Th2CysPrx基因提高釀酒酵母多種脅迫耐受性研究

王媛媛，劉百超，姜 波，王丹妮，高彩球

(東北林業(yè)大學(xué)，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

Prxs是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的酶，它們可以通過還原過氧化物保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[3]。自1988年首先在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)Prxs酶后[4]，陸續(xù)在細(xì)菌、動(dòng)物、植物中被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行一系列研究[5-7]。植物中Prxs主要分為4類：1CysPrx、2CysPrx、PrxQ和Ⅱ型Prx(PrxIIB/C/E/F)，其中，2CysPrxs是一種基質(zhì)蛋白，其C端與N端均有一個(gè)保守的半胱氨酸殘基，并以同型二聚體形式存在，具有信號(hào)傳導(dǎo)、生理代謝、分子伴侶及非生物脅迫耐受等功能[8]。在本氏煙草(Nicotianabenthamiana)中，2CysPrx通過再生抗壞血酸影響脫落酸(ABA)生物合成，進(jìn)而影響ABA信號(hào)傳導(dǎo)，在ABA生物合成以及光合作用的保護(hù)中具有直接作用[9]。將小球藻(Chlorellapyrenoidesa)2-CysPrx基因，轉(zhuǎn)入酵母中單獨(dú)或協(xié)同表達(dá)時(shí)，能顯著提高酵母對(duì)冷凍、高溫、甲萘醌誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激脅迫的耐受性[10]。在H2O2、高溫、甲基紫精等非生物逆境脅迫條件下超表達(dá)擬南芥At2-CysPrx基因能顯著提高馬鈴薯(Solanumtuberosum)對(duì)非生物逆境脅迫的耐受性[11]。2013年張會(huì)慧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)煙草2-CysPrx基因能降低鹽脅迫和高光作用下轉(zhuǎn)基因煙草植株的氧化損傷，抑制抗壞血酸過氧化物酶活性，有效清除細(xì)胞中過量H2O2，提高光合電子傳遞鏈穩(wěn)定性，降低PSⅡ光抑制程度。

為了分析Th2CysPrx基因是否還參與其他多種非生物脅迫，本研究將Th2CysPrx基因構(gòu)建到pYES2酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入INVSC1釀酒酵母中，通過比較多種非生物脅迫下酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和活性，探究Th2CysPrx基因是否能提高植物對(duì)多種非生物脅迫的耐受能力。

1 材料與方法

1.1 菌種和載體

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSCl菌株和pYES2載體為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1Th2CysPrx基因酵母表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)Th2CysPrx基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)酵母表達(dá)載體引物(pYES2-Th2CysPrx-F和pYES2-Th2CysPrx-R)，上游引物為5′-ATGGGGTACCATGGCGTGCGCAGCCCCAACT-3′；下游引物為5′-ATGCTCTAGATTAAATTGCAGCGAAGTACTC-3′(下劃線為KpnI和XbaI酶切位點(diǎn)序列)。以剛毛檉柳cDNA為模板，PCR克隆帶有酶切位點(diǎn)的Th2CysPrx基因。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s變性；58 ℃ 30 s退火；72 ℃ 1 min延伸，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用KpnI和XbaI 在37 ℃雙酶切目的基因和pYES2載體質(zhì)粒，T4DNA連接酶16 ℃過夜連接。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)Top10，隨機(jī)挑取單克隆經(jīng)檢驗(yàn)后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pYES2-Th2CysPrx。

1.2.2 pYES2-Th2CysPrx酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化與鑒定

采用醋酸鋰法將pYES2-Th2CysPrx質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株INVSC1中，同時(shí)將空pYES2載體轉(zhuǎn)入INVSC1作為陰性對(duì)照，二者分別標(biāo)記為INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)。挑取轉(zhuǎn)化后的單克隆于SC-U液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，4 000 r/min離心10 min，液氮速凍并研缽研磨進(jìn)行PCR檢測(cè)。選擇含有目的條帶的單克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Th2CysPrx基因酵母細(xì)胞抗逆性分析

分別挑取INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)接種于SC-U液體培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600值，將菌液重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-U+質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%β-半乳糖)中使菌體OD600為0.4，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h后測(cè)定OD600值，重懸使1 mL體積中菌體OD600值為2，在9 000 r/min條件下離心1 min，棄上清液。將菌體重懸于1 mL分別含有5 mol/L NaCl、3 mol/L KCl或0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))LiCl溶液中，4 ℃振蕩24 h；或0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))LiCl、0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CdCl2、0.001%(體積分?jǐn)?shù))H2O2、2 mol/L山梨糖醇或6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaHCO3，30 ℃振蕩1 h；或重懸SC-U液體溶液中并于-20 ℃冷凍24 h，或52 ℃培養(yǎng)0.5 h。稀釋100、1 000、10 000、100 000倍接種于SC-U固體培養(yǎng)基。30 ℃培養(yǎng)2～4 d，觀察菌落存活率。

為進(jìn)一步定量分析，將1 mL上述處理OD600為2的菌體重懸于5 mL培養(yǎng)液中，在SC-U液體培養(yǎng)基中分別加入終濃度1、2、3、4或5 mol/L NaCl，0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mol/L KCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%、0.003%、0.005%、0.007%、0.010%LiCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%、0.003%、0.005%、0.007%、0.010%CdCl2，體積分?jǐn)?shù)為0.000 1%、0.000 3%、0.000 5%、0.000 7%、0.001 0%H2O2，0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L山梨醇，或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%、2.4%、3.6%、4.8%、6.0% NaHCO3進(jìn)行培養(yǎng)。冷脅迫處理為，在-20 ℃放置3、6、9、12或24 h后于30 ℃下培養(yǎng)9 h；熱脅迫處理為，在36、40、44、48或52 ℃水浴1 h后置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。測(cè)定各種非生物脅迫下的OD值，以此表征菌落存活率。

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組酵母INVSC1鑒定

以隨機(jī)挑選的3個(gè)已轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒(pYES2-Th2CysPrx)的酵母單菌落總DNA為模板，用特異引物(pYES2-Th2CysPrx-F和pYES2-Th2CysPrx-R)進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示?？芍簲U(kuò)增片段與預(yù)期長(zhǎng)度一致為825 bp，證明重組質(zhì)粒(pYES2-Th2CysPrx)已成功轉(zhuǎn)入酵母菌株INVSC1，成功獲得酵母重組子INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)。

2.2 Th2CysPrx基因?qū)湍付喾N脅迫的耐受性的影響

為了分析Th2CysPrx基因的功能，比較正常和各種脅迫條件下INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)的生長(zhǎng)和存活率差異。酵母細(xì)胞生長(zhǎng)狀況見圖2可知：在正常條件下，pYES2和pYES2-Th2CysPrx轉(zhuǎn)化酵母生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。表明外源Th2CysPrx基因的表達(dá)不影響INVSC1的生長(zhǎng)。而脅迫后，INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)的生長(zhǎng)和存活表型各不相同。

2.2.1Th2CysPrx基因?qū)湍耕}脅迫耐受性的影響

INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)分別暴露于NaCl、KCl、LiCl或NaHCO3等4種中性或堿性鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)結(jié)果見圖3。由圖3可知，在大多數(shù)鹽脅迫下，INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)存活率明顯高于NVSC1(pYES2)。為了定量地分析鹽脅迫下INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)生長(zhǎng)差異，對(duì)4種鹽不同濃度脅迫后的菌落存活率(以O(shè)D600表征)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)5種濃度的NaCl脅迫下，pYES2-Th2CysPrx轉(zhuǎn)化酵母的存活率均顯著高于pYES2。其中，在3 mol/L NaCl脅迫下，pYES2-Th2CysPrx酵母細(xì)胞濃度是pYES2的2.08倍。在NaHCO3的大部分脅迫濃度下，pYES2-Th2CysPrx轉(zhuǎn)化酵母的存活率也明顯提高；而在KCl和LiCl脅迫下，pYES2和pYES2-Th2CysPrx轉(zhuǎn)化酵母的存活率幾乎都無(wú)顯著差異(除0.01%LiCl脅迫)(圖3)。這表明過表達(dá)Th2CysPrx基因能提高酵母細(xì)胞對(duì)NaCl和NaHCO3脅迫的耐受性，而對(duì)KCl和LiCl脅迫的耐受性提高不明顯。NaCl、KCl和LiCl 3種鹽都含有Cl-，因此可以排除Cl-的影響，其可能是Th2CysPrx基因?qū)χ行院蛪A性Na鹽脅迫的耐受效果更明顯，而另外兩種鹽離子(K+和Li+)脅迫的應(yīng)答不明顯。

2.2.2Th2CysPrx基因?qū)湍笣B透脅迫耐受性的影響

INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)分別暴露于滲透脅迫條件下的生長(zhǎng)和OD值測(cè)定結(jié)果見圖4。

由圖4可知：在滲透脅迫下，INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)的存活率明顯高于INVSC1(pYES2)。當(dāng)山梨醇脅迫濃度達(dá)到0.5 mol/L時(shí)，pYES2和pYES2-Th2CysPrx轉(zhuǎn)化酵母生長(zhǎng)差異顯著；隨著滲透脅迫濃度的增加，pYES2-Th2CysPrx與pYES2轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞濃度比值也主要呈升高趨勢(shì)，分別為pYES2轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的1.03、1.07、1.30、1.29和2.06倍。這表明高濃度山梨醇脅迫時(shí)，Th2CysPrx基因的過表達(dá)有效提高了酵母的滲透脅迫耐受性。

2.2.3Th2CysPrx基因?qū)湍笜O端溫度耐受性的影響

INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)分別暴露于極端溫度(高溫和低溫)條件下的生長(zhǎng)和存活率結(jié)果見圖5。由圖5可知：在低溫脅迫下，兩組酵母細(xì)胞無(wú)明顯差異。但當(dāng)酵母細(xì)胞受到44 ℃以上高溫脅迫時(shí)，INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)酵母細(xì)胞存活率顯著高于INVSC1(pYES2)。表明Th2CysPrx基因?qū)湍讣?xì)胞的高溫脅迫具有一定的耐受性。

2.2.4Th2CysPrx基因?qū)湍缚寡趸{迫耐受性的影響

INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)分別暴露于H2O2脅迫下的生長(zhǎng)和OD值測(cè)定結(jié)果見圖6。在H2O2氧化脅迫下，INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)存活率顯著高于對(duì)照，且隨著H2O2濃度升高，兩種轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的差異越顯著。當(dāng)0.003% H2O2脅迫下，pYES2-Th2CysPrx酵母細(xì)胞濃度是pYES2的1.17倍。當(dāng)0.005% H2O2脅迫下，pYES2-Th2CysPrx酵母細(xì)胞濃度是pYES2的1.52倍。表明過表達(dá)Th2CysPrx基因顯著提高了酵母細(xì)胞氧化脅迫耐受性。

2.2.5Th2CysPrx基因?qū)湍钢亟饘倜{迫耐受性的影響

INVSC1(pYES2-Th2CysPrx)和INVSC1(pYES2)分別暴露于質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.007%CdCl2脅迫下時(shí)，pYES2-Th2CysPrx存活率顯著高于pYES2(圖7)。尤其是在0.005 % CdCl2脅迫下，pYES2-Th2CysPrx酵母細(xì)胞濃度與pYES2差異最大，達(dá)到pYES2酵母細(xì)胞的1.36倍。由此可見，過表達(dá)Th2CysPrx基因顯著提高了重組酵母對(duì)低濃度Cd2+脅迫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.007%)的耐受性。

3 討 論

過氧化還原蛋白是生物體調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的一種重要蛋白質(zhì)，在植物生長(zhǎng)代謝中起重要作用；也與多種非生物脅迫相關(guān)，能夠催化H2O2的還原，有效清除植物內(nèi)ROS，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，進(jìn)而控制基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。前期研究發(fā)現(xiàn)Th2CysPrx與鹽脅迫相關(guān)，本研究中在NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因酵母存活率實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果，同時(shí)進(jìn)一步探究了Th2CysPrx是否還參與其他一些與活性氧相關(guān)的非生物脅迫應(yīng)答，以鑒定Th2CysPrx基因的抗逆功能。具體參考酵母細(xì)胞中與多種非生物脅迫相關(guān)基因功能研究的方法[20]，探究了Th2CysPrx在KCl、LiCl和NaHCO3等其他鹽脅迫條件下的脅迫耐受性，以及Th2CysPrx在滲透脅迫、極端溫度、氧化脅迫和重金屬脅迫等多種非生物脅迫下的功能。

Th2CysPrx基因具有過氧化物酶、分子伴侶、氧化酶、細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)器等功能。同時(shí)生物體內(nèi)，植物為清除自身代謝以及逆境中產(chǎn)生的過量ROS，進(jìn)化出一套較為復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，主要由低分子量的抗氧化酶組成，這些酶協(xié)同合作共同清除ROS，從而使細(xì)胞免受傷害[21-22]。例如非生物脅迫條件下，超表達(dá)2-CysPrx基因提高了糙皮側(cè)耳抗高濃度H2O2、抗高溫和抗高滲透壓的能力，而2-CysPrx基因沉默導(dǎo)致H2O2大量積累，降低對(duì)非生物逆境脅迫敏感性。2-CysPrx基因表達(dá)情況與生物體ROS的清除能力呈正相關(guān)，2-CysPrx基因可能是脅迫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)器[23-24]。在高羊茅(Festucaarundinacea)中轉(zhuǎn)入擬南芥2-CysPrx基因結(jié)果顯示，超表達(dá)Th2CysPrx可以有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS，進(jìn)而提高高羊茅對(duì)高溫脅迫和甲基紫精的脅迫耐受性[25]。因此，筆者推測(cè)Th2CysPrx基因是否也是通過清除脅迫后體內(nèi)代謝產(chǎn)生的大量ROS，從而在酵母細(xì)胞抵抗多種非生物脅迫耐受性中行使功能。

在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)與Th2CysPrx基因具有51.32%同源性的yPrxII基因的位點(diǎn)特異性誘變通過增強(qiáng)其分子伴侶或過氧化物酶功能來(lái)改善熱和氧化應(yīng)激耐受性[26]。與Th2CysPrx基因具有50.26%同源性的Tsa1p基因具有抗氧化和過早衰老的特性[27]。Th2CysPrx基因在兩種酵母同源基因突變體(TSA-B7和yPrxII基因的突變體)中表達(dá)是否會(huì)影響重組酵母的抗逆功能有待進(jìn)一步研究。

H2O2對(duì)細(xì)胞的作用存在一個(gè)劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，高劑量會(huì)損傷細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞凋零，低劑量會(huì)作為脅迫信號(hào)對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。例如0.5 mmol/L的H2O2可促進(jìn)貯存2年的水稻種子萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，提高水稻根系活力和葉綠素含量，促進(jìn)水稻根和幼芽的生長(zhǎng)。但是5 mmol/L的H2O2卻不利于水稻種子萌發(fā)、根系和幼芽的生長(zhǎng)[28]。本實(shí)驗(yàn)中，在NaCl、LiCl的脅迫下，過表達(dá)Th2CysPrx顯示出更高的細(xì)胞存活率，但在H2O2脅迫下細(xì)胞卻沒有顯示出更好的生長(zhǎng)。筆者推測(cè)這可能與H2O2濃度有關(guān)，可能是外源施加的H2O2量過高，導(dǎo)致酵母細(xì)胞受損甚至凋亡。進(jìn)而推測(cè)，在NaCl、LiCl脅迫中，過表達(dá)Th2CysPrx基因，除受到H2O2脅迫外，還可能存在離子脅迫和滲透脅迫，也可能存在其他作用機(jī)制。Th2CysPrx基因在檉柳非生物脅迫下的耐受機(jī)理將繼續(xù)探究。