫調(diào)節(jié)能力來影響松材線蟲病的發(fā)生。

3.2 松材線蟲非編碼RNA鑒定

目前關(guān)于松材線蟲非編碼RNA的研究較少，且多數(shù)都圍繞在基于高通量測(cè)序的miRNA鑒定和表達(dá)水平分析等方面，很少涉及某個(gè)miRNA的調(diào)控機(jī)制研究。如2010年Huang等[45]首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲體內(nèi)存在非編碼RNA，有49個(gè)miRNA在種間高度保守，可能調(diào)控979個(gè)靶標(biāo)基因。其中14個(gè)miRNA參與調(diào)控了松材線蟲的耐熱性，初步揭示了非編碼RNA與松材線蟲環(huán)境適應(yīng)性之間的關(guān)系。2015年，Ding等[22]構(gòu)建了松材線蟲侵染松樹后4個(gè)不同階段的miRNA文庫(kù)，獲得了數(shù)百個(gè)進(jìn)化上相對(duì)保守的miRNA和未知候選miRNA數(shù)據(jù)集，表達(dá)豐度分析發(fā)現(xiàn)大部分miRNA在松材線蟲病發(fā)病中期呈現(xiàn)高水平表達(dá)，揭示了miRNA在松材線蟲致病過程中的潛在調(diào)控作用。Modesto等[46]研究了miRNAs在松材線蟲侵染Pinuspinaster早期發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，鑒定出105個(gè)響應(yīng)松材線蟲侵染的miRNAs，并根據(jù)預(yù)測(cè)的靶標(biāo)，認(rèn)為這些miRNAs中的一部分與茉莉酸反應(yīng)途徑、ROS解毒和萜類生物合成的作用有關(guān)。此外，通過對(duì)抗病和感病植物的比較，還鑒定出了8個(gè)在植物防御和抗病方面具有潛在功能的miRNAs。2017年，Xie等[47]以馬尾松為供體植物，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了松材線蟲侵染后前3 d針葉中miRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，松材線蟲侵染后3 d內(nèi)，差異表達(dá)的miRNAs在樣品中呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中以感染后第2天采集的樣品表達(dá)最高。對(duì)感染后不同時(shí)間針葉中miRNA靶基因的分析表明，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)兩條途徑富含miRNAs。Cai等[48]于2022年利用miRDeep2、mireap和miR分析器等miRNA預(yù)測(cè)工具或通過同源作圖，已在至少36種寄生蠕蟲(包括松材線蟲)中鑒定出了不同的miRNA種群。

4 松材線蟲伴生微生物群落高通量測(cè)序相關(guān)研究

松材線蟲伴生微生物群落一直以來被一些學(xué)者認(rèn)為可能與松材線蟲病毒力和繁殖力等密切相關(guān)?；诟咄繙y(cè)序的宏基因組技術(shù)可以全面分析松材線蟲體表和體內(nèi)攜帶的微生物群落情況，明確線蟲和微生物之間的互作機(jī)制。2012年，Cheng等[49]采用核糖體RNA通用引物擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RNA-seq測(cè)序的方法分析了松材線蟲伴生微生物群落,結(jié)果發(fā)現(xiàn)松材線蟲微生物群落的解毒機(jī)制以苯甲酸降解代謝為主，不同于松材線蟲基于細(xì)胞色素CYP450代謝的解毒通路。實(shí)驗(yàn)分析還表明，大多數(shù)可培養(yǎng)的細(xì)菌不僅可以耐受0.4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的α-pinene，還能作為其生長(zhǎng)的碳源，故而認(rèn)為松材線蟲和其共生微生物之間已經(jīng)建立了互惠互利的解毒機(jī)制。2014年，Xiang等[50]通過細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序研究了4株不同毒力的松材線蟲和4株擬松材線蟲的內(nèi)生細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異，基于運(yùn)算分類單元(operational taxonomic unit，OTU)的結(jié)果表明，松材線蟲強(qiáng)毒蟲株AMA3和ZL1的菌群豐富度均高于中毒蟲株AA3、HE2和所有擬松材線蟲蟲株，不同種群線蟲所攜帶的內(nèi)生細(xì)菌差異顯著。2016年，Wu等[51]利用Biolog結(jié)合高通量測(cè)序分析了松材線蟲繁殖型和擴(kuò)散型之間伴生細(xì)菌群落差異，高通量分析表明寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)、無色桿菌(Achromobactersp.)和鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp.)在繁殖型松材線蟲中更豐富，而檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)、弧菌(Vibriosp.)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在擴(kuò)散型松材線蟲中含量更高，這種變化可能有助于松材線蟲適應(yīng)環(huán)境的改變。Xue等[42]為探討松材線蟲內(nèi)生細(xì)菌嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)對(duì)松材線蟲致病力的影響，對(duì)無菌線蟲和攜帶嗜麥芽窄食單胞菌的松材線蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明嗜麥芽窄食單胞菌可通過調(diào)節(jié)松材線蟲寄生、免疫和致病相關(guān)基因的表達(dá)來影響松材線蟲的毒力和繁殖，此結(jié)果為進(jìn)一步探討松材線蟲病的發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)。為了弄清松材線蟲侵染寄主對(duì)寄主內(nèi)生細(xì)菌的影響，蘆偉等[52]以 2年生馬尾松苗為試驗(yàn)材料，采用 Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)分析受松材線蟲侵染后的馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性的變化情況，發(fā)現(xiàn)在屬水平上馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌組成種類與豐度均發(fā)生明顯改變，表明松材線蟲侵染會(huì)對(duì)馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生顯著影響。尹詩(shī)恒等[53]為了探究松材線蟲侵染下松干、松針與根系部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)變化，充分挖掘馬尾松內(nèi)生細(xì)菌資源，采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)及高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)松材線蟲侵染下3年生馬尾松不同部位內(nèi)生細(xì)菌的結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明受侵染后的馬尾松根部基本不受影響，但樹干部位內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化極顯著，其次是松針。Deng等[54]通過從微孔膜和0.5 g土壤中提取基因組DNA,對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因的V3—V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)健康紅松和紅松早期及后期感染松材線蟲的葉圈和根際細(xì)菌、真菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著松材線蟲病感染程度的加重，大多數(shù)細(xì)菌群趨向于共排除而不是共生。

5 松材線蟲高通量基因組測(cè)序相關(guān)研究

5.1 松材線蟲短讀長(zhǎng)基因組重測(cè)序

在基因組水平上，高通量測(cè)序能夠檢測(cè)松材線蟲不同種群間的核苷酸位點(diǎn)差異和基因家族擴(kuò)張現(xiàn)象，為解析該病害的進(jìn)化過程、明確關(guān)鍵性狀的生物靶標(biāo)及分析種間差異提供有效的技術(shù)手段。2015年P(guān)alomares-Rius等[20]將日本境內(nèi)不同地理來源的松材線蟲進(jìn)行了基于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的差異分析。該研究首次報(bào)道了松材線蟲體內(nèi)含有約3 Mb的SNPs位點(diǎn)，占到了基因組的4.1%。這些高水平的遺傳變異也表明松材線蟲在毒力與生態(tài)適應(yīng)性方面具有較高的多樣性。2020年Zhang等[55]通過開展松材線蟲、動(dòng)物寄生線蟲和植物寄生線蟲等線蟲種的比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)松材線蟲的51個(gè)基因家族都存在基因擴(kuò)張情況，基中參與外源解毒途徑的黃素單加氧酶(FMO)、細(xì)胞色素P450(CYP450)、醇脫氫酶(ADH)、葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶(UGT)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等基因的擴(kuò)張現(xiàn)象尤為顯著。雖然大多數(shù)的擴(kuò)張可能是由DNA片段重復(fù)產(chǎn)生，但其中9個(gè)ADH基因可能是通過水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象從真菌中獲得。研究認(rèn)為宿主防御化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致了松材線蟲外源解毒途徑的基因家族擴(kuò)展，促進(jìn)了其在樹脂道中的生存，提高了線蟲在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性。2021年Filipiak等[56]為了對(duì)4株具有不同毒力的蟲株進(jìn)行重測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)1 576個(gè)與毒力差異有潛在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，為在分子水平上區(qū)分不同毒力松材線蟲蟲株提供了分子靶標(biāo)。2019年，黃金思等[57]通過Illumina Hi-seq 4000平臺(tái)對(duì)采集自廣東省不同區(qū)域的30株松材線蟲蟲株進(jìn)行基因組重測(cè)序，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其SNPs位點(diǎn)信息及基因型進(jìn)行分析，最后通過主成分和聚類分析將這30株蟲株分為3類，完成了基于SNP標(biāo)記的廣東省松材線蟲種群分化研究。2021年Ding等[28]在松材線蟲新的染色體級(jí)別基因組基礎(chǔ)上對(duì)來自中國(guó)和美國(guó)的181個(gè)菌株進(jìn)行了重測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了約780萬個(gè)SNPs位點(diǎn)，并將中國(guó)松材線蟲種群細(xì)化為4個(gè)類群。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，不同類群線蟲與地理來源關(guān)系密切，不同地區(qū)間存在嚴(yán)重的交叉感染現(xiàn)象。此外，該研究還建立了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的松材線蟲疫源追溯體系，為控制病害蔓延提供了有力的防控手段。

5.2 基于長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)的松材線蟲基因組組裝

第2代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，極大地推進(jìn)了基因組層次研究的進(jìn)展，使得基因組測(cè)序工作變得比較簡(jiǎn)單。但其缺點(diǎn)也日益凸顯，最主要的問題是第2代測(cè)序讀長(zhǎng)短，測(cè)通困難[58]，這給序列拼接、組裝及注釋等分析帶來巨大的困難。而第3代測(cè)序技術(shù)是在單一的、由 DNA 分子組成的陣列上進(jìn)行的合成測(cè)序。這種技術(shù)可以大大增加獨(dú)立分析的 DNA 片段的數(shù)目，增強(qiáng)產(chǎn)出序列的長(zhǎng)度，極大地簡(jiǎn)化了基因組組裝過程[59]。目前，在第3代測(cè)序技術(shù)的幫助下，已陸續(xù)完成了各物種基因組版本更新，提高了測(cè)序結(jié)果的完整度和精細(xì)度，且很多物種已有端粒至端粒的完整精細(xì)圖譜。高質(zhì)量的基因組無疑為后續(xù)所有分子生物學(xué)相關(guān)研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，Dayi等[29]在2020年將其發(fā)布的初代基因組使用Nanopore長(zhǎng)讀長(zhǎng)序列和HI-C技術(shù)進(jìn)行了更新，獲得了松材線蟲染色體級(jí)別基因組。幾乎同時(shí)期，Ding等[28]利用PacBio+Illumina +Bionano+Hi-C多項(xiàng)技術(shù)對(duì)松材線蟲進(jìn)行了基因組組裝，兩項(xiàng)研究均獲得了6條近完整的染色體序列，將基因組大小提高至78 Mb。以上新基因組的scaffold長(zhǎng)度均達(dá)到了12 Mb，是早期基因組(0.2 Mb)的60倍，平均scaffold長(zhǎng)度為其24倍。此外，功能注釋和RNA-seq數(shù)據(jù)分析證明，借助新版本基因組可以鑒定出更多的新基因和亞型，這將有助于研究人員獲取更完整的松材線蟲轉(zhuǎn)錄組信息。以上兩個(gè)版本的基因組數(shù)據(jù)可以完成對(duì)松材線蟲復(fù)雜重復(fù)區(qū)域的高度覆蓋，彌補(bǔ)了上一版本松材線蟲基因組草圖的不足，為后續(xù)相關(guān)研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

6 結(jié) 語(yǔ)

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的松材線蟲關(guān)鍵致病基因、非編碼RNA，以及種群遺傳差異位點(diǎn)被報(bào)道，加深了對(duì)松材線蟲分子致病機(jī)理的理解。尤其是隨著松材線蟲最新版本基因組數(shù)據(jù)的公布，研究者們將向著更為精細(xì)、前沿的研究領(lǐng)域探索。在轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究方面，可嘗試開展空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞測(cè)序等在松材線蟲中尚未使用的新技術(shù)[60-62]，在染色體基因組的支持下尋找松材線蟲中具有潛在調(diào)控功能的長(zhǎng)鏈非編碼RNA、融合基因和環(huán)狀RNA等罕見核酸分子；挖掘可能存在的甲基化、RNA編輯、結(jié)構(gòu)變異等未知現(xiàn)象。在基因組學(xué)研究方面，可以開展基因家族擴(kuò)增、大樣本全基因組關(guān)聯(lián)分析和數(shù)量性狀定位等研究，以挖掘與致病力和繁殖力等重要性狀緊密關(guān)聯(lián)的基因或位點(diǎn)，闡明松材線蟲不同種群在進(jìn)化過程中發(fā)生的適應(yīng)性變化。以上新的研究方向?qū)樗刹木€蟲病相關(guān)分子研究提供全新的思路和切入點(diǎn)，有助于深入揭示其潛在的致病機(jī)理。