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    銀杏胚乳不同發(fā)育時期生理代謝變化與其胚性感受態(tài)的相關(guān)性研究

    2022-11-29 11:51:32馬娟娟吳琴霞王瑞敏袁斌齡胡宇辰曹福亮

    馬娟娟, 吳琴霞, 陳 穎, 王瑞敏, 袁斌齡, 胡宇辰,曹福亮

    (南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院,南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)

    銀杏(Ginkgobiloba)因集藥用、食用、觀賞、材用于一體而備受關(guān)注[1]。目前銀杏育苗方法仍為種子繁殖,其遺傳性狀易改變,使銀杏優(yōu)良品種的性狀難以維持,而良種是銀杏工業(yè)原料林高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)[2]。銀杏的嫁接、扦插、組織培養(yǎng)是獲得良種無性系的最佳方法,但嫁接和扦插繁殖系數(shù)低、周期長, 遠(yuǎn)不能滿足市場的需求[3]。因此在短期內(nèi)獲得大量的銀杏良種苗木,組織培養(yǎng)特別是體細(xì)胞胚發(fā)生(somatic embryogenesis,SE)培養(yǎng)技術(shù)是快速、省力、規(guī)?;庇帜玖挤N的最有效無性繁殖技術(shù)。體胚發(fā)生是植物外植體通過一種體外發(fā)育程序,將體細(xì)胞通過重新編程的方式沿著與有性合子胚發(fā)育相似的胚胎發(fā)生途徑形成體細(xì)胞胚的過程[4-7]。

    體細(xì)胞胚的發(fā)生過程可分為3個相對獨(dú)立的階段:誘導(dǎo)階段(胚性細(xì)胞的獲得)、胚性細(xì)胞增殖階段、體胚發(fā)育階段[8]。其中誘導(dǎo)階段是植物細(xì)胞感受外界的信號刺激(脅迫或外源植物生長調(diào)節(jié)劑)通過脫分化而獲得胚性,形成胚性細(xì)胞的過程。植物細(xì)胞或組織脫分化或去分化的能力稱為植物胚性感受態(tài),它的高低直接決定了能否成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚及難易程度[4]。胚性感受態(tài)受外植體的分化狀態(tài)及外植體類型的影響較大,分化程度越低的細(xì)胞去分化能力越強(qiáng),就越易形成胚性愈傷組織;外植體材料的基因型、發(fā)育階段以及生理狀態(tài)等決定了其胚性感受態(tài)的強(qiáng)弱[9-10]。研究表明,未成熟胚(合子胚的原胚)的胚性感受態(tài)明顯強(qiáng)于其他階段[11]。

    目前全世界已有多種高等植物通過離體培養(yǎng)獲得體細(xì)胞胚,落葉松(Larixgmelinii)、火炬松(Pinustaeda)、雜交馬褂木(Liriodendronchinense×tulipifera)等林木成熟的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系已經(jīng)建立,實(shí)現(xiàn)了林木新品種的規(guī)?;庇?。但作為我國特有樹種的銀杏目前還沒有完全建立繁殖快、規(guī)模大、頻率高的體細(xì)胞再生體系,而誘導(dǎo)具有高度胚性發(fā)生能力的愈傷組織是建立銀杏體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系的第一步[11]。另外銀杏種子屬胚發(fā)育未完成型,成熟時(9月)胚還沒有完全形成,有的還沒有胚,而銀杏的胚乳從授粉后就開始生長,比胚發(fā)育周期早而持續(xù)時間長,是研究銀杏胚性愈傷誘導(dǎo)很好的材料。本研究以不同發(fā)育階段胚乳為材料,研究其各時期的生理生化狀態(tài)及其變化規(guī)律,同時以不同發(fā)育時期的胚乳為外植體, 進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo),研究銀杏胚乳發(fā)育狀態(tài)與其胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性, 篩選出具有較高胚性感受態(tài)的銀杏胚乳發(fā)育階段,為銀杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系技術(shù)的建立及應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試果實(shí)采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)(118°49′E,32°04′N)同一地點(diǎn)、生長良好的3棵20年生‘大佛指’銀杏樹。采種時期分別為6月10日、6月30日、7月20日、8月10日、8月17日、8月24日、8月31日、9月15日8個時間段(激素測定增加7月10日采種樣品)。采種后一部分果實(shí)放入-70 ℃超低溫冰箱中保存,并取胚乳(銀杏種子屬生理后熟型,在8月下旬種胚才開始發(fā)育, 8月下旬—9月的樣品中去除胚)用于各類指標(biāo)測定,另一部分果實(shí)取胚乳立即用于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

    1.2 胚乳不同發(fā)育時期生理指標(biāo)測定

    將上述8個時間段采摘的銀杏果實(shí)去除外種皮后,取出胚乳進(jìn)行生理生化分析。含水率、可溶性蛋白含量(考馬斯亮藍(lán)法)、過氧化物酶(POD)活性(愈創(chuàng)木酚比色法)、過氧化氫酶(CAT)活性(紫外吸收法)、超氧化物歧化酶(SOD)活性(NBT光化學(xué)還原法)的測定均參照文獻(xiàn)[12]方法,苯丙氨酸解氨酶(PAL)與總黃酮含量的測定參照鄧桂春等[13]的方法,4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)提取及活性測定參照何慕涵等[14]的方法,肉桂醇脫氫酶(CAD)活性的測定參照袁斌玲等[15]方法。

    植物激素含量的測定:將9個時間段(增加了7月10日時間段)的銀杏果實(shí)去除外種皮后,取出胚乳并去除內(nèi)種皮(皮衣),將種仁研磨成漿狀,采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)、異戊烯基腺苷(iPA)、脫落酸(ABA)5種激素的含量[16](由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室協(xié)助測定)。

    1.3 不同時期銀杏胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)

    1.3.1 外植體消毒接種

    6月10日采集的果實(shí)中還沒形成骨質(zhì)中種皮,因而對其整個果實(shí)進(jìn)行消毒,之后采集的果實(shí)都已形成骨質(zhì)中種皮,將果實(shí)中的外種皮去除后獲得銀杏種子(6月10日后果實(shí)都帶有骨質(zhì)中種皮,也稱為白果,去除骨質(zhì)中種皮和內(nèi)種皮后稱為種仁),對種子進(jìn)行消毒。先用體積分?jǐn)?shù)70%酒精對種子浸泡60 s,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的高錳酸鉀溶液浸泡20 min,期間不斷攪拌,將消毒后的種子用無菌水沖洗3~4次,最后用無菌濾紙吸干表面水分。接種時用高壓滅菌過的核桃夾夾開種子骨質(zhì)中種皮,取出種仁,將去除內(nèi)種皮后的種仁(6月10日—8月10日全部為胚乳,8月17日—9月15日部分含有胚)橫放在已滅菌的濾紙上,用不銹鋼刀切取種仁外層(胚乳)1~3 mm薄片,平放在培養(yǎng)基上,每瓶放置4片胚乳。

    1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

    ①培養(yǎng)基的篩選:對同一時期(6月10日)的胚乳進(jìn)行基本培養(yǎng)基和調(diào)節(jié)劑的篩選。選用MS、DCR[17]為基本培養(yǎng)基,附加1.0、1.5 mg/L的萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D),以及0.5、1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA),進(jìn)行正交設(shè)計(jì),共8個處理,每個處理6瓶,重復(fù)3次。②為研究銀杏胚乳誘導(dǎo)率與銀杏胚乳發(fā)育階段的相關(guān)性,利用篩選出的培養(yǎng)基(MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L BA),對6月10日—9月15日8個時間段的胚乳進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及胚性感受態(tài)研究。每個時期接種8瓶,3次重復(fù)。此后每30 d繼代1次。

    1.3.3 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

    待上述培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)的外植體繼代2次后,用無菌刀片從帶胚乳切片上的愈傷組織輕輕切下每塊大約0.5 cm3的愈傷組織,接種到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。

    1.3.4 愈傷組織生長情況的測定

    接種15 d后統(tǒng)計(jì)不同時期胚乳的污染率,污染率=污染的胚乳片數(shù)/接種的胚乳片數(shù)×100%。

    在各個時期胚乳接種后2個月統(tǒng)計(jì)相對應(yīng)的愈傷組織誘導(dǎo)率。

    愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的胚乳片數(shù)/接種的胚乳片數(shù)×100%。

    1.3.5 培養(yǎng)條件

    將接種過的培養(yǎng)瓶于室溫下暗培養(yǎng)15 d后再進(jìn)行15 d光培養(yǎng),分別在接種后2個月統(tǒng)計(jì)各個時期胚乳作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率,以及胚性愈傷組織的統(tǒng)計(jì)。上述培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂6.0 g/L,pH調(diào)至5.8左右,培養(yǎng)室溫度(25±2)℃,光照周期為12 h/d,光照度為2 000 lx。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,方差分析采用Duncan新復(fù)極差法(P<0.05為差異顯著)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同時期銀杏果實(shí)及種仁生長狀態(tài)的變化

    在6月10日采摘的銀杏果實(shí)中未發(fā)現(xiàn)堅(jiān)硬狀態(tài)的中種皮(圖1),整個種仁呈翠綠色狀態(tài)(圖1),6月30日的果實(shí)中已形成堅(jiān)硬狀態(tài)的中種皮。在6月10日—8月31日,外種皮的變化較緩慢,先是顏色上慢慢從深綠往黃色轉(zhuǎn)變,外種皮軟硬程度變化也較小,直到8月31日外種皮開始稍有變軟,此后到9月15日外種皮的變化較迅速,從黃綠色快速轉(zhuǎn)變?yōu)辄S棕色,同時外種皮皺縮并帶有白粉,且已產(chǎn)生濃重的氣味,說明此時果實(shí)形態(tài)已完全成熟。去除外種皮和骨質(zhì)中種皮、內(nèi)種皮的種仁從6月10日的綠色到7月20日逐漸變?yōu)辄S綠色,且種仁大小不斷增加,硬度也更大。8月31日及9月15日的銀杏種仁外部形態(tài)已經(jīng)成熟,顏色變成黃色,硬度達(dá)到最大且種仁大小基本長到最大(圖2)。

    2.2 不同時期銀杏胚乳含水率和可溶性蛋白含量的變化

    種子內(nèi)胚乳含水率的變化如圖3所示,含水率總體呈先下降后保持穩(wěn)定的狀態(tài),在6月10日時,胚乳含水率處于最高值,到6月30日開始下降,8月10日后一直到8月17日胚乳含水率處于穩(wěn)定狀態(tài),8月10日種仁含水率與7月20日之前存在顯著差異(P<0.05)。

    可溶性蛋白含量整體呈先上升后下降的狀態(tài),6月10日胚乳可溶性蛋白的含量處于最低值,之后持續(xù)增長,其中7月20日至8月31日可溶性蛋白含量逐漸增加,到8月31日達(dá)到最大值;之后可溶性蛋白含量開始下降,9月15日的顯著低于8月31日的(圖3)。

    2.3 不同時期銀杏胚乳抗氧化酶活性的變化

    不同時期銀杏胚乳抗氧化酶活性變化見圖4。

    超氧化物歧化酶(SOD)活性在前期胚乳中隨著采種日期的延后先上升后下降,后期SOD活性處于穩(wěn)定狀態(tài)。6月30日SOD活性顯著高于6月10日(P<0.05),并達(dá)到最大值;隨后SOD活性持續(xù)下降,在8月17日下降到最低值,比6月30日最大值低68.6%。此后直到9月15日,胚乳中SOD活性變化不大。過氧化物酶(POD)活性的變化在前期處于低活性狀態(tài),在6月30日—7月20日有個低水平時期,8月10日顯著升高后,該水平一直維持到8月31日,期間變化不大,但到9月15日時POD活性又顯著升高,比8月31日活性提高116.9%。胚乳過氧化氫酶(CAT)活性整體處于先下降后增加的趨勢,6月30日CAT活性顯著低于6月10日的活性,并下降至最低值,之后持續(xù)上升,到8月31日達(dá)到最大值,之后9月15日POD活性下降,顯著低于8月31日。

    2.4 不同時期銀杏胚乳黃酮合成關(guān)鍵酶活性及總黃酮含量的變化

    不同時期銀杏胚乳黃酮合成關(guān)鍵酶活性及總黃酮含量的變化見圖5。不同發(fā)育時期的胚乳中PAL活性在6月10日至8月31日期間處于持續(xù)上升狀態(tài),在8月31日達(dá)到最大值,比最初期6月10日提高了2.16倍。8月31日之后活性又開始下降,9月15日PAL活性顯著低于8月31日活性。胚乳的4CL活性和CAD活性變化相似,在整個測定階段都趨于穩(wěn)定狀態(tài),變化不顯著。胚乳總黃酮含量隨時間的變化先下降后上升,在7月20日達(dá)到最低點(diǎn)后,在8月10日—9月15日緩慢上升,在9月15日達(dá)到最大值,比最低點(diǎn)7月20日提高了59.2%。

    2.5 不同時期銀杏胚乳中5種激素含量的變化

    胚乳IAA含量隨時間變化如圖6所示,6月10日IAA處于較低水平,然后上升,6月30日—8月10日維持6月30日的水平,變化不大。8月17日有所降低,然后8月24日又回升,一直維持到9月15日。GA的水平出現(xiàn)波動式變化,在6月10日—7月10日緩慢上升,然后急劇上升到7月20日的高點(diǎn),隨后又開始下降,在8月10日—8月17日處于較低水平,8月24日出現(xiàn)第2個高點(diǎn)后又逐漸下降并維持到9月15日。

    ZR也出現(xiàn)波動式變化,6月10日—7月10日呈上升趨勢,在7月10日達(dá)到最高點(diǎn),7月20日后開始下降,并維持此水平至8月24日,然后下降到8月31日并維持到9月15日。iPA的變化是在7月20日之前都處于高水平狀態(tài),然后下降到8月10日最低點(diǎn),在8月17日有所上升,但低于7月20日之前的水平,8月17日—9月15日維持穩(wěn)定的水平。ABA的含量6月10日開始上升至7月20日達(dá)到最高點(diǎn),8月10日稍有下降,該水平一直維持到8月24日,8月31日—9月15日又出現(xiàn)顯著下降,8月31日時的ABA含量比最高點(diǎn)7月10日下降41.5%。

    從IAA與ABA質(zhì)量比(記為IAA/ABA)來看,6月30日、8月31日 和9月15日3個時期都處于高水平,與其他時期有顯著的差異,6月30日為最高點(diǎn),其他時期6月10日、7月10日、8月10日—8月24日3個時期處于中等水平,7月20日處于最低的水平,但與7月10日、8月10、8月17日、8月24日都沒有顯著差異(圖6)。

    (ZR+iPA)與ABA的質(zhì)量比[記為(ZR+iPA)/ABA]與IAA/ABA有所不同,6月10日—8月10日呈逐漸下降趨勢,到8月10日達(dá)到最低點(diǎn),然后8月17日逐漸回升至8月31日,此時的(ZR+iPA)/ABA與7月10日的水平無顯著差異,9月15日稍有下降與8月24日持平(圖6)。

    2.6 不同時期銀杏胚乳組織培養(yǎng)污染率與愈傷組織誘導(dǎo)率的變化

    選擇6月10日取材的銀杏胚乳用于培養(yǎng)基的篩選。從表1可以看出,基本培養(yǎng)基類型、調(diào)節(jié)劑組合影響胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)率。從8個處理中可以看出,銀杏胚乳在MS+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L BA的配方中愈傷組織誘導(dǎo)率最高,但其誘導(dǎo)出的愈傷組織較容易褐化。而MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L BA既具有較高水平的愈傷組織誘導(dǎo)率,又有較低的褐化率,選用此配方較好(表1)。

    表1 不同培養(yǎng)基對銀杏胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

    對上述8個時間段各自的胚乳同時在MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L BA培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)不同時期外植體污染率存在較大差異。出現(xiàn)較高污染率的時間段主要集中在8月,其4個時間段的污染率為6.25%~11.46%,差別不大。而6、7和9月外植體污染率水平較低(表2)。

    光照培養(yǎng)下,胚乳切片接種后,其表面先慢慢失水,表皮顏色逐漸加深變成褐色,接種后30 d左右褐色的胚乳表皮切口邊緣處逐漸有愈傷組織誘導(dǎo)出來。繼代后60 d時統(tǒng)計(jì),不同發(fā)育時間段的胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)率出現(xiàn)較大差異。在6月10日時,愈傷組織誘導(dǎo)率處于一個較高的水平,但此后出現(xiàn)較大幅度的下降,在6月30日、7月20日誘導(dǎo)率處于較低的水平,7月20日的愈傷組織誘導(dǎo)率最低,僅為6月10日的43.57%。但從8月10日開始,愈傷組織誘導(dǎo)率開始迅速上升,8月24日—9月15日愈傷組織誘導(dǎo)率均在88%以上(表2)。

    表2 8個時間段銀杏胚乳外植體組織培養(yǎng)污染率與愈傷組織誘導(dǎo)率的變化

    2.7 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及生長

    將初誘導(dǎo)60 d后的愈傷組織從原胚乳切片上取下,轉(zhuǎn)接到MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA +0.25 g/L MES+0.2g/L谷氨酸的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,在繼代第4次后各個時期胚乳所培養(yǎng)的愈傷組織差別明顯。6月10日的胚乳培養(yǎng)4周后逐漸從切口處出現(xiàn)較多的白色或者淡綠色結(jié)構(gòu)較為松散的非胚性愈傷組織,繼續(xù)培養(yǎng)后易褐化死亡。6月30日的胚乳接種情況和7月20日基本相同,愈傷組織誘導(dǎo)率較低,在培養(yǎng)過程中也出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖7A—7D)。8月17日—9月15日的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率較高(圖7E—7H),且繼代培養(yǎng)4次后,逐漸形成黃白色、結(jié)構(gòu)較為緊密、表面呈顆粒狀的胚性愈傷組織,在體視顯微鏡下可觀察到愈傷組織中許多晶瑩透亮的圓球體。此階段是胚性愈傷組織發(fā)生率最高的時期。

    3 討 論

    3.1 銀杏胚乳不同發(fā)育時期與胚性感受態(tài)的關(guān)系

    與被子植物不同, 裸子植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)對外植體的要求更加嚴(yán)格,誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最合適外植體可能因物種而異[18]。以胚性感受態(tài)較高的幼胚為外植體進(jìn)行體胚誘導(dǎo),幼胚胚性感受態(tài)需在特定條件下才能被激活的現(xiàn)象與植物幼胚體內(nèi)的生理狀態(tài)密切相關(guān)[19]。胚性感受態(tài)的高低直接決定了植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的難易程度[20]。因此探究外植體胚性感受態(tài)的高低變得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率分為3個階段:第1個階段為6月10日—6月30日,銀杏早期未成熟狀胚乳,易誘導(dǎo)出愈傷組織,胚乳的愈傷誘導(dǎo)率高;第2階段為胚乳發(fā)育的中期,6月30日—8月10 日,此時胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率比6月10日、8月17日后都低,并伴有一定程度的褐化;第3階段為胚乳發(fā)育后期,8月17日—9月15日,愈傷組織誘導(dǎo)率提高,愈傷組織多黃白色,表面具球形小顆粒的胚性愈傷組織團(tuán)。早期的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率高,其原因可能是此時有較高的水分含量(6月10日左右),種子正處于旺盛的生長階段,細(xì)胞生理代謝旺盛,但發(fā)現(xiàn)此時愈傷組織的形成是整個胚乳切片的愈傷化而成,愈傷組織結(jié)構(gòu)松散,為非胚性愈傷組織,不易成團(tuán),繼續(xù)培養(yǎng)后愈傷組織已褐化死亡。中期的胚乳(6月30日—8月10 日)愈傷組織誘導(dǎo)率比早期和后期的都低,后期愈傷組織也有一定程度的褐化,但也能誘導(dǎo)出顆粒狀的胚性愈傷組織。其可能的原因是此時正是種子外種皮形成的時期,其含水量開始下降,而蛋白質(zhì)開始上升。到8月中旬后,銀杏種子生長趨于緩慢,胚乳趨于成熟,其含水量下降并保持一個穩(wěn)定的狀態(tài),有利于胚性愈傷組織的形成。另外8月10日后胚乳可溶性蛋白含量處于一個上升的過程,呂雪芹等[21]通過對不同時期銀杏胚乳可溶性蛋白含量的測定也得出相同的結(jié)果。胚乳中積累一定含量的可溶性蛋白能提高胚乳的胚性感受態(tài),有利于誘導(dǎo)胚性愈傷組織的形成。因此,胚乳不同發(fā)育時期胚性感受態(tài)強(qiáng)弱和胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力的排列順序?yàn)椋旱?階段>第2階段>第1階段。

    3.2 胚乳發(fā)育過程中3種抗氧化酶與胚性感受態(tài)的關(guān)系

    外植體抗氧化酶活性的變化與外植體細(xì)胞的分化有直接的關(guān)系[22]。本研究中胚乳發(fā)育時期的抗氧化酶SOD、POD、CAT酶活性與胚乳愈傷組織誘導(dǎo)有較大相關(guān)性。早期(6月10日—6月30日)胚乳的SOD酶具有較高活性,而POD 和CAT 的活性較低,SOD活性在6月30日達(dá)到最大值,然后到7月20日下降至最低,而7月20日之后POD和CAT活性逐漸升高,在后期階段(8月10日—9月15日)胚乳POD和CAT處于高活性水平。這表明胚乳在生長前期需要大量的能量,從而產(chǎn)生較高的線粒體活性以及過氧化物[23]。前期高水平的SOD酶活性可能是由于此時隨著外界溫度和光照的增加,銀杏果實(shí)快速生長,但也會由于溫度和光照增加產(chǎn)生較多的超氧自由基,SOD 酶活性較高有利于將其清除。在后期胚乳含水量降低,環(huán)境脅迫加強(qiáng),通過POD和CAT活性逐漸升高以清除前期產(chǎn)生的H2O2,另外一定的環(huán)境脅迫可提高胚乳愈傷組織的誘導(dǎo),且多為顆粒狀的胚性愈傷組織,說明后期高活性的POD和CAT有利于外植體胚性感受態(tài)的升高。

    3.3 胚乳發(fā)育過程中黃酮變化與胚性感受態(tài)關(guān)系

    黃酮是銀杏植株內(nèi)一種重要的多酚類次生代謝物,對增強(qiáng)植物抗逆性有較大的作用,有很強(qiáng)的生物活性[24-25]。本研究中胚乳發(fā)育的過程中,與黃酮代謝相關(guān)的酶4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶)和CAD(肉桂醇脫氫酶)活性變化較小,不同階段間差距不大。因此,胚乳中黃酮的積累主要是PAL(苯丙氨酸解氨酶)在起主要作用,高PAL活性有利于黃酮的積累。而中期(6月30日—7月20日)的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率低可能是因?yàn)榭傸S酮含量處于較低水平。后期(8月31日—9月15日)的總黃酮含量達(dá)到高峰值,此時的胚乳愈傷誘導(dǎo)率較高,且愈傷組織生長狀態(tài)較好,已形成胚性愈傷組織,由此可見,高的黃酮含量也是銀杏胚乳具有較高胚性感受態(tài)的一個因素。

    3.4 胚乳發(fā)育過程中5種激素含量變化及其比值與胚性感受態(tài)的關(guān)系

    植物的內(nèi)源激素是影響組織胚性感受態(tài)的最重要因素之一[26]。許多學(xué)者研究表明,在植物離體細(xì)胞發(fā)育過程中,生長素起重要作用,比如啟動細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)胚性潛力,從而促進(jìn)外植體早期發(fā)育[27]。本研究中,6月10日的胚乳IAA含量最低,其余各發(fā)育時期基本維持在較高水平。從各時期胚乳誘導(dǎo)愈傷組織的情況來看,高水平的IAA對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有重要意義。GA含量在前至中期一直較高,8月31日之后處于較低水平,此時胚乳最易誘導(dǎo)胚性愈傷,推測高含量GA3可能不利于胚性細(xì)胞的產(chǎn)生, 這與多數(shù)植物體胚的研究結(jié)果[28]類似。ZR和iPA含量的變化趨勢較為相似,中期(6月30日—7月20日)的含量較高,這個階段內(nèi)的胚乳愈傷組織率較低;而8月之后這兩種激素水平都較低,愈傷誘導(dǎo)情況較好,說明低濃度的ZR和iPA更有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。ABA的含量在6—9月呈先上升后下降的趨勢,從各時期胚乳誘導(dǎo)愈傷組織的情況推測,胚性愈傷組織的發(fā)生需要較低水平的ABA。

    郭玉瓊等[29]認(rèn)為植物內(nèi)源激素對植物生長發(fā)育的調(diào)控作用不僅與各種內(nèi)源激素的含量有關(guān),而且與各類激素在植物體內(nèi)的相互平衡有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率及胚乳的胚性感受態(tài)更受IAA/ABA與(ZR+iPA)/ABA的調(diào)控。IAA/ABA在早期處于高水平,而中期(6月30日—7月20日)處于低水平,后期(8月10日—9月15日)又處于高水平,與胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率成正相關(guān)。而(ZR+iPA)/ABA在早期至中期處于高水平,后期(8月10日之后)處于低水平,有利于胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)。

    綜上所述,銀杏胚乳的發(fā)育狀態(tài)與其愈傷組織誘導(dǎo)和胚性愈傷組織形成具有較強(qiáng)的相關(guān)性,較高的POD、CAT活性、黃酮含量、IAA/ABA,及較低(ZR+iPA)/ABA是銀杏胚乳誘導(dǎo)胚性愈傷組織必需的條件。8月17日—9月15日是銀杏誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳時期,特別7月20日—9月15日是胚乳較高的胚性感受態(tài)時期。銀杏胚乳發(fā)育過程及其與胚性愈傷組織的關(guān)聯(lián)性機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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