銀杏胚乳不同發(fā)育時(shí)期生理代謝變化與其胚性感受態(tài)的相關(guān)性研究

馬娟娟, 吳琴霞, 陳 穎, 王瑞敏, 袁斌齡, 胡宇辰，曹福亮

(南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

銀杏(Ginkgobiloba)因集藥用、食用、觀賞、材用于一體而備受關(guān)注[1]。目前銀杏育苗方法仍為種子繁殖，其遺傳性狀易改變，使銀杏優(yōu)良品種的性狀難以維持，而良種是銀杏工業(yè)原料林高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)[2]。銀杏的嫁接、扦插、組織培養(yǎng)是獲得良種無(wú)性系的最佳方法，但嫁接和扦插繁殖系數(shù)低、周期長(zhǎng), 遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求[3]。因此在短期內(nèi)獲得大量的銀杏良種苗木，組織培養(yǎng)特別是體細(xì)胞胚發(fā)生(somatic embryogenesis，SE)培養(yǎng)技術(shù)是快速、省力、規(guī)模化繁育林木良種的最有效無(wú)性繁殖技術(shù)。體胚發(fā)生是植物外植體通過(guò)一種體外發(fā)育程序，將體細(xì)胞通過(guò)重新編程的方式沿著與有性合子胚發(fā)育相似的胚胎發(fā)生途徑形成體細(xì)胞胚的過(guò)程[4-7]。

體細(xì)胞胚的發(fā)生過(guò)程可分為3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的階段:誘導(dǎo)階段(胚性細(xì)胞的獲得)、胚性細(xì)胞增殖階段、體胚發(fā)育階段[8]。其中誘導(dǎo)階段是植物細(xì)胞感受外界的信號(hào)刺激(脅迫或外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)通過(guò)脫分化而獲得胚性，形成胚性細(xì)胞的過(guò)程。植物細(xì)胞或組織脫分化或去分化的能力稱為植物胚性感受態(tài)，它的高低直接決定了能否成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚及難易程度[4]。胚性感受態(tài)受外植體的分化狀態(tài)及外植體類型的影響較大，分化程度越低的細(xì)胞去分化能力越強(qiáng)，就越易形成胚性愈傷組織；外植體材料的基因型、發(fā)育階段以及生理狀態(tài)等決定了其胚性感受態(tài)的強(qiáng)弱[9-10]。研究表明，未成熟胚(合子胚的原胚)的胚性感受態(tài)明顯強(qiáng)于其他階段[11]。

目前全世界已有多種高等植物通過(guò)離體培養(yǎng)獲得體細(xì)胞胚，落葉松(Larixgmelinii)、火炬松(Pinustaeda)、雜交馬褂木(Liriodendronchinense×tulipifera)等林木成熟的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系已經(jīng)建立，實(shí)現(xiàn)了林木新品種的規(guī)?；庇?。但作為我國(guó)特有樹(shù)種的銀杏目前還沒(méi)有完全建立繁殖快、規(guī)模大、頻率高的體細(xì)胞再生體系，而誘導(dǎo)具有高度胚性發(fā)生能力的愈傷組織是建立銀杏體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系的第一步[11]。另外銀杏種子屬胚發(fā)育未完成型，成熟時(shí)(9月)胚還沒(méi)有完全形成，有的還沒(méi)有胚，而銀杏的胚乳從授粉后就開(kāi)始生長(zhǎng)，比胚發(fā)育周期早而持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是研究銀杏胚性愈傷誘導(dǎo)很好的材料。本研究以不同發(fā)育階段胚乳為材料，研究其各時(shí)期的生理生化狀態(tài)及其變化規(guī)律,同時(shí)以不同發(fā)育時(shí)期的胚乳為外植體, 進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo),研究銀杏胚乳發(fā)育狀態(tài)與其胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性, 篩選出具有較高胚性感受態(tài)的銀杏胚乳發(fā)育階段，為銀杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系技術(shù)的建立及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試果實(shí)采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)(118°49′E,32°04′N)同一地點(diǎn)、生長(zhǎng)良好的3棵20年生‘大佛指’銀杏樹(shù)。采種時(shí)期分別為6月10日、6月30日、7月20日、8月10日、8月17日、8月24日、8月31日、9月15日8個(gè)時(shí)間段(激素測(cè)定增加7月10日采種樣品)。采種后一部分果實(shí)放入-70 ℃超低溫冰箱中保存，并取胚乳(銀杏種子屬生理后熟型，在8月下旬種胚才開(kāi)始發(fā)育, 8月下旬—9月的樣品中去除胚)用于各類指標(biāo)測(cè)定，另一部分果實(shí)取胚乳立即用于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2 胚乳不同發(fā)育時(shí)期生理指標(biāo)測(cè)定

將上述8個(gè)時(shí)間段采摘的銀杏果實(shí)去除外種皮后，取出胚乳進(jìn)行生理生化分析。含水率、可溶性蛋白含量(考馬斯亮藍(lán)法)、過(guò)氧化物酶(POD)活性(愈創(chuàng)木酚比色法)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性(紫外吸收法)、超氧化物歧化酶(SOD)活性(NBT光化學(xué)還原法)的測(cè)定均參照文獻(xiàn)[12]方法，苯丙氨酸解氨酶(PAL)與總黃酮含量的測(cè)定參照鄧桂春等[13]的方法，4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)提取及活性測(cè)定參照何慕涵等[14]的方法，肉桂醇脫氫酶(CAD)活性的測(cè)定參照袁斌玲等[15]方法。

植物激素含量的測(cè)定：將9個(gè)時(shí)間段(增加了7月10日時(shí)間段)的銀杏果實(shí)去除外種皮后，取出胚乳并去除內(nèi)種皮(皮衣)，將種仁研磨成漿狀，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)、異戊烯基腺苷(iPA)、脫落酸(ABA)5種激素的含量[16](由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室協(xié)助測(cè)定)。

1.3 不同時(shí)期銀杏胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)

1.3.1 外植體消毒接種

6月10日采集的果實(shí)中還沒(méi)形成骨質(zhì)中種皮，因而對(duì)其整個(gè)果實(shí)進(jìn)行消毒，之后采集的果實(shí)都已形成骨質(zhì)中種皮，將果實(shí)中的外種皮去除后獲得銀杏種子(6月10日后果實(shí)都帶有骨質(zhì)中種皮，也稱為白果，去除骨質(zhì)中種皮和內(nèi)種皮后稱為種仁)，對(duì)種子進(jìn)行消毒。先用體積分?jǐn)?shù)70%酒精對(duì)種子浸泡60 s，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的高錳酸鉀溶液浸泡20 min，期間不斷攪拌，將消毒后的種子用無(wú)菌水沖洗3～4次，最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。接種時(shí)用高壓滅菌過(guò)的核桃?jiàn)A夾開(kāi)種子骨質(zhì)中種皮，取出種仁，將去除內(nèi)種皮后的種仁(6月10日—8月10日全部為胚乳，8月17日—9月15日部分含有胚)橫放在已滅菌的濾紙上，用不銹鋼刀切取種仁外層(胚乳)1～3 mm薄片，平放在培養(yǎng)基上，每瓶放置4片胚乳。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

①培養(yǎng)基的篩選：對(duì)同一時(shí)期(6月10日)的胚乳進(jìn)行基本培養(yǎng)基和調(diào)節(jié)劑的篩選。選用MS、DCR[17]為基本培養(yǎng)基，附加1.0、1.5 mg/L的萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，以及0.5、1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，共8個(gè)處理，每個(gè)處理6瓶，重復(fù)3次。②為研究銀杏胚乳誘導(dǎo)率與銀杏胚乳發(fā)育階段的相關(guān)性，利用篩選出的培養(yǎng)基(MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L BA)，對(duì)6月10日—9月15日8個(gè)時(shí)間段的胚乳進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及胚性感受態(tài)研究。每個(gè)時(shí)期接種8瓶，3次重復(fù)。此后每30 d繼代1次。

1.3.3 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

待上述培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)的外植體繼代2次后，用無(wú)菌刀片從帶胚乳切片上的愈傷組織輕輕切下每塊大約0.5 cm3的愈傷組織，接種到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。

1.3.4 愈傷組織生長(zhǎng)情況的測(cè)定

接種15 d后統(tǒng)計(jì)不同時(shí)期胚乳的污染率，污染率=污染的胚乳片數(shù)/接種的胚乳片數(shù)×100%。

在各個(gè)時(shí)期胚乳接種后2個(gè)月統(tǒng)計(jì)相對(duì)應(yīng)的愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的胚乳片數(shù)/接種的胚乳片數(shù)×100%。

1.3.5 培養(yǎng)條件

將接種過(guò)的培養(yǎng)瓶于室溫下暗培養(yǎng)15 d后再進(jìn)行15 d光培養(yǎng)，分別在接種后2個(gè)月統(tǒng)計(jì)各個(gè)時(shí)期胚乳作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率，以及胚性愈傷組織的統(tǒng)計(jì)。上述培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂6.0 g/L，pH調(diào)至5.8左右，培養(yǎng)室溫度(25±2)℃，光照周期為12 h/d，光照度為2 000 lx。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用Duncan新復(fù)極差法(P<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期銀杏果實(shí)及種仁生長(zhǎng)狀態(tài)的變化

在6月10日采摘的銀杏果實(shí)中未發(fā)現(xiàn)堅(jiān)硬狀態(tài)的中種皮(圖1)，整個(gè)種仁呈翠綠色狀態(tài)(圖1)，6月30日的果實(shí)中已形成堅(jiān)硬狀態(tài)的中種皮。在6月10日—8月31日，外種皮的變化較緩慢，先是顏色上慢慢從深綠往黃色轉(zhuǎn)變，外種皮軟硬程度變化也較小，直到8月31日外種皮開(kāi)始稍有變軟，此后到9月15日外種皮的變化較迅速，從黃綠色快速轉(zhuǎn)變?yōu)辄S棕色，同時(shí)外種皮皺縮并帶有白粉，且已產(chǎn)生濃重的氣味，說(shuō)明此時(shí)果實(shí)形態(tài)已完全成熟。去除外種皮和骨質(zhì)中種皮、內(nèi)種皮的種仁從6月10日的綠色到7月20日逐漸變?yōu)辄S綠色，且種仁大小不斷增加，硬度也更大。8月31日及9月15日的銀杏種仁外部形態(tài)已經(jīng)成熟，顏色變成黃色，硬度達(dá)到最大且種仁大小基本長(zhǎng)到最大(圖2)。

2.2 不同時(shí)期銀杏胚乳含水率和可溶性蛋白含量的變化

種子內(nèi)胚乳含水率的變化如圖3所示，含水率總體呈先下降后保持穩(wěn)定的狀態(tài)，在6月10日時(shí)，胚乳含水率處于最高值，到6月30日開(kāi)始下降，8月10日后一直到8月17日胚乳含水率處于穩(wěn)定狀態(tài)，8月10日種仁含水率與7月20日之前存在顯著差異(P<0.05)。

可溶性蛋白含量整體呈先上升后下降的狀態(tài)，6月10日胚乳可溶性蛋白的含量處于最低值，之后持續(xù)增長(zhǎng)，其中7月20日至8月31日可溶性蛋白含量逐漸增加，到8月31日達(dá)到最大值；之后可溶性蛋白含量開(kāi)始下降，9月15日的顯著低于8月31日的(圖3)。

2.3 不同時(shí)期銀杏胚乳抗氧化酶活性的變化

不同時(shí)期銀杏胚乳抗氧化酶活性變化見(jiàn)圖4。

超氧化物歧化酶(SOD)活性在前期胚乳中隨著采種日期的延后先上升后下降，后期SOD活性處于穩(wěn)定狀態(tài)。6月30日SOD活性顯著高于6月10日(P<0.05)，并達(dá)到最大值；隨后SOD活性持續(xù)下降，在8月17日下降到最低值，比6月30日最大值低68.6%。此后直到9月15日，胚乳中SOD活性變化不大。過(guò)氧化物酶(POD)活性的變化在前期處于低活性狀態(tài)，在6月30日—7月20日有個(gè)低水平時(shí)期，8月10日顯著升高后，該水平一直維持到8月31日，期間變化不大，但到9月15日時(shí)POD活性又顯著升高，比8月31日活性提高116.9%。胚乳過(guò)氧化氫酶(CAT)活性整體處于先下降后增加的趨勢(shì)，6月30日CAT活性顯著低于6月10日的活性，并下降至最低值，之后持續(xù)上升，到8月31日達(dá)到最大值，之后9月15日POD活性下降，顯著低于8月31日。

2.4 不同時(shí)期銀杏胚乳黃酮合成關(guān)鍵酶活性及總黃酮含量的變化

不同時(shí)期銀杏胚乳黃酮合成關(guān)鍵酶活性及總黃酮含量的變化見(jiàn)圖5。不同發(fā)育時(shí)期的胚乳中PAL活性在6月10日至8月31日期間處于持續(xù)上升狀態(tài)，在8月31日達(dá)到最大值，比最初期6月10日提高了2.16倍。8月31日之后活性又開(kāi)始下降，9月15日PAL活性顯著低于8月31日活性。胚乳的4CL活性和CAD活性變化相似，在整個(gè)測(cè)定階段都趨于穩(wěn)定狀態(tài)，變化不顯著。胚乳總黃酮含量隨時(shí)間的變化先下降后上升，在7月20日達(dá)到最低點(diǎn)后，在8月10日—9月15日緩慢上升，在9月15日達(dá)到最大值，比最低點(diǎn)7月20日提高了59.2%。

2.5 不同時(shí)期銀杏胚乳中5種激素含量的變化

胚乳IAA含量隨時(shí)間變化如圖6所示，6月10日IAA處于較低水平，然后上升，6月30日—8月10日維持6月30日的水平，變化不大。8月17日有所降低，然后8月24日又回升，一直維持到9月15日。GA的水平出現(xiàn)波動(dòng)式變化，在6月10日—7月10日緩慢上升，然后急劇上升到7月20日的高點(diǎn)，隨后又開(kāi)始下降，在8月10日—8月17日處于較低水平，8月24日出現(xiàn)第2個(gè)高點(diǎn)后又逐漸下降并維持到9月15日。

ZR也出現(xiàn)波動(dòng)式變化，6月10日—7月10日呈上升趨勢(shì)，在7月10日達(dá)到最高點(diǎn)，7月20日后開(kāi)始下降，并維持此水平至8月24日，然后下降到8月31日并維持到9月15日。iPA的變化是在7月20日之前都處于高水平狀態(tài)，然后下降到8月10日最低點(diǎn)，在8月17日有所上升，但低于7月20日之前的水平，8月17日—9月15日維持穩(wěn)定的水平。ABA的含量6月10日開(kāi)始上升至7月20日達(dá)到最高點(diǎn)，8月10日稍有下降，該水平一直維持到8月24日，8月31日—9月15日又出現(xiàn)顯著下降，8月31日時(shí)的ABA含量比最高點(diǎn)7月10日下降41.5%。

從IAA與ABA質(zhì)量比(記為IAA/ABA)來(lái)看，6月30日、8月31日 和9月15日3個(gè)時(shí)期都處于高水平，與其他時(shí)期有顯著的差異，6月30日為最高點(diǎn)，其他時(shí)期6月10日、7月10日、8月10日—8月24日3個(gè)時(shí)期處于中等水平，7月20日處于最低的水平，但與7月10日、8月10、8月17日、8月24日都沒(méi)有顯著差異(圖6)。

(ZR+iPA)與ABA的質(zhì)量比[記為(ZR+iPA)/ABA]與IAA/ABA有所不同，6月10日—8月10日呈逐漸下降趨勢(shì)，到8月10日達(dá)到最低點(diǎn)，然后8月17日逐漸回升至8月31日，此時(shí)的(ZR+iPA)/ABA與7月10日的水平無(wú)顯著差異，9月15日稍有下降與8月24日持平(圖6)。

2.6 不同時(shí)期銀杏胚乳組織培養(yǎng)污染率與愈傷組織誘導(dǎo)率的變化

選擇6月10日取材的銀杏胚乳用于培養(yǎng)基的篩選。從表1可以看出，基本培養(yǎng)基類型、調(diào)節(jié)劑組合影響胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)率。從8個(gè)處理中可以看出，銀杏胚乳在MS+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L BA的配方中愈傷組織誘導(dǎo)率最高，但其誘導(dǎo)出的愈傷組織較容易褐化。而MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L BA既具有較高水平的愈傷組織誘導(dǎo)率，又有較低的褐化率，選用此配方較好(表1)。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)銀杏胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

對(duì)上述8個(gè)時(shí)間段各自的胚乳同時(shí)在MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L BA培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期外植體污染率存在較大差異。出現(xiàn)較高污染率的時(shí)間段主要集中在8月，其4個(gè)時(shí)間段的污染率為6.25%～11.46%，差別不大。而6、7和9月外植體污染率水平較低(表2)。

光照培養(yǎng)下，胚乳切片接種后，其表面先慢慢失水，表皮顏色逐漸加深變成褐色，接種后30 d左右褐色的胚乳表皮切口邊緣處逐漸有愈傷組織誘導(dǎo)出來(lái)。繼代后60 d時(shí)統(tǒng)計(jì)，不同發(fā)育時(shí)間段的胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)率出現(xiàn)較大差異。在6月10日時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率處于一個(gè)較高的水平，但此后出現(xiàn)較大幅度的下降，在6月30日、7月20日誘導(dǎo)率處于較低的水平，7月20日的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為6月10日的43.57%。但從8月10日開(kāi)始，愈傷組織誘導(dǎo)率開(kāi)始迅速上升，8月24日—9月15日愈傷組織誘導(dǎo)率均在88%以上(表2)。

表2 8個(gè)時(shí)間段銀杏胚乳外植體組織培養(yǎng)污染率與愈傷組織誘導(dǎo)率的變化

2.7 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)

將初誘導(dǎo)60 d后的愈傷組織從原胚乳切片上取下，轉(zhuǎn)接到MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA +0.25 g/L MES+0.2g/L谷氨酸的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在繼代第4次后各個(gè)時(shí)期胚乳所培養(yǎng)的愈傷組織差別明顯。6月10日的胚乳培養(yǎng)4周后逐漸從切口處出現(xiàn)較多的白色或者淡綠色結(jié)構(gòu)較為松散的非胚性愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)后易褐化死亡。6月30日的胚乳接種情況和7月20日基本相同，愈傷組織誘導(dǎo)率較低，在培養(yǎng)過(guò)程中也出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖7A—7D)。8月17日—9月15日的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率較高(圖7E—7H)，且繼代培養(yǎng)4次后，逐漸形成黃白色、結(jié)構(gòu)較為緊密、表面呈顆粒狀的胚性愈傷組織，在體視顯微鏡下可觀察到愈傷組織中許多晶瑩透亮的圓球體。此階段是胚性愈傷組織發(fā)生率最高的時(shí)期。

3 討 論

3.1 銀杏胚乳不同發(fā)育時(shí)期與胚性感受態(tài)的關(guān)系

與被子植物不同, 裸子植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)對(duì)外植體的要求更加嚴(yán)格,誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最合適外植體可能因物種而異[18]。以胚性感受態(tài)較高的幼胚為外植體進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，幼胚胚性感受態(tài)需在特定條件下才能被激活的現(xiàn)象與植物幼胚體內(nèi)的生理狀態(tài)密切相關(guān)[19]。胚性感受態(tài)的高低直接決定了植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的難易程度[20]。因此探究外植體胚性感受態(tài)的高低變得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率分為3個(gè)階段：第1個(gè)階段為6月10日—6月30日，銀杏早期未成熟狀胚乳，易誘導(dǎo)出愈傷組織，胚乳的愈傷誘導(dǎo)率高；第2階段為胚乳發(fā)育的中期，6月30日—8月10 日，此時(shí)胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率比6月10日、8月17日后都低，并伴有一定程度的褐化；第3階段為胚乳發(fā)育后期，8月17日—9月15日，愈傷組織誘導(dǎo)率提高，愈傷組織多黃白色，表面具球形小顆粒的胚性愈傷組織團(tuán)。早期的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率高，其原因可能是此時(shí)有較高的水分含量(6月10日左右)，種子正處于旺盛的生長(zhǎng)階段，細(xì)胞生理代謝旺盛，但發(fā)現(xiàn)此時(shí)愈傷組織的形成是整個(gè)胚乳切片的愈傷化而成，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，為非胚性愈傷組織，不易成團(tuán)，繼續(xù)培養(yǎng)后愈傷組織已褐化死亡。中期的胚乳(6月30日—8月10 日)愈傷組織誘導(dǎo)率比早期和后期的都低，后期愈傷組織也有一定程度的褐化，但也能誘導(dǎo)出顆粒狀的胚性愈傷組織。其可能的原因是此時(shí)正是種子外種皮形成的時(shí)期，其含水量開(kāi)始下降，而蛋白質(zhì)開(kāi)始上升。到8月中旬后，銀杏種子生長(zhǎng)趨于緩慢，胚乳趨于成熟，其含水量下降并保持一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，有利于胚性愈傷組織的形成。另外8月10日后胚乳可溶性蛋白含量處于一個(gè)上升的過(guò)程，呂雪芹等[21]通過(guò)對(duì)不同時(shí)期銀杏胚乳可溶性蛋白含量的測(cè)定也得出相同的結(jié)果。胚乳中積累一定含量的可溶性蛋白能提高胚乳的胚性感受態(tài)，有利于誘導(dǎo)胚性愈傷組織的形成。因此，胚乳不同發(fā)育時(shí)期胚性感受態(tài)強(qiáng)弱和胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力的排列順序?yàn)椋旱?階段>第2階段>第1階段。

3.2 胚乳發(fā)育過(guò)程中3種抗氧化酶與胚性感受態(tài)的關(guān)系

外植體抗氧化酶活性的變化與外植體細(xì)胞的分化有直接的關(guān)系[22]。本研究中胚乳發(fā)育時(shí)期的抗氧化酶SOD、POD、CAT酶活性與胚乳愈傷組織誘導(dǎo)有較大相關(guān)性。早期(6月10日—6月30日)胚乳的SOD酶具有較高活性，而POD 和CAT 的活性較低，SOD活性在6月30日達(dá)到最大值，然后到7月20日下降至最低，而7月20日之后POD和CAT活性逐漸升高，在后期階段(8月10日—9月15日)胚乳POD和CAT處于高活性水平。這表明胚乳在生長(zhǎng)前期需要大量的能量，從而產(chǎn)生較高的線粒體活性以及過(guò)氧化物[23]。前期高水平的SOD酶活性可能是由于此時(shí)隨著外界溫度和光照的增加，銀杏果實(shí)快速生長(zhǎng)，但也會(huì)由于溫度和光照增加產(chǎn)生較多的超氧自由基，SOD 酶活性較高有利于將其清除。在后期胚乳含水量降低，環(huán)境脅迫加強(qiáng)，通過(guò)POD和CAT活性逐漸升高以清除前期產(chǎn)生的H2O2，另外一定的環(huán)境脅迫可提高胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)，且多為顆粒狀的胚性愈傷組織，說(shuō)明后期高活性的POD和CAT有利于外植體胚性感受態(tài)的升高。

3.3 胚乳發(fā)育過(guò)程中黃酮變化與胚性感受態(tài)關(guān)系

黃酮是銀杏植株內(nèi)一種重要的多酚類次生代謝物，對(duì)增強(qiáng)植物抗逆性有較大的作用，有很強(qiáng)的生物活性[24-25]。本研究中胚乳發(fā)育的過(guò)程中，與黃酮代謝相關(guān)的酶4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶)和CAD(肉桂醇脫氫酶)活性變化較小，不同階段間差距不大。因此，胚乳中黃酮的積累主要是PAL(苯丙氨酸解氨酶)在起主要作用，高PAL活性有利于黃酮的積累。而中期(6月30日—7月20日)的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率低可能是因?yàn)榭傸S酮含量處于較低水平。后期(8月31日—9月15日)的總黃酮含量達(dá)到高峰值，此時(shí)的胚乳愈傷誘導(dǎo)率較高，且愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)較好，已形成胚性愈傷組織，由此可見(jiàn)，高的黃酮含量也是銀杏胚乳具有較高胚性感受態(tài)的一個(gè)因素。

3.4 胚乳發(fā)育過(guò)程中5種激素含量變化及其比值與胚性感受態(tài)的關(guān)系

植物的內(nèi)源激素是影響組織胚性感受態(tài)的最重要因素之一[26]。許多學(xué)者研究表明，在植物離體細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，生長(zhǎng)素起重要作用，比如啟動(dòng)細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)胚性潛力，從而促進(jìn)外植體早期發(fā)育[27]。本研究中，6月10日的胚乳IAA含量最低，其余各發(fā)育時(shí)期基本維持在較高水平。從各時(shí)期胚乳誘導(dǎo)愈傷組織的情況來(lái)看，高水平的IAA對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有重要意義。GA含量在前至中期一直較高，8月31日之后處于較低水平，此時(shí)胚乳最易誘導(dǎo)胚性愈傷，推測(cè)高含量GA3可能不利于胚性細(xì)胞的產(chǎn)生, 這與多數(shù)植物體胚的研究結(jié)果[28]類似。ZR和iPA含量的變化趨勢(shì)較為相似，中期(6月30日—7月20日)的含量較高，這個(gè)階段內(nèi)的胚乳愈傷組織率較低；而8月之后這兩種激素水平都較低，愈傷誘導(dǎo)情況較好，說(shuō)明低濃度的ZR和iPA更有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。ABA的含量在6—9月呈先上升后下降的趨勢(shì)，從各時(shí)期胚乳誘導(dǎo)愈傷組織的情況推測(cè)，胚性愈傷組織的發(fā)生需要較低水平的ABA。

郭玉瓊等[29]認(rèn)為植物內(nèi)源激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用不僅與各種內(nèi)源激素的含量有關(guān)，而且與各類激素在植物體內(nèi)的相互平衡有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率及胚乳的胚性感受態(tài)更受IAA/ABA與(ZR+iPA)/ABA的調(diào)控。IAA/ABA在早期處于高水平，而中期(6月30日—7月20日)處于低水平，后期(8月10日—9月15日)又處于高水平，與胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率成正相關(guān)。而(ZR+iPA)/ABA在早期至中期處于高水平，后期(8月10日之后)處于低水平，有利于胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)。

綜上所述，銀杏胚乳的發(fā)育狀態(tài)與其愈傷組織誘導(dǎo)和胚性愈傷組織形成具有較強(qiáng)的相關(guān)性，較高的POD、CAT活性、黃酮含量、IAA/ABA，及較低(ZR+iPA)/ABA是銀杏胚乳誘導(dǎo)胚性愈傷組織必需的條件。8月17日—9月15日是銀杏誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳時(shí)期，特別7月20日—9月15日是胚乳較高的胚性感受態(tài)時(shí)期。銀杏胚乳發(fā)育過(guò)程及其與胚性愈傷組織的關(guān)聯(lián)性機(jī)制還需進(jìn)一步研究。